基因工程宿主與轉(zhuǎn)化優(yōu)品

基因工程宿主與轉(zhuǎn)化基因表達系統(tǒng)4.1植物基因轉(zhuǎn)化4.2原核表達系統(tǒng)4.1農(nóng)桿菌介導的植物基因轉(zhuǎn)化一、農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌：根瘤菌科(Rhizobiacease)；土壤桿菌屬(Agrobacterium)，革蘭氏陰性。

根癌農(nóng)桿菌

(Agrobacteriumtumefaciens)

放射型農(nóng)桿菌(Agrobacteriumradiobacter)

發(fā)根農(nóng)桿菌

(Agrobacteriumrhizogenes)

懸鉤子農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrubi)農(nóng)桿菌是植物的病原菌

根癌農(nóng)桿菌感染導致冠癭瘤的形成Themechanismofcrowngallformationhasbeenextensivelyreviewedbyanumberofauthors(Zupanetal.,2000;ZupanandZambryski,1995;Zambryski,1992;ShengandCitovsky,1996;HooykaasandBeijersbergen,1994).

植物病原菌,天然遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)載體系統(tǒng)－Ti質(zhì)粒宿主范圍廣泛存在于雙子葉植物中，據(jù)不完全統(tǒng)計，約有93屬643種雙子葉植物對根癌農(nóng)桿菌敏感。裸子植物對該菌也具有敏感性，能誘發(fā)腫瘤。

一般認為單子葉植物對農(nóng)桿菌無敏感性。DeCleeneandDeLay(1976)reportedalistofnaturalhostplantsforAgrobacteriumandtheirlistcontained42gymnosperms,596dicotyledonsand5monocotyledons.Thenumberofmonocotyledonsinthelistwasverysmallandnoagronomicallyimportantcerealswereincluded.Thus,thegeneralstatementthatAgrobacteriumdoesnotinducetumoursonmonocotyledonsisnotliterallytrue,butitreflectsgeneralbeliefsoveralongperiodoftime.單子葉植物與雙子葉植物對損傷的響應不同，對宿主范圍有影響3種類型用損傷細胞作為保護層（保護層內(nèi)的細胞木質(zhì)化）單子葉植物細胞分裂，形成愈傷組織雙子葉植物形成創(chuàng)傷周皮二、冠癭瘤形成機制Ti質(zhì)粒編碼蛋白介導T-DNA轉(zhuǎn)移；T鏈（單鏈）進入植物細胞核，整合到植物基因組中1.Ti質(zhì)粒

雙鏈共價閉環(huán)DNA，分子量約200kb迄今已從多種植物分離了不同種類的農(nóng)桿菌，它們的Ti質(zhì)粒的，結(jié)構(gòu)特性均已清楚。菌株起源致瘤質(zhì)粒名稱

B6蘋果瘤＋pTi-B6番茄瘤＋pTi15955NCPPB1001葡萄瘤＋pTi1001C58櫻桃瘤＋pTi-C58pAT-C58長病桃樹的土壤＋pTi-1D13527白楊瘤＋pTi-27EU6衛(wèi)矛瘤＋pTi-EU6pAT-EU6Ti質(zhì)粒的功能區(qū)

T－DNA整合到植物染色體Vir基因介導基因轉(zhuǎn)化

Ti質(zhì)粒復制起始區(qū)Vir區(qū)T-DNA區(qū)冠癭堿代謝區(qū)1982，Chilton等人用同位素標記Ti質(zhì)粒做探針與煙草冠癭瘤細胞DNA雜交；后將章魚堿型Ti質(zhì)粒用內(nèi)切酶SmaI切成19個片段，分別制備探針后與冠癭瘤DNA雜交；研究結(jié)果：兩段Ti質(zhì)粒DNA能和冠癭瘤DNA雜交,說明這部分DNA從Ti質(zhì)粒上切割后轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞中

LBRBAuxiniaaMiaaH

tmsCytokininipt

tmrOpinetmt冠癭堿代謝區(qū)復制起始區(qū)Vir區(qū)Ti質(zhì)粒tms的編碼產(chǎn)物負責合成吲哚乙酸t(yī)mr

的編碼產(chǎn)物負責合成細胞分裂素tmt

的編碼產(chǎn)物負責：合成氨基酸衍生物T－DNA的結(jié)構(gòu)左右邊緣序列編碼基因可以在植物細胞中表達T-DNATms和Tmr基因的表達使植物細胞內(nèi)激素平衡紊亂，冠癭瘤細胞無限生長，形成激素自主的特性，導致冠癭瘤形成。Tms和Tmr基因是致瘤所必需的基因，稱為致瘤基因（oncgene)Vir區(qū)基因的功能V區(qū)基因介導T鏈轉(zhuǎn)移至少6個操縱子在鏈轉(zhuǎn)移中起作用virA(1cistron),virB(11cistrons),virC(2cistrons),virD(4cistrons),virE(2cistrons)andvirG(1cistron)(StachelandNester,1986).-這些基因在侵染植物時表達2.轉(zhuǎn)化機制信號受體VirA識別化學信號，通過磷酸化激活VirG；VirG為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可上調(diào)V區(qū)基因表達損傷后植物體的汁液呈酸性，含各種物質(zhì)，包括木質(zhì)素，類黃酮生物合成途徑中產(chǎn)生的酚類物質(zhì)，受損傷后的植物汁液誘導v區(qū)基因表達(Stacheletal.,1985)，其中最有效的酚類化合物是乙酰丁香酮T鏈的形成及轉(zhuǎn)運

