秋水仙素誘導(dǎo)秋海棠多倍體技術(shù)規(guī)程（征求意見稿）

1T/AHAASSXXX—XXXX秋水仙素誘導(dǎo)秋海棠多倍體技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了秋海棠（BegoniagrandisDryand.）愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)、秋水仙素化學(xué)誘變的儀器設(shè)備、秋水仙素處理液的配制、秋水仙素誘變處理秋海棠愈傷方法、秋水仙素誘變處理后愈傷組織芽分化、壯苗與生根、移栽與定植、秋水仙素誘變后植株篩選與鑒定。本文件適用于采用秋水仙素對秋海棠愈傷組織進(jìn)行化學(xué)誘變、創(chuàng)新秋海棠種質(zhì)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB5084農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB/T6001育苗技術(shù)規(guī)程GB/T8321（所有部分）農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則JB/T10594日光溫室和塑料大棚結(jié)構(gòu)與性能要求NY/T496肥料合理使用準(zhǔn)則通則NY/T2118蔬菜育苗基質(zhì)NY/T2306花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程LY/T1770桉樹無性系組培快繁技術(shù)規(guī)程LY/T1882林木組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程LY/T2234林業(yè)機械林業(yè)工廠化育苗育苗穴盤3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1秋海棠秋海棠科、秋海棠屬多年生草本植物。根狀莖近球形，莖直立，高可達(dá)60cm，有縱棱無毛。莖生葉互生，葉片輪廓寬卵形至卵形兩側(cè)不相等，上面褐綠色，常有紅暈，下面色淡，帶紫紅色，托葉長圓形至披針形膜質(zhì)，花葶有縱棱，無毛；花較多數(shù)粉紅色，花形多姿，葉色柔媚，苞片長圓形，先端鈍，早落；花藥倒卵球形，子房長圓形，蒴果下垂，輪廓長圓形，種子長圓形小，淡褐色數(shù)極多，7月開花，8月開始結(jié)果。T/AHAASSXXX—XXXX23.2秋水仙素又名秋水仙堿，是一種生物堿，化學(xué)式為C22H25NO6，為淡黃色結(jié)晶性粉末，秋水仙堿能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期，因而使染色體加倍。3.3愈傷組織植物組織在受到損傷后，通過細(xì)胞分裂和分化形成的一團未分化的細(xì)胞集合體，具有較強的再生能3.4化學(xué)誘變用化學(xué)誘變劑秋水仙素處理植物材料，以誘發(fā)遺傳物質(zhì)的突變，從而引起植株形態(tài)特征的變異。3.5多倍體染色體組數(shù)為基本染色體組數(shù)2倍以上的植物個體。3.6突變體由于基因突變而表現(xiàn)出突變性狀的個體。4基本要求4.1環(huán)境條件4.1.1組培工廠選址排灌水方便，遠(yuǎn)離污染源，水電供應(yīng)充足，交通便利，周邊環(huán)境清潔，地下水位在1.5m以下，一般建在城市的近郊區(qū)。4.1.2大棚選址應(yīng)選擇交通方便，地勢高，排水良好，通風(fēng)性好，周圍沒有高大建筑物，兩側(cè)沒有高大的防風(fēng)林帶的位置。4.1.3灌溉水應(yīng)符合GB5084對水質(zhì)的要求。4.2肥料肥料使用遵守NY/T496的規(guī)定。4.3設(shè)施T/AHAASSXXX—XXXX34.3.1組培室設(shè)置組培室通常包括洗滌室、藥品室、稱量室、培養(yǎng)基配制室、滅菌室、接種室、培養(yǎng)室、儲藏室等。4.3.2大棚玻璃溫室（大棚或聯(lián)棟）或日光溫室設(shè)施的結(jié)構(gòu)與性能應(yīng)符合JB/T10594的規(guī)定。要求設(shè)施堅固，抗災(zāi)能力強，并且具備一定的環(huán)境調(diào)控能力，能夠調(diào)節(jié)溫度、濕度、光照以及防蟲防雨等。