DNA復(fù)制是ATP直接提供能量嗎？復(fù)制的原料是脫氧核苷酸嗎

DNA復(fù)制過程高中講的比較簡(jiǎn)單，不同的教材深淺也不一致。比如復(fù)制的原料是否是dNMP，能量是否ATP提供，學(xué)生甚至老師存在疑問?，F(xiàn)把DNA復(fù)制有關(guān)的疑難問題解釋一下。1、DNA過程需要的原料和能量必修二教材講DNA復(fù)制過程時(shí)，需要4種游離的脫氧核苷酸為原料。后面黑體字提到DNA復(fù)制需要模板、原料、能量和酶等基礎(chǔ)條件。教材并沒有對(duì)能量誰提供做過多介紹，不過教師講授時(shí)習(xí)慣說ATP為復(fù)制提供能量，教輔資料一般也是這樣介紹。而舊版人教版選擇性必修三教材在介紹體外DNA復(fù)制PCR時(shí)在插圖部分介紹了所需的原料是dNTP（N代表ATCG四種堿基）。而新教材在介紹PCR時(shí)卻把這部分去掉了，依然采用了脫氧核苷酸為原料。那么DNA復(fù)制的原料到底是什么？能量由誰提供呢？實(shí)際上DNA復(fù)制的直接原料是dNTP，既是原料，又為DNA子鏈延伸提供了能量。每增加一個(gè)脫氧核苷酸，需要1個(gè)dNTP摻入，產(chǎn)生1個(gè)焦磷酸PPi（焦磷酸會(huì)自發(fā)水解釋放能量，間接驅(qū)動(dòng)反應(yīng)的進(jìn)行）。實(shí)際上每加入一個(gè)脫氧核苷酸，消耗了相當(dāng)于2分子ATP水解為ADP的能量。所以DNA復(fù)制時(shí)dNTP既充當(dāng)了原料，又提供了能量。那我們說ATP為DNA復(fù)制提供了能量，也不能算錯(cuò)，畢竟dNTP的形成還是離不開ATP供能。另外體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)解旋所需的能量也是ATP直接提供的。2、dNTP如何形成的？dNTP的形成，首先是在NDP（N代表AUCG四種堿基）的基礎(chǔ)上，在相關(guān)酶催化下還原形成dNDP，其中dADP、dGDP和dCDP三種脫氧核苷酸在相關(guān)酶的催化下可以和ATP反應(yīng)生成相應(yīng)的dATP、dGTP和dCTP，同時(shí)伴隨ADP產(chǎn)生。dTTP的形成稍微復(fù)雜一些，因?yàn)闆]有相應(yīng)的TDP脫氧還原?；旧洗嬖?條途徑，一是dUDP轉(zhuǎn)化形成的dUMP而來，具體又有兩種不同的方式，可以是dUDP+ADP生成dUMP+ATP，或dUDP+ATP生成dUTP+ADP，然后dUTP水解形成dUMP。生成的dUMP發(fā)生5-C的甲基化生成dTMP。第二條途徑來自dCMP脫氨形成dUMP，然后發(fā)生5-C的甲基化生成dTMP。三種嘧啶的結(jié)構(gòu)圖如下

嘧啶核苷酸之間互相轉(zhuǎn)化如下圖3、雙脫氧核苷酸與桑格測(cè)序法DNA復(fù)制子鏈延伸時(shí)需要DNA聚合酶催化，DNA聚合酶催化單個(gè)的dNTP依據(jù)模板逐個(gè)添加到已有的3’OH上。如果添加的原料是雙脫氧核苷酸ddNTP（2號(hào)c和3號(hào)c均脫氧），那么就沒有3’OH，也就無法繼續(xù)延伸。

桑格利用了該原理，創(chuàng)造了桑格測(cè)序法進(jìn)行DNA序列的測(cè)定。示意圖如下。這項(xiàng)技術(shù)幫助他破譯了噬菌體174的基因組序列，也是歷史上第一個(gè)被破譯的基因組序列，雖然全長(zhǎng)不超過1萬個(gè)堿基，卻具有劃時(shí)代的意義，也幫助他獲得1980年的諾獎(jiǎng)。順便說一下，這不是他老人家第一次獲獎(jiǎng)，早在1958年就因第一個(gè)破譯了胰島素的氨基酸序列獲得了諾獎(jiǎng)。