在VirD1,VirC1（and,possibly,VirD3）蛋白的協(xié)助下，VirD2蛋白識別左、右邊緣序列，在第3和第4個核苷酸之間切割下面單鏈產(chǎn)生缺口（Zambryski,1992).VirD2共價結(jié)合T鏈5’端，隨著Ti質(zhì)粒DNA的合成，T鏈被“釋放”。VirE2為單鏈DNA結(jié)合蛋白，VirE2結(jié)合T-DNA形成T鏈復合體；T鏈的轉(zhuǎn)化僅要求邊緣序列VirD2VirB和VirD4是膜蛋白，在農(nóng)桿菌與植物細胞之間形成通道，T鏈復合體經(jīng)該通道進入植物細胞質(zhì)，從植物細胞質(zhì)到植物細胞核由VirD2好VirE2蛋白的核定位信號介導

(ShengandCitovsky,1996).整合T鏈復合體進入植物細胞核后，會形成雙鏈，T-DNA編碼的基因在整合前會表達，被稱為瞬時表達(Kapilaetal.,1997).不清楚雙鏈的形成發(fā)生于整合前還是整合后，人們認為整合從左邊緣開始(Konczetal.,1994).整合可能由宿主DNA復制和修復機制中的酶介導，插入位點是隨機的(Konczetal.,1994)，有人提出VirD2andVirE2可能參與整合(Rossietal.,1996).附著

細菌附著植物細胞壁是轉(zhuǎn)化的前提條件；農(nóng)桿菌從植物傷口進入植物體，在植物體汁液中繁殖并附著到植物細胞壁上(Zambryski,1992)，有學者認為農(nóng)桿菌染色體編碼的基因chvA、chv、pacA、att和植物細胞表面受體（包括蛋白和糖）參與細菌的附著(ShengandCitovsky,1996)ChvA、ChvB、ChvC農(nóng)稈菌附著功能有關(guān)，這三個基因突變使農(nóng)桿菌與植物細胞的附著率下降10倍；ChvB基因產(chǎn)物催化合成β-1,2-葡聚糖，由ChvB調(diào)控的β-1,2-葡聚糖可能在農(nóng)桿菌附著過程中起關(guān)鍵作用；ChvA編碼產(chǎn)物與多糖從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運胞外有關(guān)。ExoC

與環(huán)化葡聚糖和琥珀酸多聚糖的合成有關(guān)，ExoC基因突變，農(nóng)桿菌不能合成環(huán)化的β-1,2-葡聚糖，細菌不能附著在植物細胞上，無致瘤能力。Cel

與細菌表面纖維絲的合成有關(guān)，Cel基因突變體不能合成纖維素細絲，細菌附著到植物細胞表面后容易被水洗脫。Att影響農(nóng)桿菌細胞表面蛋白的合成，Att突變體缺少一種34kD和38kD的多肽，這些多肽是細胞外膜和細胞周質(zhì)蛋白，影響農(nóng)桿菌附著。

三、植物基因表達載體tmrtmstmtT-DNALBRBvirTi質(zhì)粒野生型Ti質(zhì)粒的缺點:Ti質(zhì)粒分子量過大，難操作；

Onc基因致瘤onc改造：除去ONC基因安裝大腸桿菌復制子；安裝植物細胞選擇標記

一元載體系統(tǒng)也稱共整合載體(co-integratedvector),順勢載體(cis-vector)

卸甲載體中間載體一元載體系統(tǒng)卸甲載體:切除T-DNA中的Onc基因，稱disarmedvector；作用：提供vir功能virori冠癭堿分解代謝LB卸甲Ti質(zhì)粒經(jīng)典卸甲載體：pGV3850

T-DNA邊界區(qū)，胭脂堿合成酶基因(nos)；

T-DNA以外的全部序列；

T-DNA缺失部分被pBR322序列(含Ampr)取代pBR322nosvirpGV3850中間載體(intermediatevector)

大腸桿菌的克隆載體(如pBR322),應是多拷貝小質(zhì)粒。特征:

含與卸載質(zhì)粒T-DNA區(qū)同源的序列，可與卸載質(zhì)粒T-DNA高頻地同源重組；具有細菌選擇標記，便于篩選共整合質(zhì)粒；有bom位點，便于結(jié)合轉(zhuǎn)移；含有植物選擇標記，如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Npt-II)；含單一的限制性內(nèi)酶位點；植物的啟動子。作用：

用于克隆目的基因；通過同源重組機制將目的基因整合到卸甲載體的T－DNA上；提供T－DNA邊緣序列共整合轉(zhuǎn)化程序基礎(chǔ)：農(nóng)桿菌與大腸桿菌之間可以高效地接合轉(zhuǎn)移；Tra基因群功能T-DNApBR322oriNPTII

(Kmr

)大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌篩選標記農(nóng)桿菌篩選標記多克隆位點重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌農(nóng)桿菌細菌接合T-DNA區(qū)同源整合農(nóng)桿菌感染植物根部細胞T-DNA區(qū)整合在植物細胞基因組上三親株雜交(triparentalmating)

