血液檢驗(yàn) 8.2017-2014級(jí)檢驗(yàn)本科紅細(xì)胞檢驗(yàn)2 學(xué)習(xí)資料

第七章

紅細(xì)胞檢驗(yàn)的基本方法南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系孫德華主要內(nèi)容紅細(xì)胞酶缺陷的檢驗(yàn)血紅蛋白異常的檢驗(yàn)陳發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥的檢驗(yàn)免疫性溶血性貧血的檢驗(yàn)(五)紅細(xì)胞酶缺陷的檢驗(yàn)高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)變性珠蛋白小體生成試驗(yàn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)和活性測(cè)定丙酮酸激酶熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)和活性測(cè)定谷胱甘肽還原酶缺陷檢測(cè)1.高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)

methemoglobinreductiontest,MHb-RT原理在血液中加入亞硝酸鹽使紅細(xì)胞中的亞鐵血紅蛋白變成MHb（褐色），正常紅細(xì)胞的Ｇ-6-PD催化戊糖旁路使NADP（氧化型輔酶Ⅱ）變成NADPH（還原型輔酶Ⅱ），其脫的氫通過(guò)亞甲藍(lán)試劑的遞氫作用而使高鐵血紅蛋白（Fe3+)還原成亞鐵血紅蛋白（Fe2+）（紅色），通過(guò)比色可觀察還原的多少。當(dāng)G-6-PD缺乏時(shí)，高鐵血紅蛋白還原率下降。6-磷酸葡萄糖NADP還原型亞甲藍(lán)高鐵血紅蛋白(Fe3+)

G-6-PD高鐵血紅蛋白還原酶6-磷酸葡萄糖酸NADPH氧化型亞甲藍(lán)血紅蛋白(Fe2+)

高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)(MHb-RT）原理

Fe2+Fe3+

亞硝酸鹽

Fe3+Fe2+

亞甲藍(lán)

G-6PDNADP

NADPH

比色參考值

正常人高鐵血紅蛋白還原率≧75%臍帶血≧77%

臨床評(píng)價(jià)G-6-PD缺乏時(shí)，高鐵血紅蛋白還原率下降。中間缺乏時(shí)（雜合子）為31%-74%嚴(yán)重缺乏（半雜合子或純合子）﹤30%注意事項(xiàng)（1）紅細(xì)胞比積低于30％時(shí)，高鐵血紅蛋白還原率顯著降低，必須調(diào)整紅細(xì)胞與血漿的比例，直到1：1；（2）草酸鹽具有還原性，不能作為抗凝劑；（3）標(biāo)本不應(yīng)有凝血或溶血；（4）測(cè)定吸光度波長(zhǎng)應(yīng)準(zhǔn)確：635nm。2.變性珠蛋白小體生成試驗(yàn)原理G-6-PD缺乏的病人血樣加入乙酰苯肼于37℃孵育2-4小時(shí)，用煌焦油藍(lán)染色觀察紅細(xì)胞中珠蛋白小體的生成情況，計(jì)算含5個(gè)及以上珠蛋白小體的紅細(xì)胞的百分率。參考值正常人含5個(gè)及5個(gè)以上珠蛋白小體的紅細(xì)胞一般﹤30%。臨床評(píng)價(jià)G-6-PD缺乏癥常高于45%，故可作為G-6-PD缺乏的篩檢試驗(yàn)。但還原型谷胱甘肽缺乏癥也增高；不穩(wěn)定血紅蛋白病含小體的細(xì)胞百分率為75%-84%，HbH病和化學(xué)物質(zhì)中毒時(shí)也增高。3.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)和活性測(cè)定原理在G-6-PD和NADP+存在下,G-6-PD能使NADP+

還原成為NADPH，后者在紫外線照射下會(huì)發(fā)出熒光。NADPH的吸收峰在波長(zhǎng)340nm處，可通過(guò)單位時(shí)間生成的NADPH的量來(lái)測(cè)定G-6-PD活性。NADP+