4.3.3其它設(shè)備應(yīng)配備天平、分析天平、純水儀、超凈工作臺、接種器具消毒器、高壓蒸汽滅菌鍋、冰箱、移液槍、恒溫?fù)u床、光照培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀、105孔育苗穴盤、育苗基質(zhì)、苗床（宜采用可移動苗床）、風(fēng)機、遮陽網(wǎng)、肥料機、光照用燈具、溫度計、濕度計、pH值檢測儀、EC值檢測儀、種苗周轉(zhuǎn)箱等設(shè)備。5秋海棠愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)5.1母液配制MS基本培養(yǎng)基的組分及含量參見附錄A.1。MS、6-BA、NAA等母液配制參照NY/T2306執(zhí)行。5.2培養(yǎng)基參見附錄A，表A.2。滅菌和存放按照LY/T1770和LY/T1882相關(guān)條款執(zhí)行。5.3外植體選擇與消毒取嫩葉，用0.1%的洗衣粉液洗滌后，再用蒸餾水清洗干凈，放置于超凈工作臺上進(jìn)行消毒處理。具體消毒操作步驟是：先用無菌水清洗1遍，然后倒入含有1滴tween-20的30%的84消毒液消毒8min，倒掉84消毒液，用滅菌水漂洗5次～8次，直至澄清無異味備用。5.4培養(yǎng)條件本研究采用的培養(yǎng)基中含有25g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH=5.8，培養(yǎng)室溫度（24±2）℃,光照2000Lx～3000Lx，每天光照16h，黑暗8h，培養(yǎng)室相對空氣濕度70%。5.5愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)在超凈工作臺上將消毒、滅菌好的外植體葉片切成約1cm2大小，葉正面朝上接種到配制好的培養(yǎng)基上，25d誘導(dǎo)葉片長出翠綠的愈傷。6秋水仙素處理液的配制T/AHAASSXXX—XXXX4通過前期研究發(fā)現(xiàn)秋水仙素處理后秋海棠愈傷半致死劑量為0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）秋水仙素，因此稱取0.05質(zhì)量分?jǐn)?shù)）秋水仙素，用純水溶解，并定容至1000mL，過濾除菌備用。7秋水仙素處理秋海棠愈傷7.1芽分化培養(yǎng)基參見附錄A，表A.2。7.2培養(yǎng)條件見5.4。7.3操作要求在超凈工作臺內(nèi)將愈傷組織接入己除菌的秋水仙素溶液中浸泡，浸泡處理時間設(shè)置4h，避光、置于搖床每分鐘70轉(zhuǎn)，待浸泡時間結(jié)束后將愈傷組織取出，用滅菌水漂洗5遍，濾紙吸干表面水分，再移入分化培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)瓶放置4塊愈傷，觀察并記錄，40d后分化出部分小芽。8壯苗培養(yǎng)8.1壯苗培養(yǎng)基參見附錄A，表A.2。8.2培養(yǎng)室條件見5.4。8.3操作要求培養(yǎng)40d左右，待芽長至0.5cm～1.0cm高，用手術(shù)刀切除基部大部分愈傷，團塊轉(zhuǎn)移，原則將同一塊愈傷分化出的芽轉(zhuǎn)入同一培養(yǎng)瓶中，作為同一個株系。培養(yǎng)20d～25d，苗高2.0cm以上，壯苗完成。9生根培養(yǎng)9.1生根培養(yǎng)基參見附錄A，表A.2。9.2培養(yǎng)條件T/AHAASSXXX—XXXX5見5.4。9.3操作要求將壯苗后的小苗單株接種到9.1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d～35d左右，長出很多須根，做好標(biāo)記。10煉苗和移栽10.1煉苗根系發(fā)育良好、根系長0.5cm～1.5cm的瓶苗，連瓶子一起置于大棚內(nèi)的環(huán)境中煉苗，煉苗5d~7d后揭開瓶蓋，繼續(xù)煉苗3d～5d。10.2基質(zhì)配方育苗基質(zhì)應(yīng)符合NY/T2118的要求，宜采用泥炭、珍珠巖和蛭石的體積比配制，用泥炭、珍珠巖和蛭石配制，其比例為10:4:3。