2.3 基因工程載體-人工染色體載體課件

第三節(jié)其他載體2012.092.3基因工程載體-人工染色體載體其他載體一、人工染色體二、植物基因工程載體三、動物基因工程載體2.3基因工程載體-人工染色體載體一、人工染色體2.3基因工程載體-人工染色體載體

人基因組十分龐大，約含4×109bp，建立和篩選人的基因組文庫，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）載體應(yīng)運(yùn)而生。YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(diǎn)(centromere)及復(fù)制起點(diǎn)等功能序列，可插入長度達(dá)200-500kb的外源DNA，導(dǎo)入酵母細(xì)胞可以隨細(xì)胞分裂周期復(fù)制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計劃的重要2.3基因工程載體-人工染色體載體1、酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC)2.3基因工程載體-人工染色體載體酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）◆酵母人工染色體是另一類酵母穿梭載體。具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因?！?/p>

YAC可以接受100-1000kb的外源DNA片段，這一特點(diǎn)使YAC成為人類基因組計劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進(jìn)了發(fā)展人類人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。2.3基因工程載體-人工染色體載體正常酵母人工染色體含有：*四膜蟲端粒（tel)*酵母自主復(fù)制序列（ARS)*酵母著絲點(diǎn)(CEN)*酵母的選擇標(biāo)記(TRP1、URA1)YAC載體2.3基因工程載體-人工染色體載體

thecapacitytoclonelargeexogenousDNAfragments(upto2Mb)hasmadeYACsavitaltoolinphysicalmapping

Thefunctionalelementsofayeastchromosome

2.3基因工程載體-人工染色體載體（1）著絲粒區(qū)（CEN）A

AGTCACGTG

TTGTTTCTGNTTTCCGAAAYAC的組成結(jié)構(gòu)酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列:78-86bpIIIIII由三個區(qū)組成2.3基因工程載體-人工染色體載體酵母端粒保守序列是(G4T2)n

重復(fù)序列。（3）復(fù)制起點(diǎn)（ORI）約100bp的自主復(fù)制序列（ARS）。（2）端粒（TEL）（真核生物中只有酵母菌有ARS）兩個端粒序列Tel。2.3基因工程載體-人工染色體載體位于SUP4

基因內(nèi)部。（4）克隆位點(diǎn)插入失活選擇：SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色；不失活的菌落是白色。142.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體2、細(xì)菌人工染色體（Bacterialartificialchromosome,BAC）2.3基因工程載體-人工染色體載體細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC）

◆

BAC載體是基于細(xì)菌的性因子(F因子)質(zhì)粒的一些特點(diǎn)構(gòu)建的。F因子在細(xì)菌接合時轉(zhuǎn)移1Mb的細(xì)菌染色體片段。將F因子經(jīng)基因工程改良構(gòu)成的BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。◆帶有外源片段的BAC載體在細(xì)菌細(xì)胞中通常僅單個拷貝，這一特點(diǎn)有利于保持DNA大分子，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不發(fā)生重組。BAC載體本身分子量小，具有氯霉素抗性選擇基因及多克隆位點(diǎn)。2.3基因工程載體-人工染色體載體Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNA.CMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistance.oriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumber.cosNisthecossitefromlphage.HindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinserted.Thetwopromotersarefortranscribingtheinsertedfragment.TheNotIsitesareusedforcuttingouttheinsertedfragment.2.3基因工程載體-人工染色體載體3、PAC載體2.3基因工程載體-人工染色體載體二、植物載體2.3基因工程載體-人工染色體載體PlantcloningvectorsTi質(zhì)粒:侵染廣泛的雙子葉植物T-DNA或T-區(qū)(T-region)：約20kb，包含?；诎`堿生化合成和冠癭瘤生長的基因，隨機(jī)地整合到植物染色體上。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：兩端具有25個堿基對的順向重復(fù)序列，但重復(fù)不是完全的。25個堿基對的序列稱為T-DNA的邊界序列(T-DNAbordersequence)。去除右邊界序列，將使T-DNA失去轉(zhuǎn)移和整合的功能；左邊界的缺失，對致瘤性無明顯影響。毒性區(qū)域即vir(virulence)區(qū)域:引起T-DNA轉(zhuǎn)移的區(qū)域。長度約35kb，和T-DNA處于不同位置2.3基因工程載體-人工染色體載體植物Ti質(zhì)粒載體2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）