NADPH

（340nm）

G-6-PD參考值和臨床意義正常人有很強(qiáng)熒光。G-6-PD缺陷者熒光很弱或無(wú)熒光;雜合子或某些G-6-PD變異者則可能有輕到中度熒光.正常人酶活性為(12.1±2.09)U/gHb(Zinkham法）。G-6-PD缺陷者見(jiàn)于蠶豆病和伯氨喹啉型藥物性溶血性貧血等。附注：（1）本法特異性較好，可直接測(cè)定G6PD活性；（2）每次試驗(yàn)要有G6PD正常和缺陷的標(biāo)本作對(duì)照；（3）貧血患者取血量可稍多；（4）干血濾紙片郵寄某中心檢測(cè)時(shí)，應(yīng)同時(shí)郵寄正常對(duì)照血樣品。原理4.丙酮酸激酶熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)和活性測(cè)定二磷酸腺苷（ADP）磷酸烯醇丙酮酸（PEP）丙酮酸NAD+乳酸ATPNADH丙酮酸激酶PKLDH340nm處有吸收峰無(wú)參考值正常人丙酮酸激酶活性斑點(diǎn)在25分鐘內(nèi)消失。酶活性（15.0±1.99）U/gHb臨床評(píng)價(jià)熒光斑點(diǎn)不消失或時(shí)間延長(zhǎng)說(shuō)明丙酮酸激酶活性缺乏中間缺乏（雜合子）時(shí)，熒光25-60分鐘消失嚴(yán)重缺乏（純合子）時(shí)，熒光60分鐘不消失參考值正常人丙酮酸激酶活性斑點(diǎn)在25分鐘內(nèi)消失。酶活性（15.0±1.99）U/gHb臨床評(píng)價(jià)熒光斑點(diǎn)不消失或時(shí)間延長(zhǎng)說(shuō)明丙酮酸激酶活性缺乏中間缺乏（雜合子）時(shí)，熒光25-60分鐘消失嚴(yán)重缺乏（純合子）時(shí)，熒光60分鐘不消失。5.谷胱甘肽還原酶缺陷檢測(cè)原理谷胱甘肽還原酶（glutathionreductase,GR)催化反應(yīng)中NADPH轉(zhuǎn)化為NADP+，熒光消失，通過(guò)在340nm處觀察熒光斑點(diǎn)消失的時(shí)間（GR熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)）反映谷胱甘肽還原酶的活性，或直接測(cè)定340nm吸光度的變化（GR活性定量試驗(yàn)）計(jì)算GR的活性。NADPHNADP+谷胱甘肽還原酶參考值GR熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)：正常人熒光斑點(diǎn)15min內(nèi)消失GR活性定量：（7.17±1.09）U/gHb臨床評(píng)價(jià)谷胱甘肽還原酶缺乏時(shí)，GR熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)15分鐘以后還有熒光存在，GR活性定量試驗(yàn)活性低于7.17U/gHb。紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥檢驗(yàn)

glucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiency高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)G-6-PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)(ICSH推薦篩查方法)硝基四氮唑藍(lán)試驗(yàn)（NBT）紙片法變性珠蛋白小體（Heinz小體）生成試驗(yàn)紅細(xì)胞G-6-PD活性測(cè)定分子生物學(xué)法確診試驗(yàn)篩選試驗(yàn)(六)血紅蛋白異常的檢驗(yàn)紅細(xì)胞包涵體試驗(yàn)血紅蛋白電泳檢測(cè)抗堿血紅蛋白檢測(cè)HbF酸洗脫法檢測(cè)異丙醇沉淀試驗(yàn)熱變性試驗(yàn)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)尿素裂解試驗(yàn)高壓電泳檢測(cè)血紅蛋白基因PCR技術(shù)檢測(cè)原理1.紅細(xì)胞包涵體試驗(yàn)

Heinz-bodyformingtrest煌焦油藍(lán)液+新鮮血液37度孵育不穩(wěn)定血紅蛋白易變性沉淀包涵體參考值正常人﹤0.01（1%）臨床評(píng)價(jià)不穩(wěn)定血紅蛋白病孵育1-3小時(shí)多數(shù)紅細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)變性珠蛋白肽鏈沉淀形成的包涵體。G-6-PD缺乏或紅細(xì)胞還原酶缺乏及化學(xué)物質(zhì)中毒等，紅細(xì)胞中也可出現(xiàn)包涵體。HbH病孵育1小時(shí)就可出現(xiàn)包涵體，也叫HbH包涵體。注意事項(xiàng)：

觀察結(jié)果注意與網(wǎng)織紅細(xì)胞鑒別，HbH包涵體為大小不等、數(shù)目不一的墨綠藍(lán)色小體，后者包涵體一般呈蜘網(wǎng)狀，且很快顯現(xiàn)；

