流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

關(guān)于流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)第1頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日流感監(jiān)測(cè)目的（一）監(jiān)測(cè)流感活動(dòng)水平和流行動(dòng)態(tài)；（二）及時(shí)發(fā)現(xiàn)流感病毒變異并作出預(yù)警；（三）為全球及我國(guó)流感疫苗毒株的預(yù)測(cè)和推薦提供依據(jù)。第2頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日流感監(jiān)測(cè)內(nèi)容（一）流感樣病例監(jiān)測(cè)（二）流感樣病例暴發(fā)疫情監(jiān)測(cè)第3頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日流感樣病例監(jiān)測(cè)標(biāo)本采集采集對(duì)象：流感樣病例

發(fā)熱（體溫≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者采集時(shí)間：病人發(fā)病的頭3天內(nèi)采集采集地點(diǎn)：國(guó)家級(jí)流感樣病例監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院采集數(shù)量：根據(jù)就診ILI病例數(shù)的多少，每家哨點(diǎn)醫(yī)院每周至少采集5～15份流感樣病例的標(biāo)本(根據(jù)流行季節(jié)、流行強(qiáng)度、防控工作需要實(shí)時(shí)調(diào)整）第4頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日暴發(fā)疫情標(biāo)本采集（1）1周內(nèi)，在同一學(xué)校、幼兒園或其他集體單位發(fā)生30例及以上流感樣病例；或發(fā)生5例及以上因流感樣癥狀住院病例（不包括門診留觀病例）；或發(fā)生2例及以上有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的死亡病例；（2）在某一社區(qū)內(nèi)（如同一鄉(xiāng)或街道）1周內(nèi)出現(xiàn)流感樣病例異常增多。每一起暴發(fā)疫情一般應(yīng)當(dāng)采集10份左右咽、鼻拭子標(biāo)本（如果現(xiàn)癥病例在10例以下的，應(yīng)當(dāng)盡量全部采樣）。第5頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日采集標(biāo)本類型常規(guī)

特殊咽拭子鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子鼻洗液痰液呼吸道灌洗液肺組織活檢標(biāo)本尸檢標(biāo)本第6頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日采樣液常用的采樣液有：PH7.4-7.6的Hank’s液或MEM；標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐械蜏乇４?，同時(shí)加入抗菌素（入慶大霉素50mg/mL，多粘菌素B250μg/mL）第7頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日咽拭子采集咽拭子

