細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程及注意事項(xiàng)

36細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程及注意事項(xiàng)養(yǎng)而將細(xì)；一、原代培養(yǎng)；(一)過(guò)程；原代培養(yǎng)的基本過(guò)程包括取材、培養(yǎng)材料的制備、接種；1、組織塊培養(yǎng)法；(1)基本操作過(guò)程；1)、用培養(yǎng)液濕潤(rùn)所取組織材料，并用鋒利的眼科剪；2)、用濕潤(rùn)的吸管吸取切碎的組織塊，清清吹到培養(yǎng)；3)、將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使瓶底朝上，在種植了組織塊一；4)、將種植根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程中與否需要分割培養(yǎng)物進(jìn)行再培養(yǎng)一、原代培養(yǎng)(一)過(guò)程1)、用培養(yǎng)液濕潤(rùn)所取組織材料，并用鋒利的眼科剪將附在其上的脂肪和結(jié)締組織清除潔凈。再用平衡液(PBS)或Hanks液漂洗；用鋒利的眼科彎剪將組織塊剪成小塊；再用PBS或Hanks液漂洗多次，直至液體不渾濁、無(wú)油滴、清亮為止。2)、用濕潤(rùn)的吸管吸取切碎的組織塊，清清吹到培養(yǎng)瓶皿中，并將其按一定間距均勻放在培養(yǎng)瓶底壁上，量不要過(guò)多，要將組織塊切面貼在培養(yǎng)瓶底壁上；3)、將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使瓶底朝上，在種植了組織塊一側(cè)的對(duì)側(cè)面加足培養(yǎng)液，勿使組織塊與培養(yǎng)液接觸，塞緊瓶塞；4)、將種植了組織塊的一側(cè)朝上，靜置于37℃培養(yǎng)箱中；待組織塊貼壁1h到3h后翻瓶，使貼壁的組織塊浸沒(méi)與培養(yǎng)液中，靜置；5)、每隔2到3天更換一次培養(yǎng)液，或者根據(jù)培養(yǎng)瓶種顏色的變化確定換液時(shí)間。2、注意事項(xiàng)1)、組織塊接種后的前3天，從組織塊向外遷徙的細(xì)胞數(shù)很少，組織塊的黏附不牢固，在觀測(cè)和移動(dòng)的過(guò)程中，注意不要引起液體的振蕩。要防止常常翻動(dòng)和振動(dòng)，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會(huì)脫落飄起。2)、加入的培養(yǎng)液不適宜過(guò)多，防止浸泡的組織塊受輕微的波動(dòng)而脫落下3)、用組織塊培養(yǎng)時(shí)，要及時(shí)觀測(cè)，當(dāng)細(xì)胞向外遷徙出來(lái)后要注意記錄并清除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞，由于已漂浮的組織塊和那些細(xì)胞碎片已經(jīng)死亡，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會(huì)影響原代細(xì)胞的生長(zhǎng)，要及時(shí)清除。4)、為增進(jìn)組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，膠原中的促細(xì)胞貼附因子先吸附于培養(yǎng)瓶底壁上，懸浮的圓形細(xì)胞再與已吸附有促貼物質(zhì)的底壁附著。2、分離細(xì)胞培養(yǎng)法一貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)(1)基本操作過(guò)程1)、首先用細(xì)胞分散法收獲細(xì)胞，隨時(shí)吸取少許消化液在鏡下觀測(cè)，并根據(jù)組織與否分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，采用終止消化措施。用篩網(wǎng)濾掉未消化的組織塊。2)、低速離心細(xì)胞懸液，棄掉上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度。3)、根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞類(lèi)型和試驗(yàn)規(guī)定，用吸管吸取一定量的細(xì)胞懸液，加到培養(yǎng)瓶中。對(duì)于需要特殊底物的細(xì)胞，要先將底物涂一層于培養(yǎng)瓶皿底壁，然后接種細(xì)胞。4)、將培養(yǎng)瓶放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)。5)、每隔2到3天更換培養(yǎng)液一次或根據(jù)培養(yǎng)液顏色的變化確定換液時(shí)間。(2)注意事項(xiàng)1)原代培養(yǎng)的分離細(xì)胞在初次接觸體外環(huán)境時(shí)，雖然被分散成單個(gè)細(xì)胞，但它們之間的互相影響還是存在的，并且這種影響對(duì)細(xì)胞能否存活是非常重要的。在這些細(xì)胞之間能產(chǎn)生某些促生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，使細(xì)胞彼此互相增進(jìn)存活和生長(zhǎng)。假如接種的細(xì)胞密度過(guò)低，細(xì)胞之間的促生長(zhǎng)作用很小，雖然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很充足，也很難使細(xì)胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進(jìn)入獨(dú)立生存環(huán)境的變化過(guò)程。假如接種的細(xì)胞密度過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)局限性，代謝廢物積累較快需要常常換液和傳代。2)原代培養(yǎng)時(shí)初始培養(yǎng)在組織分散和分離細(xì)胞時(shí)細(xì)胞也許會(huì)受到嚴(yán)重的損傷。