T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時，從Ti質(zhì)粒上導(dǎo)入植物細(xì)胞的一段DNA。

T-DNA兩端各有一段25bp的重復(fù)序列(LB,RB)。T-DNA攜帶的致瘤基因是一些與激素合成有關(guān)的基因，由于激素合成基因使細(xì)胞處于不停的分裂狀態(tài)，形成冠癭瘤，不能進(jìn)行細(xì)胞分化。Ti質(zhì)粒改造后才能應(yīng)用于植物的基因工程。保留T-DNA兩端的末端序列，然后用外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不具有成瘤能力。2.3基因工程載體-人工染色體載體T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將細(xì)菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到這個區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組。Vir區(qū)的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制T-DNA轉(zhuǎn)移。2.3基因工程載體-人工染色體載體（2）Vir區(qū)（virolenceregion）Vir區(qū)段上的基因與T-DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的遺傳過程有關(guān)，區(qū)段上的基因能夠使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。Vir區(qū)段總長度大約35kb，由7個互補(bǔ)群組成，分別命名為VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。（3）Con區(qū)(regionsencodingconjugations)

該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。

（4）Ori區(qū)(originofreplication)

該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。2.3基因工程載體-人工染色體載體Ti質(zhì)粒分子受到信號分子的激活作用之后，virD基因編碼的一種核酸內(nèi)切酶，先在T-DNA的RB序列中的第3和第4堿基之間切開一個單鏈缺口，隨后在T-DNA同一條鏈的LB序列中切出第二個單鏈缺口。T-DNA便以單鏈形式釋放出來，并在RB序列的引導(dǎo)下定向地轉(zhuǎn)移到寄主植物細(xì)胞。在有關(guān)的植物細(xì)胞酶體系的催化作用下，合成互補(bǔ)鏈形成雙鏈形式的T-DNA分子。在一系列酶的參與下整合進(jìn)植物基因組。這種整合是一種非正常重組。T-DNA轉(zhuǎn)移的機(jī)制2.3基因工程載體-人工染色體載體2、Ti質(zhì)粒載體DisarmedTivectors（非致瘤載體）Cointegratevectors（共整合載體）Binaryvectors（雙元載體）2.3基因工程載體-人工染色體載體1）DisarmedTivectors去除T-DNA中的腫瘤基因在T-DNA中插入用于轉(zhuǎn)化植株篩選的遺傳標(biāo)記基因2.3基因工程載體-人工染色體載體IntermediatevectorsAsmallportionofT-DNAwassubclonedinaconventionalE.coliplasmidvector(i.e.pBR322)foreasymanipulation,producingintermediatevectorsIntermediatevectorsareincapableofreplicationinA.tumefaciensandalsolackconjugationfunctions.Transferofthemwasachievedusingatriparentalmating.2.3基因工程載體-人工染色體載體TriparentalmatingAnE.colistrainAcarryingahelperplasmidabletomobilizetheintermediatevectorintransTheE.colistrainBcarryingtherecombinantintermediatevectorA.tumefacienscarryingthedisarmedTiplasmid2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體3.BinaryvectorT-DNAdoesnotneedtobephysicallyattachedtotherestoftheTiplasmidUseseparateplasmidstosupplythedisarmedT-DNAandthevirulencefunctions2.3基因工程載體-人工染色體載體ThesmallplasmidcanbeusedtoinsertedforeigngeneWhenthetwoplasmidspresenttogetherinthesameA.tumefacienscell,theT-DNAcarriedbypBI121istransferredtotheplantchromosomalDNAbyproteinscodedbygenescarriedbypAL44042.3基因工程載體-人工染色體載體Ti質(zhì)粒及其衍生載體Ti質(zhì)粒是約200-500kb的環(huán)狀DNA分子，很難直接使用，故需對其加以改造，構(gòu)建出Ti質(zhì)粒的衍生載體系統(tǒng)，廣泛用作植物基因工程中的載體：（1）雙元載體(binaryvectors）如pBin19載體，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作為細(xì)菌選擇標(biāo)記，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作為植物的選擇標(biāo)記，pUC19的多克隆位點(diǎn)及α-互補(bǔ)顯色標(biāo)記（2）共整合載體(integratedvectors)2.3基因工程載體-人工染色體載體（1）雙元載體系統(tǒng)（binaryvector）具有兩個質(zhì)?！┧筚|(zhì)粒和Ti質(zhì)粒。（2）共整合載體（integratedvector）共整合載體系統(tǒng)包括在T-DNA上的激素合成區(qū)經(jīng)過突變后的Ti質(zhì)粒和中間載體兩部分。Ti質(zhì)粒的衍生載體2.3基因工程載體-人工染色體載體發(fā)根農(nóng)桿菌存在另一種質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒也可完成外源基因向植物的轉(zhuǎn)移工作。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植物細(xì)胞產(chǎn)生許多不定根，這種不定根生長迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根，也稱為發(fā)狀根，分別簡稱為毛根或發(fā)根，Ri質(zhì)粒為根誘導(dǎo)質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)很相似，可以分為T區(qū)、vir區(qū)、ori區(qū)和其它區(qū)域等幾個部分。Ri質(zhì)粒2.3基因工程載體-人工染色體載體T區(qū)與Ti質(zhì)粒的T-DNA十分相似：①T區(qū)的左右邊界序列。左右邊界上含有25bp的重復(fù)序列。②TL-DNA區(qū)。該區(qū)中含有與毛狀根形成有關(guān)的rolA、B、C、D基因群。③TR-DNA區(qū)。該區(qū)中含有與農(nóng)桿堿合成有關(guān)的基因（ags）和生長素合成有關(guān)的基因（tms1、