2.血紅蛋白電泳檢測(cè)

hemoglobineletroporesis原理不同的血紅蛋白帶有不同的電荷，等電點(diǎn)不同，在一定的pH緩沖液中，緩沖液的pH大于Hb的等電點(diǎn)時(shí)其帶負(fù)電荷，電泳時(shí)在電場(chǎng)中向陽(yáng)極泳動(dòng)；反之，Hb帶正電荷向陰極泳動(dòng)。經(jīng)一定電壓和時(shí)間的電泳，不同的血紅蛋白所帶電荷不同、相對(duì)分子質(zhì)量不同，其泳動(dòng)方向和速度不同，可分離出各自的區(qū)帶同時(shí)對(duì)電泳出的各區(qū)帶進(jìn)行電泳掃描，可進(jìn)行各種血紅蛋白的定量分析。參考值pH8.6TEB緩沖液醋酸纖維膜電泳適合于檢出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易與HbA分開(kāi)，HbH與HbBarts不能分開(kāi)和顯示.PH６.5TEB緩沖液醋酸纖維膜電泳

主要用于HbH和HbBarts的檢出。HbH等電點(diǎn)為5.6，在PH6.5TEB緩沖液中電泳時(shí)泳向陽(yáng)極，HbBarts則在點(diǎn)樣點(diǎn)不動(dòng)，而其余的血紅蛋都向陰極移動(dòng)。臨床評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)異常血紅蛋白區(qū)帶，如HbH、HbE、HbBarts、HbD和HbC等。HbA2增多，見(jiàn)于β珠蛋白生成障礙性貧血，為雜合子的重要實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)。HbE病時(shí)也在HbA2區(qū)帶位置處增加，但含量很大（在10％以上）。HbA2輕度增加亦可見(jiàn)于肝病、腫瘤和某些血液病。區(qū)帶示意圖：CA2EDSGLPQAFMKJNBartsHI適合于檢出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易與HbA分開(kāi)，HbH與HbBarts不能分開(kāi)和顯示.主要用于HbH和HbBarts的檢出。HbH等電點(diǎn)為5.6，在PH6.5TEB緩沖液中電泳時(shí)泳向陽(yáng)極，HbBarts則在點(diǎn)樣點(diǎn)不動(dòng)，而其余的血紅蛋都向陰極移動(dòng)。

1、瓊脂糖電泳

2、毛細(xì)管電泳

3、高效液相色譜儀（HPLC）目前常用血紅蛋白電泳技術(shù)：PrinCE450高效毛細(xì)管電泳儀L-2000高效液相色譜儀HPLC3.抗堿血紅蛋白檢測(cè)原理胎兒血紅蛋白（HbF）具有比HbA更強(qiáng)的抗堿作用，將待檢的溶血液與一定量的NaOH溶液混合，作用1分鐘后加入半飽和硫酸銨中止堿性反應(yīng)。HbF抗堿變性作用強(qiáng)，沒(méi)有變性存在于上清液中，HbA變性沉淀，取上清于540nm處測(cè)定吸光度，檢測(cè)出HbF的濃度。此試驗(yàn)也稱為堿變性試驗(yàn)，其檢測(cè)的是抗堿血紅蛋白，除HbF外，HbBarts和部分HbH也具有抗堿能力，需通過(guò)電泳鑒別。參考值成人：1.0-3.1％新生兒：55-85％臨床評(píng)價(jià)絕對(duì)增多：珠蛋白生成障礙性貧血時(shí)HbF增加，重型者達(dá)30％～90％，中間型常為5％～30％，輕型者小于5％。遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)綜合征患者，HbF可高達(dá)100％。相對(duì)增多：可見(jiàn)于骨髓纖維化、白血病、漿細(xì)胞瘤等惡性疾病及再生障礙性貧血、PNH、卟啉病等。生理性增多：見(jiàn)于孕婦和新生兒。4.HbF酸洗脫法檢測(cè)原理HbF具有抗堿和抗酸能力比HbA強(qiáng)。將血涂片于酸性緩沖液孵育，含HbF的紅細(xì)胞不被酸洗脫，可被伊紅染成紅色，而含HbA的紅細(xì)胞均被酸洗脫，不能被伊紅著色。參考值正常血片中含HbF的著色紅細(xì)胞：成人<0.02(2%);新生兒0.55-0.85(55%-85%)，以后漸漸下降;孕婦可有輕度增加。臨床評(píng)價(jià)珠蛋白合成障礙性貧血著色細(xì)胞增加，重型患者大多數(shù)紅細(xì)胞染成紅色，輕型患者可見(jiàn)少數(shù)染成紅色的細(xì)胞。遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)綜合征全部紅細(xì)胞均染為紅色。5.異丙醇沉淀試驗(yàn)原理不穩(wěn)定血紅蛋白較正常血紅蛋白更易裂解在異丙醇這種能降低血紅蛋白分子內(nèi)部氫鍵的非極性溶液中，不穩(wěn)定血紅蛋白更快的沉淀通過(guò)觀察血紅蛋白液在異丙醇中的沉淀現(xiàn)象對(duì)不穩(wěn)定血紅蛋白進(jìn)行篩檢。參考值正常人血紅蛋白液為陰性（30分鐘內(nèi)不沉淀）臨床評(píng)價(jià)不穩(wěn)定血紅蛋白存在時(shí)，常于5分鐘時(shí)出現(xiàn)沉淀,20分鐘開(kāi)始出現(xiàn)絨毛狀沉淀。血液中含有較多HbF、HbH、HbE時(shí)也可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。本試驗(yàn)特異性差，為不穩(wěn)定血紅蛋白的過(guò)篩試驗(yàn)。注意事項(xiàng)：

