DB11 T 379-2006 豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉 6-芐基腺嘌呤 2,4-滴 赤霉素 福美雙的測定

ICS67.080.20備案號：19170-2006DB北京市地方標準DB11/T379—20062,4-滴、赤霉素、福美雙的測定Determinationof4-chlorphenoxyaceticsodium,6-benzylaminopurine,2,4-D,gibberellicacidandthiramresiduesinsoybeansproutandmubeansprout2006-07-25發(fā)布2006-09-01實施北京市質量技術監(jiān)督局發(fā)布IDB11/T379—2006 124-氯苯氧乙酸鈉殘留量的測定 136-芐基腺嘌呤殘留量的測定 342,4-滴（2,4-二氯苯氧乙酸）殘留量的測定 55赤霉素殘留量的測定 76福美雙殘留量的測定 9DB11/T379—2006本標準由通州區(qū)質量技術監(jiān)督局提出。本標準起草單位：北京市海淀區(qū)產品質量監(jiān)督檢驗所（國家食品質量安全監(jiān)督檢驗中心）。本標準主要起草人：曹紅、金瑛、劉艷琴、許華、王浩、田艷玲、林立。1DB11/T379—20062,4-滴、赤霉素、福美雙的測定本標準規(guī)定了豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2,4-滴、赤霉素、福美雙的測定方法。本標準適用于豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤、2,4-滴、赤霉素、福美雙的殘留量分析。24-氯苯氧乙酸鈉殘留量的測定2.1原理試樣中的4-氯苯氧乙酸鈉用稀堿提取后，在酸性條件下用固相萃取柱將樣品中的4-氯苯氧乙酸吸附，使其與基體干擾物分離，再用甲醇洗脫并用高效液相色譜法測定，以保留時間定性，外標法峰面2.2試劑與材料2.2.1氫氧化鈉（AR）。2.2.2鹽酸（AR）。2.2.3磷酸（AR）。2.2.4冰醋酸（AR）。2.2.5甲醇（HPLC）。2.2.6氫氧化鈉溶液（0.01mol/L）：稱取0.40g氫氧化鈉，溶于水并稀釋至1000mL。2.2.7亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6g亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6·3H2O]溶于少量水中，并用水稀釋至2.2.8乙酸鋅溶液：稱取22.0g乙酸鋅[Zn(CH3COO)2]溶于少量水中，然后加入3mL冰醋酸并加水稀釋至100mL。2.2.9磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L）：稱取1.56g的磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）加水溶解，并定容至1000mL，用50%的磷酸溶液調節(jié)pH值至4.0。2.2.104-氯苯氧乙酸標準溶液：精密稱取4-氯苯氧乙酸（含量≥99%）0.1g(精確到0.0001g)，用甲醇溶解并移入100mL容量瓶中，稀釋至刻度。此溶液每毫升相當于1.00mg4-氯苯氧乙酸。臨用時甲醇稀釋濃度為每毫升相當于0.10mg4-氯苯氧乙酸。2.2.11固相萃取小柱（3mL/500mgODS-C18小柱，用時先經10mL甲醇洗脫活化，再用10mL水洗去殘留甲醇，保持萃取柱潤濕狀態(tài)待用。2.2.12本標準所用水為經純水制備系統(tǒng)制備后的水。2.3儀器與設備2.3.1高效液相色譜儀（帶紫外檢測器，配ZORBAXSBC18色譜柱）。2.3.2超聲波儀。2.3.3酸度計。2.3.4組織搗碎機。2.3.5Milli-Q純水制備系統(tǒng)。