tms2）。ags基因在轉(zhuǎn)化的初期起著重要的作用，是不定根產(chǎn)生的關(guān)鍵Ri質(zhì)粒2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體CaMV克隆載體含1個約8kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子；用于十字花科和少數(shù)非十字花科的植物基因轉(zhuǎn)移；其感染對植物有害，不能直接做載體；CaMV的DNA在植物細(xì)胞中能高水平轉(zhuǎn)錄35SRNA，其啟動子是一強(qiáng)啟動子。構(gòu)建的含35S啟動子的系列克隆載體可在植物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)基因。2.3基因工程載體-人工染色體載體2.3基因工程載體-人工染色體載體三、動物載體2.3基因工程載體-人工染色體載體

質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細(xì)胞的載體。由于動物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒SV40（SimianVirus40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動物細(xì)胞中表達(dá)或試驗其功能、或作基因治療等。

2.3基因工程載體-人工染色體載體

猴病毒40（SV40）的基因組常用來作為克隆載體，把外源DNA轉(zhuǎn)入哺乳類細(xì)胞。猴病毒40是球形動物病毒，直徑40nm，呈20面體，有一個共價閉環(huán)的雙鏈DNA基因組，全長5244bp。它在猴腎中增殖。被SV40感染的細(xì)胞都會出現(xiàn)SV40的T抗原。早已證明完整的小鼠染色體β珠蛋白基因（包括所有的間插順序和兩側(cè)順序）整合在SV40中后，在被感染的猴腎細(xì)胞中都能正確地轉(zhuǎn)錄和翻譯。表明猴腎細(xì)胞的拼接系統(tǒng)能有效地處理小鼠β珠蛋白的初級轉(zhuǎn)錄本。2.3基因工程載體-人工染色體載體Cloningvectorsofanimalcell動物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物

5243bp共價閉合環(huán)狀分子感染率高，幾乎100％寄主細(xì)胞能被感染能提供完整的真核基因轉(zhuǎn)錄所需的成分侵染性具有寄主特異性改建：野生型最多只能包裝其基因組長度的1.05倍的