通過細菌結(jié)合轉(zhuǎn)移機制將中間載體導入農(nóng)桿菌

農(nóng)桿菌菌株：

受體；卸甲Ti質(zhì)粒；農(nóng)桿菌復制起點大腸桿菌：

輔助質(zhì)粒；提供Tra功能和Mob功能；大腸桿菌復制起點大腸桿菌：

中間載體；穿梭質(zhì)粒；bom位點；E.coli復制起點、廣譜復制起點pRK2021Tra,mob+

E.coliKm

E.coli

pMon200bom+Spc/StrpRK2021pMon200pTiB6S3-SEbom+Spc/StrKmLBRBYFG農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌三親株雜交三親株雜交TriparentalMatingSpc壯觀霉素Str鏈霉素Km卡那霉素pRK2021—結(jié)合轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒，E.coli復制子pMON200—中間載體，E.coli和農(nóng)桿菌復制子雙元載體系統(tǒng)T-DNA與Vir基因位于兩個獨立的質(zhì)粒上，通過反式作用激活T-DNA轉(zhuǎn)移，稱反式載體(transvector)輔助質(zhì)粒virLBRB微型Ti質(zhì)粒微型Ti質(zhì)粒(mini-Tiplasmid):

T-DNA邊界序列廣譜質(zhì)粒復制位點，如RriV

原核和真核選擇標記克隆位點輔助質(zhì)粒(helperplasmid):缺失T-DNA區(qū)段的Ti質(zhì)粒，本身喪失致瘤功能，相當于卸載Ti質(zhì)粒。主要作用是提供Vir基因功能。經(jīng)典雙元載體Bin19:

pTiT37的左右邊界序列；Npt-II基因；LacZ基因；多克隆位點；廣泛宿主質(zhì)粒Rk2的復制和轉(zhuǎn)移的起始位點優(yōu)點：質(zhì)粒小、宿主廣;帶有EcoRI、BamHI、HindIII、SstI、KpnI、SmaI、XbaI及SalI組成的多克隆位點;可以進行藍白斑篩選;可以直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(凍融法)四、植物基因轉(zhuǎn)化程序基因構(gòu)建農(nóng)桿菌菌株受體植株組培體系植物基因轉(zhuǎn)化植物基因轉(zhuǎn)化程序

培養(yǎng)純化農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌菌液預培養(yǎng)植物材料植物材料

共培養(yǎng)

→抑菌和選擇培養(yǎng)↓芽分化↓再生植株分子鑒定表型篩選田間試驗遺傳穩(wěn)定性研究感染1.基因構(gòu)建啟動子目的基因Nos3`LBMCSnosPNpt-IInos3’RBBin19微型Ti質(zhì)粒EcoRIKpnISmaIBamHIXhaISatIHindIIILB啟動子目的基因Nos3`nosPNpt-IInos3’RB

大腸桿菌克隆重組質(zhì)粒

農(nóng)桿菌工程菌株重組微型Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化測序鑒定轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌卸甲Ti質(zhì)粒LBPNptIIterP目的基因terRBvir農(nóng)桿菌重組微型Ti質(zhì)粒-70℃20%甘油保存植物基因轉(zhuǎn)化前期研究中，學者們構(gòu)建了一些載體,主要是雙元載體(HellensandMullineaux,2000)。這些載體的應用不依賴于植物材料，許多可選擇的載體。但前期研究中僅有幾種農(nóng)桿菌菌株在植物基因轉(zhuǎn)化中得到開發(fā)利用(AndersonandMoore,1979)。載體和菌株的選擇對轉(zhuǎn)化效率會產(chǎn)生一定的影響，有時候，某一物種的轉(zhuǎn)化只能借助個別的載體和菌株農(nóng)桿菌菌株A281(Komarietal.,1986)具有超強的“毒性”有更寬的宿主，和更高的轉(zhuǎn)化效率(Komari,1989)。該菌株特性與所含質(zhì)粒pTiBo542有關(guān)建立在pTiBo542基礎(chǔ)上的兩個轉(zhuǎn)化系統(tǒng)得到開發(fā)；EHA101(Hoodetal.,1986)EHA105(Hoodetal.,1993)都攜帶卸載pTiBo542EHA105所攜帶的微型Ti質(zhì)粒含pTiBo542的virB,virC,virG(Komari,1990)這兩菌株在轉(zhuǎn)化各種植物中都表現(xiàn)出很高的轉(zhuǎn)化效率額外的virE、virG的拷貝的存在有利于轉(zhuǎn)化率的提高(Srivatanakuletal.,2000;Parketal.,2000).virGN54D(突變的VirG)在農(nóng)桿菌中組成性表達，較野生型菌株有更高的轉(zhuǎn)化效率(VanderFitsetal.,2000)。當該基因在質(zhì)粒存在多拷貝時可進一步增加轉(zhuǎn)化效率。virGN54D不需要誘導。Hieietal.(1994)和Dongetal.(1996)對pIG121Hm與pTOK233對水稻的轉(zhuǎn)化率進行了比較：容易轉(zhuǎn)化的物種，pIG121Hm與pTOK233轉(zhuǎn)化率差不多，對難轉(zhuǎn)化的物種轉(zhuǎn)化率相差很多pIG121Hm:aderivativeofthemostcommonlyusedvectorspBI121pTOK233:asuper-binaryvector