高中習(xí)題連接Sanger法核心原理：由于雙脫氧核苷酸(ddNTP)的2′和3′都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以中斷DNA分子合成反應(yīng)，在四個(gè)含有4種脫氧核苷酸(dNTP)的DNA體外合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP(分別為：ddATP，ddCTP，ddGTP和ddTTP)。在PCR過程中復(fù)制隨機(jī)終止，產(chǎn)生四組不同長(zhǎng)度的一系列終止處帶有標(biāo)記的DNA片段。然后在變性凝膠(加入尿素等堿性物質(zhì))_上進(jìn)行電泳和放射自顯影后，可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測(cè)分子的DNA序列，具體過程見下圖。注：ddA是ddATP的縮寫形式請(qǐng)回答問題：(1)上圖橫線中應(yīng)該加入的物質(zhì)是

。(2)材料中還提到“在變性凝膠上進(jìn)行電……”請(qǐng)結(jié)合所學(xué)知識(shí)解釋“變性”含義，以及為什么要變性處理。

(3)如果電泳結(jié)果如右上圖所示，請(qǐng)同學(xué)們寫出待測(cè)模板鏈DNA分子的序列

。(4)第一代測(cè)序技術(shù)(Sanger法)能不能測(cè)定序列信息完全未知的DNA，為什么?

【答案】

DNA聚合酶

變性：破壞DNA分子中的氫鍵，使DNA分子由雙鏈變成單鏈。變性的目的：避免模板鏈對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

TCAGCTCGAATC

不能；因?yàn)镾anger法實(shí)施過程中需要引物，而引物的設(shè)計(jì)也是根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的，所以對(duì)于序列信息完全未知的DNA是無法進(jìn)行測(cè)序的。4、核苷酸的從頭合成與補(bǔ)救合成以及HAT培養(yǎng)基無論是嘌呤核苷酸還是嘧啶核苷酸的合成均存在從頭合成以及補(bǔ)救合成兩條路徑。嘧啶從頭合成合成的UMP可以在UDP的水平還原為dUDP，然后在dUMP水平上甲基化成為dTMP。UMP可在UTP水平上發(fā)生氨基化成為CTP。嘧啶核苷酸的補(bǔ)救合成路徑如下圖嘌呤核苷酸的從頭合成如下圖嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合成如下圖人腦和脊髓中缺乏核苷酸從頭合成的有關(guān)酶，只能進(jìn)行補(bǔ)救合成。與從頭合成和補(bǔ)救合成有關(guān)的高中內(nèi)容是在單克隆抗體這里，如下面的習(xí)題。例題．核苷酸合成有兩個(gè)途徑，物質(zhì)A可以阻斷其中的全合成途徑（如圖）。正常細(xì)胞在添加H和T的條件下還可以進(jìn)行補(bǔ)救合成途徑來合成核苷酸，而制備單克隆抗體時(shí)選用的骨髓瘤細(xì)胞中缺乏補(bǔ)救合成途徑的轉(zhuǎn)化酶?，F(xiàn)用加入H、A、T三種物質(zhì)的HAT培養(yǎng)基來篩選特定的雜交瘤細(xì)胞。關(guān)于篩選原理的敘述正確的是

A．雜交瘤細(xì)胞因?yàn)榭稍贖AT培養(yǎng)基上同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)途徑合成所需的核苷酸，故能大量增殖B．HAT培養(yǎng)基上篩選出的所有雜交瘤細(xì)胞都既能大量增殖又能產(chǎn)生高純度的目標(biāo)抗體C．骨髓瘤細(xì)胞及其互相融合細(xì)胞因無法進(jìn)行上述兩個(gè)途徑而在HAT培養(yǎng)基上不能增殖D．免疫的B細(xì)胞及其互相融合細(xì)胞因全合成途徑被物質(zhì)A阻斷而在HAT培養(yǎng)基上不能增殖5、DNA合成阻斷與細(xì)胞周期同步化在細(xì)胞周期同步化的方法里有一種過量胸苷雙阻斷法。很多學(xué)生不理解胸苷（脫氧核糖加胸腺嘧啶）為什么能夠阻斷DNA合成。實(shí)際上胸苷是DNA合成所需要的原料，在嘧啶的補(bǔ)救合成路徑中，胸苷和ATP在胸苷激酶作用下生成dTMP和ADP。而胸苷如果過量的話反而產(chǎn)生反饋抑制其他核苷酸的磷酸化，從而抑制DNA合成（簡(jiǎn)明說就是細(xì)胞中磷酸是有限的，都跑去形成dTTP了，其他脫氧核苷