宜采用無菌含大量有機物的基質(zhì)，泥炭粗細(xì)度宜不高于10mm，pH值宜控制在5.5～6.5之間，蛭石片徑不高于3mm，珍珠巖宜采用2mm～4mm粒徑。手感松軟，無霉變和結(jié)塊。10.3基質(zhì)消毒用25%的多菌靈可濕性粉劑500倍液噴施基質(zhì)，堆積7d以上再裝盤。10.4洗苗與移植將煉苗后的組培幼苗連同培養(yǎng)基一同取出，放在清水中輕輕振動，漂洗干凈幼苗根上的培養(yǎng)基，再將幼苗移植于105孔穴盤中（穴盤質(zhì)量應(yīng)符合LY/T2234的要求并做好標(biāo)記，以瓶為株系編號1-1，1-2……11苗期管理11.1在溫室大棚內(nèi)苗床上培育幼苗a)濕度保持90%以上，每天宜輕霧噴灑水，每天通風(fēng)2h；b)當(dāng)新葉長出來時，濕度宜逐漸降低至80%左右，但不能使植株干透，這時可以薄施肥，用復(fù)合肥（N-P2O5-K2O=15-15-15）水溶液稀釋2000倍淋施，每隔7d～10d噴施一次；c)維持25±1℃的最佳生長溫度，保證植株生長速度；d)幼苗期光照強度高于8000Lx時使用遮陽網(wǎng)。11.235d左右植株進(jìn)入大苗期管理T/AHAASSXXX—XXXX6a)加大干濕循環(huán)，干則干透，澆則澆透的澆水原則（干透的標(biāo)準(zhǔn)盤重宜控制在1.0kg左右，澆透的標(biāo)準(zhǔn)盤重宜控制在2.2kg左右）；b)加大通風(fēng)，增加光照（風(fēng)機每天宜開機2h～4h，光照維持在8000Lx～12000Lx，生長溫度宜控制在23℃~26℃);c)大約每5d～10d施肥一次，采用氮-磷-鉀均衡為20-20-20的水溶肥，稀釋1600～2000倍；d)每次施肥后宜噴灑一次1500倍的含嘧菌酯的殺菌劑，同時噴灑預(yù)防蚜蟲和青蟲的農(nóng)藥（參照附錄A，表A3）。11.320d左右進(jìn)入煉苗期管理溫度白天宜控制在（25±1）℃,夜晚宜控制在（16±1）℃,溫差宜控制在（10±1）℃。濕度宜控制在70%以下，光照強度宜控制在20000Lx～25000Lx。農(nóng)藥噴灑參照大苗期。煉苗5d～7d，準(zhǔn)備出圃。12上盆定植12.1基質(zhì)配方采用園土20%、草炭60%、珍珠巖20%混合均勻。12.2基質(zhì)裝盆的要求選擇口徑為14cm的塑料盆，基質(zhì)裝盆即把基質(zhì)灌到花盆中，裝盆時要求基質(zhì)裝滿到離盆口1cm~1.5cm左右。12.3上盆植苗的方法植苗時先用小鏟挖一小穴，然后把種苗放入后回土稍按緊，所挖穴的大小應(yīng)比穴盤的穴孔大些，深度應(yīng)以放入穴盤苗后穴盤苗原來的基質(zhì)面與覆土后的基質(zhì)面相平或稍低一些，避免把苗硬按在基質(zhì)里或把根系露在外面，前者會造成小苗的根系擠壓在基質(zhì)里而逐漸壞死，后者由于根系露在外面造成根毛干枯。上盆后應(yīng)及時澆水，基質(zhì)很干或在夏天可以澆透（即澆到看見盆底漏水為止冬季只澆到根系以下2cm以上的基質(zhì)充分濕潤就可，特別是對大容器栽植小苗而言，更應(yīng)注意澆水，否則基質(zhì)不容易干難以施肥。上盆后應(yīng)及時做好標(biāo)簽插牌工作，標(biāo)示上盆日期、品種名稱、品種編號。13栽培管理措施13.1澆水T/AHAASSXXX—XXXX7澆水的頻率視天氣情況而定，在安徽一般夏天（除了陰雨天）幾乎每天都需澆一次水，春秋2d～3d澆一次，冬季5d～6d澆一次。決定是否需要澆水應(yīng)在前天的下午3點左右檢查基質(zhì)的干濕情況，此時從基質(zhì)表面看上去有點發(fā)白第二天應(yīng)澆水。還可從植株葉片的顏色判斷是否應(yīng)澆水，如基質(zhì)干，葉片顏色就變淡，干的厲害的葉片發(fā)白，此種情況應(yīng)澆水。13.2施肥13.2.1施肥配方參見附錄A，表A.4。13.2.2施肥操作要求上盆后注意緩苗期管理，度過緩苗期后4d～10d（新根已長出2cm以上）即可進(jìn)行第一次追肥，小苗前期可用N、P、K復(fù)合肥，N、P、K比例在30:10:15，氮肥濃度在150ppm～200ppm（約稀釋800～1000倍），對盆土施肥濃度過高容易造成燒苗，以后每隔7d～10d追施一次。