（1）異丙醇溶液濃度（17％）及溫度（37℃）應(yīng)嚴(yán)格控制，PH只不得低于7.2；

（2）血紅蛋白濃度應(yīng)控制在70-130g/L之間，最好為100g/L；

（3）血紅蛋白液需新鮮配置，久置可變?yōu)楦哞F血紅蛋白，造成假陽(yáng)性。6.熱變性試驗(yàn)

Heatinstabilitytest原理熱變性試驗(yàn)是根據(jù)不穩(wěn)定血紅蛋白比正常血紅蛋白更容易遇熱變性，觀察血紅蛋白液在50℃時(shí)作用2小時(shí)，是否出現(xiàn)沉淀，對(duì)不穩(wěn)定血紅蛋白進(jìn)行篩檢。參考值陰性：2小時(shí)不會(huì)或僅有微細(xì)沉淀，熱沉淀的血紅蛋白<5%。臨床評(píng)價(jià)血紅蛋白沉淀率增加，說(shuō)明不穩(wěn)定血紅蛋白存在。HbF、HbH、HbE含量增加時(shí)，G6PD缺陷和α珠蛋白生成障礙性貧血者，結(jié)果均偏高。7.聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)原理尿素或?qū)β裙郊姿崮芷茐难t蛋白的空間結(jié)構(gòu)，血紅蛋白的珠蛋白可被裂解成肽鏈亞單位，通過(guò)聚丙烯酰銨凝膠電泳可分離出各肽鏈區(qū)帶。參考值正常血紅蛋白HbA裂解后出現(xiàn)β、HbA、HbA2、和α四條帶。臨床評(píng)價(jià)本試驗(yàn)若有異常血紅蛋白肽鏈的區(qū)帶出現(xiàn)，表示有異常血紅蛋白存在。對(duì)珠蛋白生成障礙性貧血的診斷和鑒別有參考價(jià)值。8.血紅蛋白基因PCR技術(shù)檢測(cè)原理一般PCR產(chǎn)物用DNA印跡法、酶切法或直接測(cè)序等方法進(jìn)行檢測(cè)?？蓹z測(cè)出異常血紅蛋白基因的存在，是純合子還是雜合子，基因缺陷的部位等。臨床評(píng)價(jià)在分子水平上進(jìn)行血紅蛋白病的診斷和研究。（七）陳發(fā)性血紅蛋白尿癥的檢驗(yàn)酸化血清溶血試驗(yàn)蔗糖溶血試驗(yàn)蛇毒因子溶血試驗(yàn)1.酸化血清溶血試驗(yàn)

acidified-serumhemolysistest原理陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxymalnocturnalhemoglobinuriaPNH）患者體內(nèi)存在對(duì)補(bǔ)體敏感的紅細(xì)胞。酸化血清溶血試驗(yàn)也稱Hamtest，即紅細(xì)胞在酸性（pH6.4-6.5）的正常血清中孵育,補(bǔ)體被激活，PNH紅細(xì)胞破壞而產(chǎn)生溶血。而正常紅細(xì)胞不被溶解，無(wú)溶血現(xiàn)象。參考值正常人陰性臨床評(píng)價(jià)本試驗(yàn)陽(yáng)性主要見(jiàn)于PNH，特異性強(qiáng)，是診斷PNH最基本簡(jiǎn)易的確診試驗(yàn)。但敏感性較差，30%患者呈陰性。某些自身免疫性溶血性貧血發(fā)作嚴(yán)重時(shí)可呈陽(yáng)性。注意事項(xiàng)