用滅菌棉簽（最好用聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子）擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將棉簽頭部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。第8頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日標(biāo)本的保存與運(yùn)送標(biāo)本采集后應(yīng)在4℃條件下，盡快（哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)48小時(shí)疫情24小時(shí)內(nèi)）運(yùn)送至流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室未能送至實(shí)驗(yàn)室的，應(yīng)置-70℃或以下保存，一周內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室凍存的標(biāo)本，盡量避免其反復(fù)凍融，在冷藏條件下送到實(shí)驗(yàn)室第9頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日實(shí)驗(yàn)室生物安全要求季節(jié)性流感病毒分離鑒定在生物安全Ⅱ級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。流感病毒分離鑒定及其它檢測(cè)過程中所有能夠產(chǎn)生感染性氣溶膠的過程必須在生物安全Ⅱ級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里操作。用滅活的抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)時(shí)可以在生物安全Ⅰ級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行第10頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日標(biāo)本的接收接收標(biāo)本時(shí)必須核對(duì)送檢表流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的工作人員接到標(biāo)本后，24小時(shí)內(nèi)將“流感/人禽流感監(jiān)測(cè)病例標(biāo)本原始登記送檢表”（表2）錄入到“監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)”第11頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日標(biāo)本的處理標(biāo)本送至實(shí)驗(yàn)室后，立即進(jìn)行處理，未加抗菌素的加入適量的抗菌素。將原始標(biāo)本一分為三份，一份（1ml）用于MDCK細(xì)胞接種，一份（1ml）用于雞胚接種，一份（1ml）保存待復(fù)核。（根據(jù)檢測(cè)程序?qū)崟r(shí)調(diào)整）第12頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)◆核酸檢測(cè)◆病毒分離和鑒定：雞胚分離和細(xì)胞培養(yǎng)◆膠體金快速檢測(cè)第13頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日檢測(cè)流程臨床標(biāo)本采集接種MDCK細(xì)胞接種雞胚紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，鑒定病毒紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)寄送國(guó)家流感中心流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性第14頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日核酸檢測(cè)核酸提取-QIAamp?ViralRNAMiniKit1）在1.5ml離心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。2）取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）140ul加入上述離心管中（糞便標(biāo)本用10％懸液的上清），震蕩15s，室溫放置10min。3）稍離心后，加入560ul無水乙醇，震蕩15s。4）將ViralRNAMinispin柱子取出，將步驟3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm離心1min。棄離心液。5）重復(fù)步驟4。6）將吸附柱放入一新的2ml套管中，加入500ulAWl液，8000rpm離心1min。棄套管及其離心液。7）將吸附柱放入一新的2ml套管中，加入500ulAW2液，13000rpm離心3min，棄套管及其離心液。8）將吸附柱放入一新的1.5ml離心管中，于柱中加入60ul的AVE液，室溫靜置1－3分鐘，8000rpm離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即實(shí)驗(yàn)或－20℃以下保存。第15頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日熒光定量PCR第一次使用前引物稀釋1．引物工作濃度（40μM）配制方法：（1）將新合成的引物開蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量為10×總摩爾數(shù)，充分混勻，此時(shí)引物濃度為100μM，可作為儲(chǔ)存液。（例如：假設(shè)合成引物每管2OD，若2OD的量為9.1nmol，加水量為10×9.1＝91μl）（3）將100μM的引物2.5倍稀釋，此時(shí)濃度為40μM，可作為工作濃度。2．探針工作濃度（10/20μM/）配制方法：（1）將新合成的探針管開蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量為10×總摩爾數(shù)，充分混勻，此時(shí)引物濃度為100μM，可作為儲(chǔ)存液。（3）將100μM的探針10/5倍稀釋，此時(shí)濃度為10/20μM，可作為工作濃度。第16頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日熒光定量PCR引物和探針稀釋好的冰凍的引物和探針進(jìn)行融化（已融的探針避光2-8℃可保存多達(dá)3個(gè)月，不要對(duì)探針反復(fù)凍融）；渦旋振蕩引物和探針；瞬時(shí)離心引物和探針，之后置于冰架上。real-timeRT-PCR的試劑QIAGEN公司QuantiTectProbeRT-PCRKit，CatNo.204443注意：在試驗(yàn)過程中，保持所有的試劑在冰架上保持低溫。第17頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件試劑：InvitrogenSuperScript?IIIPlatinum?One-StepQuantitativeKit（公司：Invitrogen，貨號(hào)：11732-020或11745-100）分子級(jí)無菌蒸餾水(無RNA酶和DNA酶)正反向引物(40μM)雙重標(biāo)記探針(10μM)反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄50℃30min→95℃2min→（95℃15s→55℃30s*）×45反應(yīng)體系為25ul注：*在55度這一步驟中要收集熒光信號(hào)（FAM）第18頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日熒光PCR結(jié)果－陽(yáng)性樣品第19頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日熒光PCR結(jié)果－陰性樣品第20頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日熒光PCR結(jié)果－可疑樣品第21頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日病毒分離-MDCK細(xì)胞標(biāo)本接種MDCK細(xì)胞每日觀察細(xì)胞病變(CPE)MDCK細(xì)胞收獲33－35℃培養(yǎng)第22頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日接種流程清洗MDCK細(xì)胞臨床采樣標(biāo)本接種細(xì)胞Hank’s液清洗細(xì)胞，一般清洗2遍33－35度吸附1－2小時(shí)Hank’s液清洗細(xì)胞加入病毒生長(zhǎng)液，33－35度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變。當(dāng)細(xì)胞病變?yōu)?+或4+時(shí)，即75～100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)進(jìn)行收獲，收獲之前將細(xì)胞凍融1～2次，以提高收獲標(biāo)本的病毒滴度。即使無細(xì)胞病變也應(yīng)該于第7天收獲（細(xì)胞病變情況：細(xì)胞病變的特征是細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落）根據(jù)使用的細(xì)胞瓶的大小，決定接種量，一般的小細(xì)胞瓶接種0.5ml的臨床標(biāo)本流程圖第23頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日MDCK細(xì)胞病毒分離CPE出現(xiàn)時(shí)間與感染病毒的型別、毒株的差異、感染量的大小和MDCK細(xì)胞的敏感性有關(guān)每日觀察細(xì)胞病變(CPE)標(biāo)本接種后7天還未出現(xiàn)CPE，維持液經(jīng)HA試驗(yàn)陰性者，繼續(xù)盲傳1～2代后，HA試驗(yàn)仍為陰性者，則MDCK細(xì)胞病毒分離為陰性，標(biāo)本可棄去第24頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日細(xì)胞病變圖第25頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日雞胚病毒分離標(biāo)本接種于9日齡雞胚33℃～35℃培養(yǎng)72小時(shí)檢卵標(biāo)本準(zhǔn)備第26頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日第27頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日雞胚分離方法-試劑準(zhǔn)備1)