植物細胞具有全能性，在離體培養(yǎng)條件下，通過誘導有可能分化，獲得再生植株。

植物細胞、組織完整植株2.植物基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)離體培養(yǎng)植物材料選擇外植體選擇培養(yǎng)基選擇激素選擇對抗菌素敏感性試驗外植體：葉、莖、根、塊莖、子葉、上胚軸、下胚軸、成熟與未成熟胚、培養(yǎng)細胞外植體和基因型是植物基因轉(zhuǎn)化中非常重要的影響因子

選擇旺盛分裂，將要分裂，有能力再生植株的材料原因：整合需要復制機制中的酶，這些酶在細胞分裂時活性最高；轉(zhuǎn)化株系的再生也需要細胞分裂學者們認為轉(zhuǎn)化需要植物具有傷口(LippincottandLippincott,1975).轉(zhuǎn)化強烈依賴植物的損傷響應（細胞增殖和再生的生物學基礎(chǔ)）對難轉(zhuǎn)化的雙子葉植物，單子葉植物成熟與未成熟胚是很好的材料；未成熟胚的生理狀態(tài)很重要，仔細選擇胚的發(fā)育階段允許細菌進入產(chǎn)生誘導Vir基因表達的信號使宿主細胞進入瞬時感受態(tài)，旺盛分裂不同植物對受傷的響應是不同的，未必能引發(fā)細胞分裂損傷響應不活躍的植物，可選擇未成熟的材料做外植體（子葉、胚軸）,2000;ZupanandZambryski,1995;Zambryski,1992;ShengandCitovsky,1996;HooykaasandBeijersbergen,1994).形成可溶性蛋白,Gaoetal.野生型Ti質(zhì)粒的缺點:再生植株27白楊瘤＋pTi-27農(nóng)桿菌與大腸桿菌之間可以高效地接合轉(zhuǎn)移；Vir區(qū)基因的活化誘導物的使用EHA101(Hoodetal.NCPPB1001葡萄瘤＋pTi1001VirA蛋白的胞質(zhì)區(qū)有自激酶(autokinase)的功能,可在保守的組氨酸殘基上磷酸化，VirA蛋白被激活。pTiT37的左右邊界序列；常規(guī)程序：共培養(yǎng)；適于細胞增殖和植株再生的培養(yǎng)基組培技術(shù)在準備材料上也很重要,植物基因轉(zhuǎn)化常用組培苗做材料，外植體常培養(yǎng)于愈傷誘導培養(yǎng)基上，組培苗常是良好的轉(zhuǎn)化起始材料。對同一來源的材料要選擇細胞，如用愈傷做轉(zhuǎn)化的材料，可在解剖鏡下選擇好的愈傷。這種選擇會影響轉(zhuǎn)化效率這種培養(yǎng)條件下的外植體包含活躍分裂的細胞或即將分裂的細胞植物材料通常預培養(yǎng)在誘導愈傷的培養(yǎng)基上；共培養(yǎng)時植物材料處于脫分化過程（損傷誘導或激素誘導作用）轉(zhuǎn)化細胞經(jīng)胚胎發(fā)生、器官發(fā)生再生植株基因型會影響轉(zhuǎn)化效率，有的栽培品種更容易轉(zhuǎn)化Forexample,callusculturesfrommatureseedsarethematerialofchoiceforeasycultivarsofJaponicarice,suchasNipponbare,andimmatureembryosarethebestchoiceforIndicacultivars外植體的預培養(yǎng)預培養(yǎng)時間一般2-3天，因材料而異，促進細胞分裂，對田間材料起馴化作用，使其適應離體培養(yǎng)條件。3.侵染與共培養(yǎng)農(nóng)桿菌培養(yǎng)：常用培養(yǎng)基：LB、YEB、YEM；溫度：25-30℃（28℃）2-3天（固體）/1-2天（液體）；菌的活化：選擇培養(yǎng)基上劃線挑取單菌落→液體培養(yǎng)/選擇抗菌素工程菌侵染懸浮液的制備：12-24h培養(yǎng)→對數(shù)生長期4000rpm離心收獲細胞，加入植物誘導愈傷或芽分化培養(yǎng)基，使光密度至0.1~0.5OD,作為接種工程菌液。1OD（600nm)=8x108用植物生長培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)幾小時再接種有利于轉(zhuǎn)化。水稻：1.0×108~1.0×1010(AldemitaandHodges,1996;Dongetal.,1996;Hieietal.,1994)玉米：5.0×108and2.0×109cfu/mlformaize(Ishidaetal.,1996).侵染時間：一般數(shù)秒到數(shù)分鐘，不超過30分鐘。菌液濃度OD0.05-0.7,對農(nóng)桿菌敏感的植物用較低的濃度，較短的時間。濾紙吸去過量的菌體→共培養(yǎng)Co-cultivationisadynamicstep,inwhichatleastthreeimportanteventsaretakingplace;plantcellsaredividinganddedifferentiatingunlesstheyarealreadyfullydedifferentiated,bacteriaarealsodividingfurther,T-DNAisbeingtransferredfrombacteriatoplantcells.共培養(yǎng)培養(yǎng)基影響轉(zhuǎn)化率,選擇促進細胞活躍分裂的培養(yǎng)條件菌液侵染↓共培養(yǎng)植物、細菌細胞分裂；整合共培養(yǎng)植物誘導愈傷培養(yǎng)基或芽分化培養(yǎng)基，一般在固體培養(yǎng)基上進行。要求：