（1）血清酸化后，試管必須塞緊，否則二氧化碳逸出，酸度下降；

（2）抗凝劑會(huì)影響PH值，最好用脫纖維血；

（3）最好用混和血清，對(duì)照必須用O型血；

（4）患者多次輸血會(huì)影響結(jié)果。（5）球形紅細(xì)胞在酸化血清內(nèi)呈假陽(yáng)性反應(yīng)，遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥者，在加熱滅活補(bǔ)體后的血清中再作試驗(yàn)，仍呈陽(yáng)性反應(yīng)。2.蔗糖溶血試驗(yàn)

sucrosehemolysistest原理蔗糖溶血試驗(yàn)是根據(jù)PNH患者的紅細(xì)胞，在低離子強(qiáng)度的蔗糖溶液中對(duì)補(bǔ)體敏感性增強(qiáng)，經(jīng)孵育，補(bǔ)體與紅細(xì)胞膜結(jié)合加強(qiáng)，蔗糖溶液進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致滲透性溶血而設(shè)計(jì)的。參考值定性試驗(yàn)：正常為陰性；定量試驗(yàn)：正常溶血率<5％臨床評(píng)價(jià)PNH患者蔗糖溶血試驗(yàn)為陽(yáng)性或溶血率增加，可作為PNH的篩選試驗(yàn)。自身免疫性溶血性貧血有的可為陽(yáng)性，白血病、骨髓硬化時(shí)可出現(xiàn)假陽(yáng)性。附注（1）所用儀器應(yīng)清潔干燥（2）若無(wú)蔗糖可用葡萄糖代替。3.蛇毒因子溶血試驗(yàn)

venomhemolysistest原理蛇毒因子溶血試驗(yàn)多采用從眼鏡蛇毒中提取的一種蛇毒因子（C3b)可通過(guò)旁路途徑激活補(bǔ)體，PNH患者的紅細(xì)胞補(bǔ)體系統(tǒng)激活后，促使PNH補(bǔ)體敏感細(xì)胞破壞、溶血。參考值正常人溶血率<5％臨床評(píng)價(jià)溶血率增加，PNH的可能性大，可反應(yīng)PNHⅢ型紅細(xì)胞的溶血情況。正常紅細(xì)胞、PNHⅡ型等的紅細(xì)胞均不發(fā)生溶血。4.血細(xì)胞表型CD59/CD55流式細(xì)胞術(shù)分析原理PNH是一種獲得性造血干細(xì)胞基因突變引起血細(xì)胞膜缺陷所致的溶血病。其異常血細(xì)胞膜上的糖化肌醇磷脂-錨（GPI-anchor)連接蛋白如反應(yīng)性溶血膜抑制物（CD59）和（或）衰變加速因子（CD55）等表達(dá)明顯降低或缺乏。用GPI連接蛋白如CD59/CD55熒光標(biāo)記的單克隆抗體作分子探針，用流式細(xì)胞技術(shù)分析紅細(xì)胞膜上的CD59/CD55分子的表達(dá)量，對(duì)PNH診斷和鑒別診斷有重要的臨床意義。參考值CD59（或CD55）陰性的紅細(xì)胞>5%CD59（或CD55）陰性的中性粒細(xì)胞>10%

作為PNH診斷的臨界值。非PNH患者和健康人均<5%。PNH患者CD59（或CD55）陰性的紅細(xì)胞>9%，多數(shù)患者>20%；CD59（或CD55）陰性的中性粒細(xì)胞>16%臨床意義患者CD59（或CD55）低表達(dá)的異常細(xì)胞群增多，支持PNH診斷。

本試驗(yàn)是目前診斷PNH特異性和敏感性最高的、可定量的檢測(cè)方法。為PNH確診試驗(yàn)。（七）免疫性溶血性貧血的檢驗(yàn)抗人球蛋白試驗(yàn)冷凝集素試驗(yàn)冷熱溶血試驗(yàn)1.抗人球蛋白試驗(yàn)coombs

試驗(yàn)原理檢測(cè)自身免疫性溶血的自身抗體（IgG）檢測(cè)紅細(xì)胞表面有無(wú)不完全抗體的直接抗人球蛋白試驗(yàn)檢測(cè)血清中有無(wú)不完全抗體的間接抗人球蛋白試驗(yàn)直接試驗(yàn)應(yīng)用抗人球蛋白試劑（抗IgG

和/或抗C3d）與紅細(xì)胞表面的IgG分子結(jié)合，如紅細(xì)胞表面存在自身抗體，出現(xiàn)凝集反應(yīng)。間接試驗(yàn)應(yīng)用Rh（D）陽(yáng)性O(shè)