新教材高中生物選擇性必修3課件2：3 1 1 重組DNA技術(shù)的基本工具(人教版)

重組DNA技術(shù)的基本工具1992年，一場(chǎng)史無(wú)前例的棉鈴蟲(chóng)災(zāi)害吞噬著中國(guó)的棉田，我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)遭遇滅頂之災(zāi)；國(guó)外公司拒絕出售抗蟲(chóng)棉核心技術(shù)，到1999年外國(guó)抗蟲(chóng)棉已占領(lǐng)我國(guó)95%的棉花市場(chǎng)份額，國(guó)內(nèi)棉花品種市場(chǎng)迅速流失。棉花棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)為了棉花姓“中國(guó)”1998年中棉所成功培育出我國(guó)第一個(gè)國(guó)審抗蟲(chóng)雜交棉新品種——中棉所29，使低齡棉鈴蟲(chóng)的死亡率超過(guò)90%；2002年成功培育出我國(guó)第一個(gè)雙價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉新品種——中棉所41，該品種能夠緩解棉鈴蟲(chóng)抗藥性。我國(guó)成為世界第二個(gè)擁有抗蟲(chóng)基因自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)家！為了棉花姓“中國(guó)”指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作DNA重組技術(shù)?！練w納定義】工程別名：操作對(duì)象：操作水平：

工程實(shí)質(zhì)：什么是基因工程？DNA重組技術(shù)基因DNA分子水平基因重組“工欲善其事，必先利其器”。在培育轉(zhuǎn)基因生物時(shí)，既要在體外對(duì)含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要將重組DNA分子導(dǎo)入生物體內(nèi)，并使其表達(dá)。DNA雙螺旋的直徑只有2nm，對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是非常精細(xì)的共工作?？茖W(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？3.1

重組DNA技術(shù)的基本工具三種“分子工具”“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車”⒈主要來(lái)源：主要從原核生物中分離純化根據(jù)你所掌握的知識(shí)你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀思考2.種類：數(shù)千種3.特點(diǎn)：識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列（特異性）4.作用部位：特定切點(diǎn)上的磷酸二酯鍵一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀限制酶G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A磷酸二酯鍵TGCCGTAA一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀仔細(xì)觀察以下四種限制酶識(shí)別的特定序列有何特點(diǎn)？EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……TaqⅠ………T-C-G-A………………A-G-C-T………限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀【反饋練習(xí)】下面哪項(xiàng)不具有限制酶識(shí)別序列的特征（）A．GAATTCB．GGGGCCCCCTTAAGCCCCGGGGC．CTGCAGD．CTAAATCGACGTCGATTTAGD一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀5、兩種常用的限制酶：EcoRⅠ：大腸桿菌（Escherichiacoli）R型菌株中分離出的第一個(gè)限制酶；SmaⅠ：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分離出的第一個(gè)限制酶。EcoRⅠ和SmaⅠ一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割：只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀

被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。

黏性末端

黏性末端一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀中軸線SmaI限制酶的作用：只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開(kāi)。在C和G之間切開(kāi)一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。平末端平末端一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀6、結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀什么是黏性末端和平末端？這兩種末端是如何形成的？……G……CTTAAAATTC……G…………CCC……GGGGGG……CCC……經(jīng)EcoRⅠ切割后經(jīng)SmaⅠ切割后……GAATTC…………CTT

AAG…………CCCGGG…………GGG

CCC……中心軸線一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀……G……CTTAAAATTC……G…………CCC……GGGGGG……CCC……黏性末端平末端限制酶在識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA兩條鏈分別切開(kāi)，DNA兩條單鏈的切口帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對(duì)。限制酶在識(shí)別序列的中心軸線處將DNA兩條鏈切開(kāi)。一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀練習(xí)使用EcoRI剪切目的基因……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……（1）該DNA片段上EcoRI的識(shí)別序列在哪兒？（2）在筆記本上寫(xiě)出EcoRI切割后的所產(chǎn)生的末端和目的基因片段。一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT…………CTACGATG……GATGCTACTTAAAATTCCCTAA……GGGATT……AATTCCGTAGGGCATCTTAA黏性末端目的基因一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀練習(xí)使用EcoRI剪切目的基因要想獲得某個(gè)特定性狀的目的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣？要切2個(gè)切口，產(chǎn)生4個(gè)黏性(平)末端。會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀思考G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同種限制酶切割(EcoRⅠ)把兩種來(lái)源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？思考：一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀

缺口怎么辦？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G一、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀什么樣的末端才能連接起來(lái)？，1.作用：2.種類：⑴E·coliDNA連接酶⑵T4DNA連接酶將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。二、DNA連接酶——分子縫合針兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來(lái)可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的兩條單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！3、DNA連接酶的縫合作用二、DNA連接酶——分子縫合針

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，（1）E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶連接粘性末端即恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵二、DNA連接酶——分子縫合針二、DNA連接酶——分子縫合針（2）T4DNA連接酶連接平末端，效率低CTTCATGGAAGTACTTAAAATTCCCTAAGGGATTGG...TCTTAAAATTCC...AGTCTTCATGAGAAGTACTTAAAATTCCCTAAGGGGATTCGG...TCTTAAAATTCC...AG二、DNA連接酶——分子縫合針（3）E·coliDNA連接酶在基因工程中的應(yīng)用E·coliDNA連接酶與T4DNA連接酶比較：類型來(lái)源E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？二、DNA連接酶——分子縫合針AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用二、DNA連接酶——分子縫合針DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵4、DNA連接酶與DNA聚合酶的比較：二、DNA連接酶——分子縫合針根據(jù)所學(xué)知識(shí)，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_(kāi)______

B.連接a處的酶為_(kāi)______C.切斷b處的酶為_(kāi)______①③④②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵【反饋練習(xí)】二、DNA連接酶——分子縫合針?lè)肿舆\(yùn)輸車質(zhì)粒將外源基因送入受體細(xì)胞。1.作用：動(dòng)植物病毒λ噬菌體的衍生物2.種類：質(zhì)粒三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖3、運(yùn)載體需具備的條件（1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存（2）有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)（3）有某些標(biāo)記基因（4）對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害、易分離能進(jìn)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并表達(dá)；便于與不同目的基因結(jié)合便于鑒定和篩選三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車質(zhì)粒的特點(diǎn)質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒細(xì)胞染色體外能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子存在于許多細(xì)菌及酵母菌等生物中質(zhì)粒的存在對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)影響質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成4、質(zhì)粒的特點(diǎn)：真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGGCCGTATG…目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…實(shí)例：重組DNA分子的模擬操作三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…GCCGTATG…三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車1、選目的基因兩端和運(yùn)載體都有的酶切位點(diǎn)；2、所選酶切位點(diǎn)不能破壞目的基因以及標(biāo)記基因規(guī)律：---