外植體細胞分裂

農(nóng)桿菌在切口生長共培養(yǎng)時間:農(nóng)桿菌附著16h后才能發(fā)生轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)時間2-7天，因植物材料而異。共培養(yǎng)時間過長植物細胞會因農(nóng)桿菌毒害而死亡。依據(jù)獲得轉(zhuǎn)化愈傷頻率或轉(zhuǎn)化不定芽頻率而定。農(nóng)桿菌增殖適度:農(nóng)桿菌增殖不良，切口處只有很少的農(nóng)桿菌生長，轉(zhuǎn)化機率很小，過渡生長引起外植體褐化死亡，應適度。Vir區(qū)基因的活化誘導物的使用

農(nóng)桿菌培養(yǎng)時加AS，制備工程菌侵染液使用前4-6小時；在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加AS，一般農(nóng)桿菌附著16小時后才會發(fā)生轉(zhuǎn)化；農(nóng)桿菌培養(yǎng)和共培養(yǎng)時都加AS與甜菜堿（1mmol/L)或脯氨酸（1umol/L)同時加入，對Vir基因活化有協(xié)同作用。50~200uMAS+100mg/L抗壞血酸可以防止AS氧化。乙酰丁香酮（acetosyringone,AS)羥基乙酰丁香酮（hydroxyacetosyringone,OH-AS）誘導物使用的pHpH5.0-5.6時，Vir基因的誘導達到最高水平，pH改變0.3時對多數(shù)植物的轉(zhuǎn)化率有明顯的影響。溫度VirD、VirG基因的活化受溫度的影響，必須低于28℃。誘導Vir基因表達的最佳溫度在15℃~25℃之間農(nóng)桿菌培養(yǎng)基pH7.2,植物組織培養(yǎng)基pH5.8(MS高壓滅菌后pH下降0.3)T鏈轉(zhuǎn)移在19℃最活躍農(nóng)桿菌最佳生長溫度28°C~30°C組培溫度25°C左右有研究報道菜豆和煙草轉(zhuǎn)化中共培養(yǎng)在22℃時轉(zhuǎn)化率最高共培養(yǎng)時要平衡T鏈轉(zhuǎn)移，農(nóng)桿菌和植物細胞活力對溫度的要求Dillenetal.(1997)reportedthattransientexpressionofthegusdeliveredbyAgrobacteriumtoPhaseolusacutifoliusandN.tabacumwashighestat22°Canddecreaseddramaticallyabovethattemperature.Thetemperatureofco-cultivationshouldbecarefullyadjustedtobalancetheactivityoftheT-DNAtransfermachineryandtheviabilityofboth,theplantcellsandAgrobacterium.Inrice,theefficiencyoftransformationwashighbetween22°Cand28°C(Hieietal.,1994).pH值和滲透勢影響轉(zhuǎn)Vir基因表達冠廮堿醛縮糖增加Vir基因表達外源Ca+濃度明顯影響轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中添加酵母提取液；培養(yǎng)基中的糖和高濃度的肌醇可以促進Vir基因的表達。Duringco-cultivationotherfactors,suchasanacidicpH(Alt-Moerbeetal.,1988;Turketal.,1991)andhighosmoticpressure(Usamietal.,1988),havealsobeenreportedtobeimportantfortheexpressionofvirgenes.Veluthambietal.(1989)foundthatopinesstimulatedtheinductionofvirgenes.Shimodaetal.(1990)andCangelosietal.(1990)reportedthatagroupofaldoses,includingd-glucoseandsomenon-catabolisablesugars,suchas2-deoxy-d-glucoseand6-deoxy-d-glucose,markedlyenhancedtheexpressionofvirgenes.Theeffectsofsugarswereclearwhenlevelsofphenolicinducerswerelimited.Inaddition,Montoroetal.(2000)reportedthatexogenouscalciumconcentrationsignificantlyaffectedgenetransferfromAgrobacteriumtocellsofrubbertree(Heveabrasiliensis).共培養(yǎng)后

(1)選擇和增殖轉(zhuǎn)化細胞

(2)消除農(nóng)桿菌

(3)再生植株抗菌素抑制農(nóng)桿菌:羧芐青霉素頭孢類抗菌素抗菌素的選擇影響轉(zhuǎn)化率4.選擇轉(zhuǎn)化細胞選擇壓、非轉(zhuǎn)化細胞對轉(zhuǎn)化細胞構(gòu)成脅迫，可能對轉(zhuǎn)化細胞有負面影響。組培條件可能有重要影響

如，培養(yǎng)基成分，繼代培養(yǎng)程序

常用選擇標記：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶：提供轉(zhuǎn)化細胞對卡那霉素抗性、G418抗性潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶：提供對潮霉素抗性Npt-II(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶/氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶）

來自Tn5轉(zhuǎn)座子通過酶促磷酸化使氨基糖苷類抗菌素失活，

對茄科植物煙草、馬鈴薯、番茄等特別有效，對豆科植物和單子葉植物效果不佳。裸子植物相關(guān)報道很少(Tzfiraetal.,1998)