2.4分析步驟2.4.1試樣制備稱取搗碎混勻的豆芽樣品20g（精確至0.1g）于100mL容量瓶中，加入40ml氫氧化鈉溶液振搖，然后分別加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各5mL，混勻，超聲提取30min，用氫氧化鈉溶液稀釋至2DB11/T379—2006刻度，過濾。取50.0mL的濾液，用濃磷酸調pH至2.5，然后以3mL/min的流速通過活化的ODS-C18小柱。先用3.0mL水洗去水溶性雜質后，再用甲醇洗脫并定容至3.0mL，過0.45μm濾膜后，供液相色譜分析。2.4.2標準曲線的制備準確吸取每毫升相當于0.10mg的4-氯苯氧乙酸0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL4.00mg/L的標準使用液，供液相色譜分析。2.4.3色譜條件色譜柱：ZORBAXSBC18柱（4.6mm×250mm×5μm或相當型號色譜柱）。檢測波長：228nm。流動相：甲醇+0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（50+50）(V/V)。流速：1.0mL/min。柱溫：30℃。2.4.4測定吸取10.0μL標準使用液和試樣液分別注入液相色譜儀，按照2.4.3項條件進行檢測，以保留時間定性，標準曲線法定量。標樣及試樣圖譜見圖1及圖2。2.5計算按式（1）計算?！?.12…………X—試樣中4-氯苯氧乙酸鈉的含量，單位為毫克每千克（mg/kgA—從標準曲線上求出的試樣液中4-氯苯氧乙酸的質量，單位為微克(μgf—試樣的稀釋倍數(shù)；m—試樣的取樣量，單位為克（g1.12—4-氯苯氧乙酸轉換為4-氯苯氧乙酸鈉的系數(shù)。計算結果保留兩位有效數(shù)字。2.6精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。2.7檢測限在本試驗條件下，豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉的定量檢測限為0.10mg/kg。圖14－氯苯氧乙酸標樣色譜圖3DB11/T379—2006圖2豆芽樣品中4－氯苯氧乙酸色譜圖36-芐基腺嘌呤殘留量的測定3.1原理豆芽中殘留的6-芐基腺嘌呤經酸化甲醇提取后，高效液相色譜法測定，以保留時間定性，外標法峰面積定量。3.2試劑與材料3.2.1乙酸（AR)。3.2.3乙腈（HPLC）。3.2.4甲醇（HPLC）。3.2.5酸化甲醇溶液：每100mL甲醇+水（60+40）(V/V)中加入乙酸50μL，混勻。3.2.66-芐基腺嘌呤標準溶液：精密稱取6-芐基腺嘌呤0.1g（精確到0.0001g含量≥99.0%）于100mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度。此溶液每毫升相當于1.00mg6-芐基腺嘌呤。臨用時用甲醇稀釋濃度為每毫升相當于0.010mg6-芐基腺嘌呤。3.2.7固相萃取小柱（3mL/500mg）：ODS-C18小柱，用時先經10mL甲醇洗脫活化，再用10mL水洗去殘留甲醇，保持萃取柱潤濕狀態(tài)待用。3.2.8本標準所用水為經純水制備系統(tǒng)制備后的水。3.3儀器與設備3.3.1高效液相色譜儀（帶紫外檢測器，配ZORBAXSBC18色譜柱）。3.3.2Ultra-Turrax攪拌器。3.3.3離心機（4500r/min）。3.3.4旋轉蒸發(fā)儀。3.3.5組織搗碎機。3.3.6Milli-Q純水制備系統(tǒng)。3.4分析步驟3.4.1試樣制備稱取搗碎混勻的豆芽樣品10g（精確至0.1g）于50mL聚丙烯離心管中，加入15mL酸化甲醇溶液，用Ultra-Turrax攪拌器混勻3min,然后以4500r/min離心10min，上清液轉入100mL梨形瓶中，樣品再用15mL酸化甲醇溶液提取，再次離心，合并上清液。上清液用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)，以去除甲醇，剩余水相以3mL/min的流速通過活化的ODS-C18小柱，先用3.0mL水洗去水溶性雜質后，再用甲醇洗脫并定容至5.0mL，過0.2μm有機膜濾過后，供液相色譜分析。