苗后期到發(fā)芽分化期N、P、K比例在20:10:20，氮肥濃度可增加到250ppm～300ppm,（約稀釋500～800倍），花芽分化期可逐漸增加P、K肥的比例，N、P、K比例在15:20:25以促進(jìn)花芽分化，達(dá)到多開花、花朵大、花色艷、花期長，提高“花蓋度”（即花朵或花序數(shù)量占冠幅面積的百分?jǐn)?shù)）。13.3病蟲害管理13.3.1藥物使用嚴(yán)格按照GB/T8321的規(guī)定執(zhí)行。13.3.2病蟲害防治方法見附錄A，表A.3。13.3.3病蟲害日常管理在冬春季和梅雨季節(jié)以防病為主，其中病害防治又以預(yù)防炭疽病、灰霉病、葉斑病為主，猝倒病主要在栽培基質(zhì)配置時盡量不要使用未消毒的舊介質(zhì)，平常溫室管理中加強死苗病苗的及時清理?；颐共☆A(yù)防主要是加強通風(fēng)，降低濕度。蟲害上容易發(fā)生斑潛蠅的危害，特別是早春，夏秋季重點預(yù)防葉斑病、猝倒病為主，加強蟲害的監(jiān)控和防治，特別需要加強鱗翅目夜蛾科類、白粉虱、蚜蟲、螨類害蟲的防治，根據(jù)病蟲害發(fā)生的規(guī)律，最好每隔7d～10d噴一次殺菌劑和殺蟲劑，以預(yù)防為先，否則，一旦病害大規(guī)模發(fā)生，特別是細(xì)菌性葉斑病，難以防治，將會產(chǎn)生較大損失。環(huán)境衛(wèi)生的管理也是預(yù)防病蟲害發(fā)生的一個重要方面，在生產(chǎn)過程中，不僅要及時除去容器中和溫室周邊的雜草，還要及時清理病株死株，防止病菌的蔓延。T/AHAASSXXX—XXXX8噴藥時間5月～9月份選在傍晚4點～8點，早上5點～8點也可，但由于早上要澆水，而噴藥后至少要一小時后才能澆水，所以噴藥常在傍晚；10月～11月份或3月～4月份噴藥在2點～4點；12月～2月份在10點～2點比較好。噴藥應(yīng)對著葉片的正反面噴，走速要均勻，噴藥量以葉片正反面都均勻覆有藥液，特別是植株下部葉片，但不成滴水狀為宜。14秋水仙素誘變植株的篩選與鑒定14.1多倍體植株的初步篩選利用外部形態(tài)學(xué)進(jìn)行初步鑒定，植株生長期間以野生型為對照，染色體加倍植株外部形態(tài)可能表現(xiàn)以下特征：葉片較寬、較大或有皺褶、葉片變厚變脆、葉片顏色更綠、莖較粗壯，節(jié)間變短；花冠明顯變大；生長緩慢等特征。根據(jù)上述標(biāo)志，即可把沒有多倍體特征的材料及時淘汰，對初步認(rèn)為是多倍體的材料進(jìn)行觀察、記錄、拍照、掛牌標(biāo)記按單株編號，再做進(jìn)一步檢查。14.2多倍體鑒定方法14.2.1氣孔鑒定觀察氣孔和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的大小是較為可靠的鑒定多倍體的解剖學(xué)方法。撕取最外層葉片的下表皮進(jìn)行制片，在顯微鏡下觀察氣孔，據(jù)研究，秋海棠四倍體保衛(wèi)細(xì)胞長度都比二倍體增加44%以上，秋海棠四倍體保衛(wèi)細(xì)胞寬度都比二倍體增加45%以上。14.2.2秋海棠染色體倍性鑒定秋海棠染色體倍性鑒定采用流式細(xì)胞儀法，檢測快、采集數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點。解離液配制采用Kiwifruitbuffer緩沖液解離液制備葉片細(xì)胞核懸液10mmol·L?1MgSO4·7H2O，50mmol·L?1KCl，3.5mmol·L?1HEPES，0.3%(V/V)TritonX-100，1%PVP-30，最終定容至100mL，用NaOH溶液調(diào)制pH7.5備用。細(xì)胞懸浮液提取方法a)取0.1g嫩葉片，滴加2mL解離液,快速切碎至糊狀。b)過濾處理，切好的材料分別用400目濾膜過濾到2mL的離心管中，緊接著加入解離液至1.5mL，然后置于4℃冰箱中5min。c)取出解離液，置于離心機內(nèi)，4℃離心1000r·min?1,5min，離心后棄上清液，加入600μL解離液與60μL預(yù)冷PI染色液，置于4℃冰箱中避光染色15min。d)利用流式細(xì)胞儀檢測，將樣品移至上樣管上機檢測，儀器將實驗數(shù)據(jù)傳入電腦中。T/AHAASSXXX—XXXX915突變植株培育經(jīng)過氣孔和倍性鑒定將得到的多倍體突變植株，對其進(jìn)一步培育，在倍性變異后表現(xiàn)優(yōu)良經(jīng)濟性狀的植株，可作為育種材料，種在選種圃，進(jìn)行全面鑒定