9～11日齡雞胚2)

照蛋燈3)

70%～75％酒精4)

1ml一次性注射器5)

雞蛋開孔器6)

無菌膠布或蠟7)

10ml試管和試管架8)

10ml移液管或1ml移液器及無菌吸尖9)

無菌鑷子10)無菌眼科剪第28頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日雞胚分離方法-標(biāo)記雞胚■檢視標(biāo)記雞胚◆

用照蛋燈檢視雞胚，判斷雞胚狀態(tài)血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血帶或淤血塊胎動(dòng)：活胚有明顯的自然運(yùn)動(dòng)，死胚無胎動(dòng)絨毛尿囊膜發(fā)育界限：密布血管的絨毛尿囊膜與雞胚胎的另一面形成明顯的界限

◆標(biāo)記出雞胚的氣室與尿囊的界限、胚胎頭部的位置

◆如果雞胚是死胚、沒有受精、有裂痕、發(fā)育不全、或表面有好多滲水孔，應(yīng)棄掉第29頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日■接種病毒方法◆

單腔接種盲種◆雙腔接種燈下接種

開窗接種雞胚分離方法第30頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日雞胚分離流程（1）

◆將標(biāo)記好的雞胚的氣室朝上放置在蛋盤上，通常每個(gè)樣本接種3個(gè)雞胚

◆用70%～75％酒精消毒雞胚，在氣室端鉆孔，開10x6mm窗口

◆用注射器吸200μl處理過的臨床標(biāo)本，裝上16號(hào)針頭

◆從窗口中滴入無菌的液體石蠟，然后輕輕晃動(dòng)雞胚，讓液體石蠟在雞胚殼膜內(nèi)層鋪開，此時(shí)在照蛋燈下即可清楚的看到雞胚胎的位置。將注射針頭刺入胚胎的鄂下胸前，用針頭輕輕撥動(dòng)下顎及腿，當(dāng)進(jìn)入羊膜腔時(shí)，能看到雞胚隨著針頭的撥動(dòng)而動(dòng)，即可注射100μl標(biāo)本。將針頭退出至?寸，將另外100μl標(biāo)本注入雞胚尿囊腔第31頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日雞胚分離流程（2）◆用同一注射器和針頭將同一標(biāo)本依上法接種另外的兩枚雞胚◆將針頭棄于合適的生物安全裝置中◆用消毒過的醫(yī)用膠布封口◆

33～35oC溫箱培養(yǎng)雞胚2～3天。臨床采樣標(biāo)本通常培養(yǎng)3天，病毒傳代通常培養(yǎng)2天雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時(shí)，每天檢查雞胚生長(zhǎng)情況，24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，認(rèn)為是非特異死亡應(yīng)棄去第32頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日雞胚分離流程（3）■收獲尿囊液和羊水■雞胚在收獲前應(yīng)4℃過夜或至少放置4小時(shí)■標(biāo)記15ml無菌塑料管與相應(yīng)的雞胚編號(hào)一致■用70%～75％酒精消毒雞胚頂部■用無菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，推開雞胚尿囊膜。用10ml吸管吸取雞胚尿囊液置于相應(yīng)的收集管中。用吸管刺破雞胚羊膜，盡量吸取羊水放置于另外的管中。羊水較少時(shí)也可以將3個(gè)雞胚的羊水合并第33頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日雞胚病毒鑒定經(jīng)HA試驗(yàn)陰性者，將羊水和尿囊液混合，繼續(xù)盲傳1代（72小時(shí)），如仍為陰性，則雞胚病毒分離為陰性，標(biāo)本可棄去雞胚收獲HA試驗(yàn)第34頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日病毒鑒定紅細(xì)胞凝集紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)第35頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日病毒鑒定流程紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)4個(gè)凝集單位配制“回滴”紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)判定流感病毒型別第36頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）MDCK細(xì)胞或雞胚收獲的標(biāo)本分離物首先用雞、豚鼠或人紅細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA），確定病毒滴度