落葉松和美國五針松(LarixkaempferiTxL.decidua,Levéeetal.,1997andwhitepinePinusstrobusL.,Levéeetal.,1999).銀杏：獲得轉(zhuǎn)化愈傷五、植物轉(zhuǎn)基因研究進展Embryoniccelllinespreparedfromzygoticembryoswerethetissuesinfected.transformedcalluswasobtainedfromexcisedembryosinfectedwithAgrobacterium(Dupréetal.,2000).雙子葉植物

木本植物楊樹GenesrecentlyintroducedintoPopulusincludeglutaminesynthetasegene(Gallardoetal.,1999),genesinvolvedinflowerdevelopment(Rottmannetal.,2000)andherbicideresistance(Confalonierietal.,2000).桉樹

Typically,leaforstemsegmentsarepreparedfromplantsgrownintissueculturevessels,preculturedonacallusinductionmediumandinfectedwithAgrobacteriumEucalyptuscamaldulensiswastransformedwithaninsect-resistancegeneandaherbicide-resistancegenebyinfectingexplantsfromcotyledonsandhypocotylswithAgrobacterium(Harcourtetal.,2000).果樹日本柿子梨蘋果獼猴桃葡萄柑橘胡桃Examplesare:astresstolerancegeneinJapanesepersimmon(DiospyroskakiThumb.,Gaoetal.,2000);adiseaseresistancegeneinpear(PyruscommunisL.,Reynoirdetal.,1999);agenethataffectsrootingofapplerootstock(Malusdomestics,Zhuetal.,2001);anddiseaseresistancegenesinkiwifruits(Actinidiadeliciosa,Kobayashietal.,2000)andingrapevine(Vitisrupestris,Spielmannetal.,2000).Leafsegmentswerethestartingmaterialsinmostofthecases.Improvementoftransformationwasreportedincitrus(Ghorbeletal.,1999;LuthandMoore,1999;Yangetal.,2000b),inwhichepicotylswereinfectedwithAgrobacterium,andinwalnut(Juglansregia),inwhichsomaticembryoswerethetargettissues(Tangetal.,2000).豆科植物

大豆Attemptsattransformationoflegumespeciesweremainlyaimedatdevelopmentandimprovementofthemethodology.Transformationofsoybean(GlycinemaxMerril.)mediatedbyAgrobacteriumhasbeendifficultforalongtimebutappearsrecentlytobewellestablished.Targettissueswerecotyledonarynodes(DonaldsonandSimmonds,2000),immaturecotyledonaryexplants(Yanetal.,2000),maturecotyledonaryexplants(Zhangetal.,1999;Clementeetal.,2000),embryogeniccalliorgerminatingseeds(Kisakaetal.,2000).瓜爾豆豌豆木豆四季豆鷹嘴豆花生刺槐Transformationofguar(CyamopsistetragonolobaL.,Joersboetal.,1999),pea(PisumsativumL.,Nadolska-OrczykandOrczyk2000;Polowicketal.,2000;Perrinetal.,2000),pigeonpea(CajanuscajanL.,Geethaetal.,1999),kidneybean(PhaseolusvulgarisL.,Kisakaetal.,2000),chickpea(CicerarietinumL.,Krishnamurthyetal.,2000)andpeanuts(ArachishypogaeaL.,SharmaandAnjaiah,2000)havealsobeenreported,andinfectedtissuesweresimilartothoseusedinsoybean.Transgenicplantsofaleguminoustree,Robiniapseudoacacia,wereobtainedfromleafandstemsegmentsinfectedwithAgrobacterium(Igasakietal.,2000).茄科植物煙草矮牽牛番茄馬鈴薯茄子Tobacco(N.tabacumL.andotherspecies),petunia(Petuniahybrida),tomato(LycopersiconesculentumMill.)andpotato(Solanumtuberosum)aretheplantsmostfrequentlyhandledinstudiesinplantmolecularbiologyandbiotechnology.Theso-calledleafdisktransformationmethodwasfirstdevelopedforthesespecies,whicharestilltransformedbyessentiallytheoriginalmethodofHorschetal.(1985).Occasionally,methodimprovementsforotherspeciesinthefamily,suchaseggplant(Solanummelongena,Hanyuetal.,1999),havebeenreported.十字花科擬南芥大白菜洋白菜花椰菜油菜豆瓣菜ThereisnoquestionthatArabidopsisisthespeciesthatismostfrequentlytransformedinthisfamily,andinplantatransformationisthemethodofchoice.Transformationofotherspeciesinthefamilyislessstraightforward,andanumberofstudiesofimprovementshavebeencarriedout.RecentexamplesincludetransformationofcotyledonaryexplantsofChinesecabbage(BrassicacampestrisL.ssp.pekinensis,Zhangetal.,2000)andcabbage(BrassicaoleraceaL.var.capitata,PiusandAchar,2000);leafdisksofbroccoli(BrassicaoleraceaL.var.italica,Henzietal.,2000);etiolatedhypocotylsofBrassicanapus(Schr?der-Pontoppidanetal.,2000);andcalliofwatercress(Rorippanasturtium-aquaticum,Jinetal.,1999).工業(yè)及藥用植物（IndustrialCropsandMedicinalPlants)