3.4.2標準溶液系列的配制準確吸取每毫升相當于0.010mg的6-芐基腺嘌呤0mL、0.20mL、0.40mL、0.80mL、1.0mL、4DB11/T379—20062.0mL、5.0mL于25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。配制成濃度依次為0mg/L、0.08mg/L、0.16mg/L、0.32mg/L、0.40mg/L、0.80mg/L、2.00mg/L的標準溶液系列，供液相色譜分析。3.4.3色譜條件色譜柱：ZORBAXSBC18柱（4.6mm×250mm×5μm或相當型號色譜柱）。檢測波長：267nm。流動相：甲醇+乙腈+1%乙酸溶液（60+5+35）(V/V)。流速：1.0mL/min。柱溫：30℃。3.4.4測定準確吸取10.0μL標準系列溶液和試樣溶液分別注入液相色譜儀中，按照3.4.3條件進行檢測，以保留時間定性，峰面積外標法定量。標樣及試樣圖譜見圖3及圖4。3.5計算按式（2）計算?！璛—試樣中6-芐基腺嘌呤的含量，單位為毫克每千克（mg/kgA—從標準曲線上求出的試樣溶液中6-芐基腺嘌呤的質量，單位為微克(μgf—試樣的稀釋倍數(shù)；m—試樣的取樣量，單位為克（g計算結果保留兩位有效數(shù)字。3.6精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。3.7檢測限在本試驗條件下，豆芽中6-芐基腺嘌呤的定量檢測限為0.02mg/kg。606-benzylaminopurine504030200圖36－芐基腺嘌呤標樣色譜圖5DB11/T379—20060mAU080608060402006-benzyl6-benzylaminopurine1234圖4豆芽樣品中6－芐基腺嘌呤色譜圖42,4-滴（2,4-二氯苯氧乙酸）殘留量的測定4.1原理試樣中2,4-滴用有機溶劑提取，用三氟化硼甲醇溶液將2,4-滴衍生成2,4-滴甲酯，液-液萃取，凝膠滲透色譜凈化除去干擾物質，以氣相色譜電子捕獲檢測器測定。根據(jù)色譜峰保留時間定性，外標法峰面積定量。4.2試劑與材料4.2.1乙腈（AR）。4.2.2甲醇（AR）。4.2.3正己烷（AR）。4.2.4環(huán)己烷（AR）。4.2.5乙酸乙酯（AR）。4.2.6pH2的酸性水溶液：用50％稀硫酸調節(jié)水的pH為2。4.2.7氯化鈉（AR）。4.2.850g/L氯化鈉溶液。4.2.9無水硫酸鈉：650℃灼燒4h后,保存于干燥器中。4.2.10三氟化硼乙醚溶液：47％(V/V)。4.2.11衍生劑(14％三氟化硼甲醇溶液)：量取29.5mL三氟化硼乙醚溶液，用甲醇定容至100mL。4.2.122,4-滴標準使用液：精密吸取1mL2,4-滴的甲醇標準溶液（濃度100μg/L），用甲醇溶解并定容至100mL。此溶液濃度為每毫升相當于1.00μg2,4-滴。4.2.13本標準所用水除另有規(guī)定外，均為蒸餾水。4.3儀器與設備4.3.1氣相色譜儀：配有電子捕獲檢測器。4.3.2凝膠滲透色譜凈化系統(tǒng)。4.3.3組織搗碎機。4.3.4恒溫水浴鍋。4.3.5旋轉蒸發(fā)器。4.3.6電動振蕩器。4.3.7頂空分析用20mL玻璃瓶，配套的鋁蓋和密封墊（或密封緊密的密封瓶）。4.4分析步驟4.4.1提取稱取搗碎混勻的豆芽樣品50.0g（精確到0.1g）于具塞錐形瓶內，加入20mL酸性水溶液和506DB11/T379—2006mL乙腈，振蕩提取30min，過濾，濾渣用20mL乙腈洗滌兩次,合并濾液于250mL分液漏斗中，于上述分液漏斗中加入15g氯化鈉，振蕩混勻，靜置40min，分層，提取乙腈層，用旋轉蒸發(fā)器除去乙腈，用5mL甲醇分次轉移至20mL頂空分析玻璃瓶中。4.4.2衍生化加5mL衍生劑于上述頂空分析玻璃瓶中，將玻璃瓶加蓋密封，在65℃水浴中保持45min后，取出玻璃瓶迅速置于冰浴中冷卻，將衍生反應液轉移至盛有10mL50g/L氯化鈉溶液的50mL具塞比色管中，用正己烷提取二次，每次5mL，合并有機相，經無水硫酸鈉脫水，旋轉蒸發(fā)器揮至近干，用乙酸乙酯:環(huán)己烷（1:1，V/V）定容至10mL。