原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能結(jié)合并識(shí)別紅細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺乳動(dòng)物和禽的紅細(xì)胞表面均含有這兩種成分。因此流感病毒能與其結(jié)合并識(shí)別，產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。當(dāng)血清中有特異性抗體與病毒血凝素結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn)第37頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日紅細(xì)胞雞火雞豚鼠人O型血紅細(xì)胞馬適用范圍流感和禽流感病毒流感和禽流感病毒流感病毒流感病毒禽流感病毒終濃度（％）0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.5（1%）孔底部形狀U或V型U或V型U型U型U型孵育時(shí)間30min30min45min45min60min細(xì)胞對(duì)照細(xì)胞沉積成圓點(diǎn)狀，傾斜時(shí)細(xì)胞向下流成淚滴狀細(xì)胞沉積成圓點(diǎn)狀，傾斜時(shí)細(xì)胞向下流成淚滴狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀第38頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日AHBCDEFG100ul病毒液50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul稀釋完病毒液后加入50ul紅細(xì)胞懸液50ulPBS稀釋病毒加入配制好的紅細(xì)胞懸液充分混勻，置室溫孵育30-60分鐘觀察記錄結(jié)果第39頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日病毒原液1：21：128HA：32HA＞128HA：4第40頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）HA滴度≥8，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)；HA滴度<8者，繼續(xù)在敏感的MDCK細(xì)胞系或雞胚上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使其HA滴度≥8后，再進(jìn)行HI測(cè)定若傳1～2代后，HA滴度仍<8者，可應(yīng)用核酸檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定第41頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)HA試驗(yàn)完成后，用國(guó)家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4種標(biāo)準(zhǔn)參照血清，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)，確定病毒的型別和亞型，進(jìn)行HI試驗(yàn)時(shí)，需同時(shí)進(jìn)行4種標(biāo)準(zhǔn)抗原對(duì)照。第42頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)步驟4個(gè)凝集單位的配制和檢測(cè)稀釋血清加入25ul4個(gè)血凝單位抗原，室溫孵育15-30分鐘每孔加入50ul紅細(xì)胞懸液，充分搖勻。室溫孵育30-60分鐘觀察記錄結(jié)果第43頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日4個(gè)凝集單位的配制和檢測(cè)4個(gè)凝集單位的配制讀取紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的結(jié)果計(jì)算所須的4個(gè)凝集單位的病毒用量用50ul檢測(cè)4個(gè)凝集單位時(shí)，用凝集效價(jià)除以8，所得商即為4個(gè)單位的稀釋度用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)“回滴”，復(fù)核4個(gè)凝集單位用50ul，前4孔完全凝集。此時(shí)的抗原即為4個(gè)凝集單位第44頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)稀釋血清12765349810H1血清50ulH3血清50ul50ulPBSB血清50ul25ulPBS25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ulB血清50ulH3血清50ulH1血清50ul第45頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日流感病毒的型別判定標(biāo)準(zhǔn)參照血清對(duì)待鑒定病毒的抑制效價(jià)≥20才可以算為陽(yáng)性一個(gè)待鑒定病毒不能同時(shí)被兩種或兩種以上的標(biāo)準(zhǔn)血清抑制待鑒定病毒與標(biāo)準(zhǔn)參照血清有交叉抑制，但與一種標(biāo)準(zhǔn)參照血清抑制效價(jià)大于其他參照血清4倍以上時(shí)，可以判定為此型別的流感病毒第46頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)-質(zhì)量控制使用的試劑可靠無誤處理后的血清有無殘余非特異性凝集素讀取HA試驗(yàn)的結(jié)果是否正確4個(gè)血凝單位是否準(zhǔn)確紅細(xì)胞陰性對(duì)照待鑒定病毒確保沒有被細(xì)菌污染稀釋血清、病毒、紅細(xì)胞懸液加入量準(zhǔn)確第47頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日結(jié)果錄入

流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的工作人員在完成病毒分離后，24小時(shí)內(nèi)將病毒分離結(jié)果錄入“監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)”中的“病毒分離、鑒定結(jié)果登記一覽表”中。第48頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日毒株的送檢系統(tǒng)自動(dòng)生產(chǎn)的送檢單，省里和國(guó)家均送檢時(shí)限要求包裝要求第49頁(yè)，共60頁(yè)，星期日，2025年，2月5日省級(jí)參比中心開始啟動(dòng)9個(gè)（30%）省級(jí)CD