棉花Cottonisapopularsubjectofstudiesinbiotechnology,andinsect-resistant,disease-resistantorherbicide-resistanttransgenicshavebeenobtainedfromhypocotyls,cotyledonsorshoottipsinfectedwithAgrobacterium(Wilkinsetal.,2000).洋麻橡膠樹咖啡罌粟花菱草毛地黃薄荷王不留行青蒿寬葉薰衣草甜瓜Infectedtissuesinsuccessfultransformationsrecentlycarriedoutforthedevelopmentofgenetransfermethodsinotherspecieswere:shootapexofkenaf(Hibiscuscannabinus,Srivatanakuletal.,2001);calliofrubbertree(Heveabrasiliensis,Montoroetal.,2000)andcoffee(Coffeacanephora,Hatanakaetal.,1999);cotyledonsofopiumpoppy(Papaversomniferum,ParkandFacchini,2000b)andCaliforniapoppy(EschscholziacalifornicaCham.,ParkandFacchini,2000a);leaforstemsegmentsoffoxglove(DigitalispurpureaL.,Kogaetal.,2000b),Menthaspecies(Krasnyanskietal.,1999;Niuetal.,2000;Diemeretal.,1999),Vaccariapyramidata(Kogaetal.,2000a),ArtemisiaannuaL.(Chenetal.,2000)andLavandulalatifolia(Nebaueretal.,2000);andsomaticembryosofcasaba(Manihotesculenta,Sarriaetal.,2000).其它雙子葉植物

冰葉日中花大牽牛花生菜胡蘿卜夏堇（藍豬耳）

Transformationmethodshavebeendevelopedfortwoimportantmodelplants,iceplant(Mesembryanthemumcrystallinum),inwhichrootorhypocotyltissueswereinfectedwithAgrobacterium(Ishimaru,1999),andJapanesemorningglory(Pharbitisnil),inwhichimmaturezygoticembryosweretargeted(Onoetal.,2000).Otherinterestingstudiesincludeintroductionoftheiron-bindingproteinferritinintolettuce(Lactucasativa,Gotoetal.,2000)andenhanceddiseaseresistanceintocarrots(DaucuscarotaL.,TakaichiandOeda,2000),andmodificationofflowercolourinToreniafournieriLind.(Aidaetal.,2000).T-DNA兩端左右邊界為25bp的重復序列，稱為左邊界(BL)和右邊界(BR),該25bp邊緣序列屬保守序列

TGACACGATATATTGGCGGGTAAACT-DNA的轉(zhuǎn)移由邊緣序列決定，與T-DNA的其他基因和序列無關(guān)。返回用轉(zhuǎn)座子使T-DNA基因突變確定了這些基因的功能P32標記的Ti質(zhì)粒片段與腫瘤細胞polyA-RNA雜交，檢測到章魚堿型腫瘤有12個mRNA（8個為TL-DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，4個為TR-DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）；胭脂堿型腫瘤有13個mRNA。已知T-DNA的保守區(qū)轉(zhuǎn)錄6個mRNA,章魚堿型和胭脂堿型腫瘤中這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是相同，他們的轉(zhuǎn)錄方向和位置均已確定。共同點:T-DNA上每個基因都有各自的啟動子基因轉(zhuǎn)錄由植物RNA聚合酶II完成

T-DNA具有典型的真核生物RNA合成起始和終止調(diào)節(jié)信號，其5’端轉(zhuǎn)錄起始處有TATA和CAAT盒。同一條鏈上發(fā)現(xiàn)AATAAA加尾信號。返回激素合成酶的基因

Aux，后稱Tms(tumourmorphologyshoot)基因

Aux-1(Tms-1)，也稱Iam或IaaM基因，基因1色氨酸→吲哚乙酰胺(indoleacetamide,IAM)