4.4.32,4-滴甲酯標準工作液的制備取5mL2,4-滴標準使用液，依4.4.2方法制備2,4-滴甲酯標準工作液，經無水硫酸鈉脫水，旋轉蒸發(fā)器揮至近干后，用正己烷準確定容至5mL。此溶液濃度為每毫升相當于1.00μg2,4-滴。4.4.4凝膠滲透色譜凈化選擇凝膠滲透色譜柱規(guī)格（200mm×22mmi.d.柱填料為BioBeadsS-X3200-400目，流動相乙酸乙酯:環(huán)己烷（1:1，V:V），流速為4.7mL/min，進樣量5mL，樣品收集時間11min～15min。衍生化后樣品按照上述條件凈化，將約20mL收集液旋轉蒸發(fā)至近干，用正己烷準確定容至5mL。4.4.5氣相色譜條件氣相色譜儀：附電子捕獲檢測器（ECD，Ni63）。色譜柱：HP-1MS石英毛細管色譜柱，φ30m×250μm×0.25mm。載氣:高純氮,純度＞99.99％。載氣流速：1.0mL/min。進樣方式：不分流。程序升溫：柱初始溫度50℃,保持1min，以25℃/min速率升溫至220℃,保持20min。進樣口溫度:250℃。檢測器溫度:300℃。4.4.6測定分別吸取2,4-滴經衍生化的標準工作液、試液各1.0μL注入氣相色譜儀,按照4.4.5的條件進行檢測，以保留時間定性，色譜峰面積外標法定量。標樣及試樣圖譜見圖5和圖6。4.5計算按式（3）計算。X=A×C×V×2×1000（3）式中:X——2,4-滴殘留量,單位為毫克每千克（mg/kgA——樣液中2,4-滴(衍生物)峰面積；A0——標準工作溶液中2,4-滴(衍生物)峰面積；C——標準工作溶液中相當于2,4-滴(衍生物)濃度,單位為微克每毫升(μg/mLm——取樣量，單位為克（gV——樣液的定容體積，單位為毫升（mL）。4.6精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10％。4.7檢測限7DB11/T379—2006在本試驗條件下，豆芽中2,4-滴的定量檢測限為0.002mg/kg。圖52,4-滴標樣色譜圖圖6豆芽樣品中2,4-滴色譜圖5赤霉素殘留量的測定5.1原理豆芽中赤霉素經提取后，先經乙酸乙酯液液萃取初步凈化，再利用凝膠滲透色譜（GPC）使目標化合物與基體干擾物分離，達到分離和凈化的目的。用反相高效液相色譜法—DAD檢測器進行色譜分析，采用標準物質的保留時間、輔助峰掃描光譜純度對照兩種方式對樣品峰進行定性，采用外標法以峰面積計算定量。5.2試劑與材料5.2.1甲醇（AR）。5.2.2丙酮（AR）。5.2.3乙酸乙酯（AR）。5.2.450％硫酸溶液(V/V)。5.2.5pH2.5的酸性水溶液：用50％稀硫酸調節(jié)水的pH為2.5。8DB11/T379—20065.2.6無水硫酸鈉（AR）。5.2.7冰乙酸（AR）。5.2.8固相萃取小柱：WatersSEP-PAK，用時先經10mL甲醇洗脫活化，再用10mL水洗去殘留甲醇，保持萃取柱潤濕狀態(tài)待用。5.2.9赤霉素標準儲備液：精密稱取赤霉素（含量≥99.0%）0.1g（精確到0.0001g），用甲醇溶解并定容至100mL。此溶液濃度為每毫升相當于1.00mg赤霉素。5.2.10本標準所用水除另有規(guī)定外，均為蒸餾水。5.3儀器與設備5.3.1高效液相色譜儀（配DAD檢測器）。5.3.2旋轉蒸發(fā)儀。5.3.3組織搗碎機。5.3.4電動振蕩器。5.3.5凝膠滲透色譜儀（GPC）。5.4分析步驟5.4.1試樣制備稱取搗碎后樣品50g（精確到0.1g）于錐形瓶中，加20mL蒸餾水和100mL丙酮，震蕩提取30min?；旌衔锝洸际下┒烦闉V，殘渣放回錐形瓶中，再用100mL丙酮震蕩提取15min，用布氏漏斗抽濾,之后分別兩次用50mL丙酮洗滌錐形瓶并倒在濾渣上，抽濾。將上述多次提取的丙酮-水提取液收集于1000mL圓底燒瓶中，在30℃水浴上，用旋轉蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)除去丙酮。剩下的試樣水溶液用濾紙過濾，用50mL蒸餾水洗滌燒瓶并通過同一濾器過濾，用20mL蒸餾水分別兩次洗滌濾紙。