合適增大原代培養(yǎng)接種的細(xì)胞密度，給培養(yǎng)的細(xì)胞提供更多的類(lèi)似于在體內(nèi)時(shí)細(xì)胞之間的互相作用，會(huì)極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。待細(xì)胞適應(yīng)體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)再以較低的密度接種和培養(yǎng)。3)由于細(xì)胞之間的互相的內(nèi)在聯(lián)絡(luò)被打破，分離細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)經(jīng)歷的生存環(huán)境變化很大，在體外存活和生長(zhǎng)的難度對(duì)應(yīng)增長(zhǎng)。對(duì)于貼壁依賴性細(xì)胞來(lái)說(shuō)，盡快使接種的細(xì)胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵?？梢栽诮臃N后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h,由于細(xì)胞懸液中帶有少許培養(yǎng)液，細(xì)胞即可以維持存活，又可以很快接觸到培養(yǎng)瓶底壁，是細(xì)胞迅速黏附于底物，待細(xì)胞貼壁后，再補(bǔ)足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。3、分離細(xì)胞培養(yǎng)法—懸浮型細(xì)胞培養(yǎng)(1)操作過(guò)程1)制備細(xì)胞懸濁液，計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度。2)在培養(yǎng)皿中加入足夠的培養(yǎng)液。3)將欲接種的細(xì)胞接種到培養(yǎng)器皿中。4)在培養(yǎng)皿內(nèi)放入一種有聚四氟乙烯包被的磁棒。將培養(yǎng)皿封口，送入恒5)培養(yǎng)液略呈黃色換液。吸出部分舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液即可。(2)注意事項(xiàng)1)進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)?？梢酝ㄟ^(guò)增長(zhǎng)培養(yǎng)液的2)可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的(二)原代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)2、伴隨培養(yǎng)的進(jìn)程，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被逐漸酸、丙酮酸等也逐漸增長(zhǎng)。伴隨酸性物質(zhì)的增長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的pH值越來(lái)越低，換液時(shí)，應(yīng)將培養(yǎng)液事先預(yù)溫至37℃。一般培養(yǎng)一天，組織細(xì)胞即可在培養(yǎng)瓶皿底壁黏附并貼壁生長(zhǎng)。2天到3天二、傳代培養(yǎng)1、組織塊培養(yǎng)物的傳代過(guò)程(1)將原代培養(yǎng)物連同底物蓋玻片一同取出，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿上。(2)用刀將培養(yǎng)物分割，刮去多出的部分，剩余繼續(xù)培養(yǎng)的部分。一般是分割刮去組織塊外圍的部分組織，留下中央的部分組織繼續(xù)培養(yǎng)?；虿糠址指畈⑻羧ソM織塊，留下遷移出來(lái)的細(xì)胞于底物蓋玻片上繼續(xù)培養(yǎng)。也可以將組織塊挑出，再種植于新的底物蓋玻片上繼續(xù)培養(yǎng)。(3)給剩余的培養(yǎng)物加上培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。2、分離細(xì)胞培養(yǎng)物一貼壁型細(xì)胞的傳代過(guò)程：有兩項(xiàng)關(guān)鍵工作：一是分割培養(yǎng)物，二是再接種。(1)取出培養(yǎng)瓶，打開(kāi)瓶蓋，用吸管吸出舊的培養(yǎng)液。(2)用無(wú)Ca、Mg的平衡鹽溶液輕輕漂洗培養(yǎng)物1次到2次，洗去殘存血清后棄去平衡鹽溶液。(3)在培養(yǎng)皿內(nèi)加入胰蛋白酶溶液，室溫下消化5min到15min顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞突起縮回近似圓形、細(xì)胞之間的間隙增大時(shí)停止消化。(4)吸管吸去消化液后立即加入含血清培養(yǎng)液或蛋白酶克制劑，克制胰蛋白酶的活性，使消化終止。(5)用彎頭吸管吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶皿底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶皿底壁。(6)低速離心，棄去上清液。(7)用新鮮培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。2+2+(8)根據(jù)傳代目的將細(xì)胞懸浮液接種到一種或多種新的培養(yǎng)器皿中。3、分離細(xì)胞培養(yǎng)物—懸浮型細(xì)胞的傳代過(guò)程(1)將培養(yǎng)物移入離心管低速離心。根據(jù)傳代目的將細(xì)胞懸液接種在一種或多種新的培養(yǎng)皿中。(2)用吸管吸去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液使細(xì)胞沉淀重新懸浮(3)根據(jù)傳代目的將細(xì)胞懸液接種在一種或多種新的培養(yǎng)皿中。(4)加足培養(yǎng)液，加蓋封口，加入恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。(二)傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、離體培養(yǎng)的細(xì)胞生命力比較脆弱，因此傳代時(shí)細(xì)胞沒(méi)有