Aux-2，也稱IaaH基因，基因2

吲哚乙酰胺（IAM）→吲哚乙酸(IAA)返回IaaH吲哚乙酰胺水解酶，催化色氨酸單加氧酶(tryptophanmono-oxygenase)催化

Cyt基因，突變引起易生根特性，固稱Tmr(tumourmorphologyroot)isopentenyl-AMP為細胞分裂素，該基因現(xiàn)稱ipt基因,基因4返回ipt基因編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(isopentenyltransferase)催化異戊烯基焦磷酸鹽（isopentenylpyrophosphate)AMP異戊烯基-AMP（isopentenyl-AMP)與環(huán)化葡聚糖和琥珀酸多聚糖的合成有關(guān)，ExoC基因突變，農(nóng)桿菌不能合成環(huán)化的β-1,2-葡聚糖，細菌不能附著在植物細胞上，無致瘤能力。廣泛宿主質(zhì)粒Rk2的復制和轉(zhuǎn)移的起始位點谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白/谷胱苷肽之間的親和力pTOK233:asuper-binaryvectortag也可以提高其融合蛋白的溶解度。50~200uMAS+100mg/L抗壞血酸可以防止AS氧化。同一條鏈上發(fā)現(xiàn)AATAAA加尾信號。Improvementoftransformationwasreportedincitrus(Ghorbeletal.EHA105所攜帶的微型Ti質(zhì)粒含pTiBo542的virB,virC,virG(Komari,1990)這兩菌株在轉(zhuǎn)化各種植物中都表現(xiàn)出很高的轉(zhuǎn)化效率且這種特性可以傳給融合蛋白。野生型Ti質(zhì)粒的缺點:VirE2編碼ssDNA結(jié)合蛋白，非特異結(jié)合任何ssDNA。,1999),pea(PisumsativumL.基因表達受IPTG控制4000rpm離心收獲細胞，加入植物誘導愈傷或芽分化培養(yǎng)基，使光密度至0.原核終止子,1986)具有超強的“毒性”有更寬的宿主，和更高的轉(zhuǎn)化效率(Komari,1989)。冠癭堿合成酶基因：根據(jù)冠癭堿合成酶編碼基因，Ti質(zhì)粒可分為：章魚堿型胭脂堿型農(nóng)桿堿型農(nóng)桿菌素堿型冠癭堿為特殊氨基酸衍生物，農(nóng)桿菌可利用冠癭堿做為氮源，植物細胞不能利用冠癭堿返回VirA植物受傷后會分泌化學信號，其中包括乙酰丁香酮（酚類化合物），VirA編碼產(chǎn)物位于細胞膜上，可能是乙酰丁香酮的受體。當乙酰丁香酮(AS)與VirA蛋白的TM-2區(qū)結(jié)合后，會使整個蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，其C端活化。VirA蛋白的胞質(zhì)區(qū)有自激酶(autokinase)的功能,可在保守的組氨酸殘基上磷酸化，VirA蛋白被激活。磷酸化的VirA蛋白具有轉(zhuǎn)移其磷酸基至VirG蛋白的一個天門冬氨酸殘基的能力，使VirG蛋白活化。VirG

VirG是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，C端有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。virG被virA誘導表達，之后它可以誘導其它Vir基因表達。VirA或VirG突變，農(nóng)桿菌完全失去毒性。返回VirD該基因座含4個開放讀碼框，其中兩個蛋白可能參與T-DNA轉(zhuǎn)移過程的起始，包括在T-DNA上產(chǎn)生單鏈缺口，之后共價結(jié)合到游離的DNA末端，這些蛋白可能對精確的T-DNA轉(zhuǎn)移負責。

VirD1首先與25bp邊界序列結(jié)合，使其松弛VirD2在邊緣序列特異位點剪切VirD2的功能：特異剪切，并與T鏈的5’端共價結(jié)合，使T鏈免受核酸酶的攻擊；VirD2C端含有核定位信號(nucleartargetingsequence),引導T鏈進入到植物細胞核。返回VirE

這個基因座編碼單鏈DNA結(jié)合蛋白，保護單鏈T-DNA，有助于T-DNA-單鏈DNA結(jié)合蛋白絲轉(zhuǎn)入植物細胞。VirE2編碼ssDNA結(jié)合蛋白，非特異結(jié)合任何ssDNA。包被T鏈形成核蛋白絲。功能：解折疊、保護VirBVirB操縱子由11個基因組成，絕大多數(shù)編碼跨膜蛋白和附膜蛋白。其中3個確定為膜外蛋白，一個為內(nèi)膜蛋白，這些蛋白可能在膜上形成通道。返回大腸桿菌基因表達系統(tǒng)

目的基因表達水平高，培養(yǎng)周期短；目前大多數(shù)外源基因都是以大腸桿菌為受體系統(tǒng)進行表達的，是迄今為止應用最廣泛的基因表達系統(tǒng)。5.2原核表達系統(tǒng)大腸桿菌質(zhì)粒表達載體：

大腸桿菌復制起點

原核啟動子

SD序列

選擇標記

多克隆位點

原核終止子

標簽T7啟動子：

T7噬菌體基因10的啟動子，不能被大腸桿菌RNA聚合酶識別和啟動；

T7RNA聚合酶特異性地啟動T7啟動子而不啟動其它大腸桿菌啟動子，合成RNA的效率比大腸桿菌聚合酶高許多倍，且較少發(fā)生轉(zhuǎn)錄終止；

宿主RNA聚合酶所進行的轉(zhuǎn)錄無法與之競爭，使細胞中幾乎所有的轉(zhuǎn)錄都由T7RNA聚合酶操縱，外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可達

rRNA的水平。pET載體要求的受體細胞野生型大腸桿菌不含T7RNA聚合酶基因。前期研究中，T7RNA聚合酶基因已被置于lacuv5啟動子的控制下，整合到大腸桿菌染色體上，構(gòu)建了能誘導表達T7RNA聚合酶的大腸桿菌菌株。含有上述特征的常用宿主細胞有BL21(DE3)和JM109(DE3)。BL21(DE3)菌株缺失細菌外膜蛋白酶ompT和蛋白酶lon，增加了外源蛋白的穩(wěn)定性。SD序列（轉(zhuǎn)譯起始序列）1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點，翻譯起始密碼子AUG上游能夠和16SrRNA3’端序列互補，是rRNA的識別與結(jié)合位點，命名為Shine-Dalgarno序列，簡稱SD序列，由3－9bp核苷酸組成的序列，即UAAGGAGGU或其中一部分，一般至少含AGGAGG序列中的4個堿基。mRNA5’——AGGAGGU——UUGACCU-AUG——UCCUCCA