DNA分子其他：痘苗病毒DNA作載體，表達(dá)乙肝表面抗原用家蠶的核多角體病毒表達(dá)人α-干擾素2.3基因工程載體-人工染色體載體SV40作為克隆載體有其局限性：①SV40基因組的晚期功能區(qū)的裂解性，不利于外源DNA的重組和表達(dá)；②早期功能區(qū)與病毒的致癌性有關(guān)，使用時有顧慮；③重組DNA片段的大小受體限制。2.3基因工程載體-人工染色體載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，它有三個基因：gag-編碼病毒的核心蛋白；pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env-編碼病毒的被膜糖蛋白。有的逆轉(zhuǎn)錄病毒還帶有癌基因（vonc），即有的逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用。近年來，已設(shè)計構(gòu)建成一些缺陷型病毒（defectivevirus）使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為有用的基因載體，成功地把抗藥性基因轉(zhuǎn)入了人體造血前體細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)。2.3基因工程載體-人工染色體載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒是一類含RNA的病毒，進(jìn)入受體細(xì)胞后，RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA，通過兩端由數(shù)百bp組成的長末端重復(fù)序列，整合到染色體上，成為原病毒。只要將外源目的基因組入原病毒DNA的合適克隆位點(diǎn)，就能在感染的動物細(xì)胞中表達(dá)。2.3基因工程載體-人工染色體載體Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，因此不能合成自身的外殼，但它有識別外殼蛋白進(jìn)行包裝的信號（一段尚未鑒定的DNA順序）。用這種缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒去感染某種細(xì)胞株，這種細(xì)胞株包含有輔助病毒（helpervirus）。輔助病毒能合成蛋白外殼，但缺失了識別蛋白外殼進(jìn)行包裝的信號，因此它不能包裝成病毒顆粒。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞株后，逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進(jìn)入輔助病毒的外殼蛋白，成為病毒顆粒。這時把受感染的細(xì)胞同骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)，包裝在輔助病毒外殼蛋白中的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA，進(jìn)入骨髓細(xì)胞，病毒DNA插入宿主細(xì)胞基因組，基因的活性得到表達(dá)。這時，由于骨髓細(xì)胞里面沒有輔助病毒，所以整合進(jìn)宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒，不再有外殼蛋白可供包裝，因此也就無法增殖，而只能被“陷”在宿主基因組中，通過細(xì)胞分裂而傳給下一代子細(xì)胞。2.3基因工程載體-人工染色體載體分子克隆載體的選擇選擇克隆載體的幾個重要參數(shù)（1）實驗對象（2）實驗性質(zhì)（3）載體容量（4）合適克隆位點(diǎn)（5）載體的穩(wěn)定性（6）載體DNA制備的難易（7）外源基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點(diǎn)等2.3基因工程載體-人工染色體載體實驗對象（1）供體：遺傳背景與DNA特點(diǎn)等，其中包括染色體DNA大小，基因大小與結(jié)構(gòu)，堿基組成，目的基因的產(chǎn)物特點(diǎn)以及遺傳物質(zhì)的傳遞方式等。（2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質(zhì)的傳遞方式(包括人為的方法)，DNA限制修飾系統(tǒng)，DNA重組基因特點(diǎn)，基因產(chǎn)物修飾系統(tǒng)，即轉(zhuǎn)錄與翻譯后修飾系統(tǒng)。2.3基因工程載體-人工染色體載體實驗對象如常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。如：

E.coliDH5、

E.coliDH5α、

E.coliDH5αF’

1）

三者均有限制-修飾系統(tǒng)和重組基因缺陷，外源DNA可存活，且不發(fā)生重組2）

DH5α和DH5αF’都具有一個可供遺傳標(biāo)記lacZα檢測的遺傳背景3）

DH5αF’可供M13mp系列載體配套使用，M13病毒的感染需要F’的存在2.3基因工程載體-人工染色體載體1．當(dāng)一DNA片段插入終止子探針型載體pBU10的HindⅢ克隆位點(diǎn)后，重組質(zhì)粒仍可轉(zhuǎn)化E.coli(CmlsTcs)為CmlrTcr，為什么?可設(shè)計什么實驗證明其假設(shè)?2．當(dāng)一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出現(xiàn)兩類菌落，蘭色菌落和白色菌落。從白色菌落中分離純化的質(zhì)粒經(jīng)電泳檢查，均比原載體DNA分子大；但從蘭色菌落隨機(jī)分離的質(zhì)粒DNA卻有兩類，其中一類與載體大小相同，另一類卻與白色菌落中分離的質(zhì)粒大小相同。如何解釋這一實驗結(jié)果?可設(shè)計何種實驗證明你的解釋是正確的?3．當(dāng)把一外源DNA插入一克隆載體后，重組DNA分子轉(zhuǎn)化E.coli

細(xì)胞所獲得的重組子分子可根據(jù)其限制酶圖譜分為兩類，即這兩類轉(zhuǎn)化子中所含的重組DNA分子的限制酶圖譜不一樣，從這兩類轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離到的重組DNA分子可用限制酶回收插入的片段。而從這兩類轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液所分離到的DNA卻2.3基因工程載體-人工染色體載體不能用限制酶回收該片段。當(dāng)把同類轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液所分離到的DNA進(jìn)行復(fù)性分析時，DNA分子間不會發(fā)生復(fù)性，但把從不同類轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液分離到的DNA