將濾液轉入燒杯中，用50%的硫酸溶液調至濾液pH為2.5±0.2。將樣液轉入250mL分液漏斗中，以少量蒸餾水洗滌燒杯。然后用150mL乙酸乙酯分3次提取樣液，收集乙酸乙酯提取液，并通過約15g無水硫酸鈉濾入250mL圓底燒瓶中，于30℃水浴中旋轉蒸發(fā)至干。用15mL環(huán)己烷+乙酸乙脂（1：1）(V/V)混合液充分溶解，準備待分析樣品溶液10mL，進入滲透色譜柱分離，作用時間13min，流速4.7mL/min。收集6min～13min的流出液。收集凝膠滲透色譜（GPC）流出液，于30℃水浴中旋轉蒸發(fā)至干，再用2mL甲醇溶解；用0.45μm有機膜過濾后，供液相色譜分析。5.4.2標準溶液系列的配制準確吸取標準儲備液0mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、5.00mL于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度。制成濃度依次為0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、500μg/mL的標準溶液，供液相色譜分析。5.4.3色譜條件色譜柱：ZORBAXSB-C18柱：5μm，4.6mm×250mm（或相當型號色譜柱）。流動相：甲醇＋水（55＋45）(V/V)(溶液用冰乙酸調pH3.6)。流速：0.6mL/min。柱溫：40℃。檢測波長：206nm。5.4.4測定分別吸取5.0μL標準使用液和試樣液注入高效液相色譜儀，按照5.4.3項條件進行檢測，采用標準物質的保留時間輔助峰掃描光譜純度對照兩種方式對樣品峰進行定性，采用外標法以峰面積計算定量。標樣及樣品中赤霉素圖譜分別見圖7和圖8。5.5計算按式（4）計算。9DB11/T379—2006X=………………（4）X—樣品中赤霉素的含量，單位為毫克每千克（mg/kgC—樣品測定液中赤霉素的含量，單位為微克每毫升(μg/mLF—稀釋倍數(shù)；m—樣品量，單位為克（g）。計算結果保留兩位有效數(shù)字。5.6精密度在重復條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。5.7檢測限在本試驗條件下，豆芽中赤霉素的定量檢測下限為0.20mg/kg。圖7赤霉素標樣色譜圖圖8豆芽樣品中赤霉素色譜圖6福美雙殘留量的測定6.1原理豆芽中殘留福美雙與鹽酸-氯化亞錫在密封反應瓶中共熱放出二硫化碳，用氣相色譜法（FPD）測定，以保留時間定性，外標法峰面積定量。6.2試劑與材料DB11/T379—20066.2.1鹽酸（AR）。6.2.25mol/L鹽酸溶液：量取42mL鹽酸定容至100mL。6.2.3氯化亞錫（AR）。6.2.4二硫化碳（AR）。6.2.5二氯甲烷（AR）。6.2.6鹽酸-氯化亞錫溶液：稱取2gSnCl2·2H2O溶于100mL5mol/LHCl中。6.2.7處理水：經純水制備系統(tǒng)制備的去離子水煮沸數(shù)分鐘，冷卻后待用。6.2.8福美雙標準溶液：精密稱取福美雙（純度≥98.022.4mg，以二氯甲烷溶解，并移入100mL容量瓶中，稀釋至刻度。此溶液濃度為每毫升相當于224μg福美雙。6.3儀器與設備6.3.1氣相色譜儀：帶火焰光度檢測器（FPD）硫濾光片。6.3.2氣密注射器：100μL。6.3.3恒溫水浴或烘箱。6.3.4頂空瓶或具密封塞的250mL玻璃反應瓶。6.3.5組織搗碎機。6.3.6Milli-Q純水制備系統(tǒng)。6.4分析步驟6.4.1試樣制備稱取20g（精確到0.1g）經組織搗碎機勻漿處理的豆芽樣品放入反應瓶中，加處理水至30mL，加鹽酸-氯化亞錫溶液40mL，塞緊反口膠塞，用反應瓶架固定。將反應瓶置于80℃的烘箱中反應2小時，每隔0.5小時搖動1分鐘。反應完成后取出反應瓶，冷卻至室溫。抽取瓶內頂空氣體進行定量測6.4.2標準曲線的制備分別準確吸取1μL、5μL、10μL、50μL福美雙標準溶液于反應瓶中，瓶內福美雙的量分別為0.224μg、1.12μg、2.24μg、11.2μg，按照6