《食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)》課件-項(xiàng)目一 試劑與培養(yǎng)基配制

1.pH指示劑的配制技術(shù)目錄/Contents1pH指示劑的配制技術(shù)分類物質(zhì)的量濃度溶液的配制01pH指示劑的配制分類1．酸堿指示劑指示溶液中H+濃度的變化，是一種有機(jī)弱酸或有機(jī)弱堿，其酸性和堿性具有不同的顏色。指示劑酸HIn在溶液中的離解常數(shù)Ka=[H+][In-]/[HIn]，即溶液的顏色決定于[In-]/[HIn]，而[In-]/[HIn]又決定于[H+]。01pH指示劑的配制分類2．金屬指示劑絡(luò)合滴定法所用的指示劑，大多是染料，它在一定pH下能與金屬離子絡(luò)合呈現(xiàn)一種與游離指示劑完全不同的顏色而指示終點(diǎn)。比如淀粉指示劑。01pH指示劑的配制分類3．氧化還原指示劑為氧化劑或還原劑，它的氧化形與還原形具有不同的顏色，在滴定中被氧化（或還原）時(shí)，即變色，指示出溶液電位的變化。如鉻黑T指示劑、鈣指示劑。02常見(jiàn)指示劑的配制1．甲基紫指示劑稱取甲基紫10mg，加水100mL溶解即得。本指示劑有三個(gè)變色范圍：第一變色范圍PH=0.13~0.5，顏色由黃至綠；第二變色范圍pH=1.0~1.5，顏色由綠至藍(lán)；第三變色范圍pH=2.0~3.0，顏色由藍(lán)至紫色。02常見(jiàn)指示劑的配制2．甲基橙指示劑稱取甲基橙0.1g，溶解于100mL水中。變色范圍pH=3.1-4.4，顏色變化由紅至黃色。3．溴甲酚綠（溴甲酚藍(lán)）指示劑此指示劑有兩種配制方法，一種是稱取溴甲酚綠0.1g，溶于100mL20%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇中；另一種是稱取溴甲酚綠0.1g，溶于100mL水中，加入0.05mol/L氫氧化鈉溶液2.9mL。變色范圍是pH=3.8~5.4，顏色由黃至藍(lán)色。02常見(jiàn)指示劑的配制4．溴甲酚紫指示劑稱取溴甲酚紫0.04g，0.01mol/LNaOH7.4g，加入蒸餾水92.6mL。溴甲酚紫pH5.2-5.6，顏色由黃變紫，常用濃度為0.04％。5．甲基紅指示劑稱取0.1g或0.2g甲基紅，溶于100mL60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇中即可。變色范圍為pH=4.4~6.2，顏色由紅至黃色。02常見(jiàn)指示劑的配制6．酚紅指示劑稱取酚紅0.1g，溶于100mL20%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇中；第二種配制方法為：稱取酚紅0.1g溶于100mL水中，加入0.05mol/L氫氧化鈉溶液5.7mL。其變色范圍是pH=6.8-8.0，顏色由黃色至紅色。7．酚酞指示劑稱取酚酞lg，溶于100mL60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇中。變色范圍pH=8.2-10.0，顏色由無(wú)色至紫紅。02常見(jiàn)指示劑的配制8．甲基紅溴甲酚綠混合指示劑量取1g/L溴甲酚氯乙醇溶液50mL，讓它再與1g/L甲基紅乙醇溶液10mL混合，所制得的混合液即是甲基紅溴甲酚綠混合指示劑。變色點(diǎn)PH=5.1，酸性色為酒紅色，堿性色為綠色。9．甲基紅亞甲基藍(lán)指示劑將2g/L的甲基紅乙醇溶液與1g/L的亞甲基藍(lán)乙醇溶液等體積混合，混合液即是甲基紅亞甲基藍(lán)指示劑。其變色點(diǎn)是PH=5.4，酸性色為紅紫色，堿性色為綠色。PH=5.2為紅紫色，PH=5.4為暗紫色，PH=5.6為綠色。02常見(jiàn)指示劑的配制10．5g/L的鉻酸鉀指示劑稱取鉻酸鉀5g，溶于100mL水即可。11．淀粉指示劑稱取1g可溶性淀粉，加入10mL冷水調(diào)成懸浮液，倒入正在沸騰的100mL水中，冷卻備用。12．鈣紅指示劑稱取鈣紅0.1g，加水100mL，或者鈣紅液與乙醇按1:1等體積溶解即得。02常見(jiàn)指示劑的配制13．麝香草酚藍(lán)指示劑稱取麝香草酚藍(lán)0.1g溶于100mL20%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇中；還有一種配制方法，即稱取麝香草酚藍(lán)0.1g溶于100mL水中，加入0.05mol/L氫氧化鈉溶液4.3mL。第一變色范圍pH=1.2~2.8，顏色由紅至黃；第二變色范圍pH=8.0~9.6，顏色由黃至藍(lán)色。02常見(jiàn)指示劑的配制14．麝香草酚酞指示液取麝香草酚酞0.1g，加乙醇100mL使溶解，即得。變色范圍pH9.3~10.5g（無(wú)色→藍(lán)）。麝香草酚藍(lán)指示液取麝香草酚藍(lán)0.1g，加0.05mol/L氫氧化鈉溶液4.3mL使溶解，再加水稀釋至200mL，即得。變色范圍pH1.2~2.8(紅→黃)；15．中性紅指示劑稱量中性紅0.04g，加入95％乙醇28mL，蒸餾水72mL，混勻即可。中性pH6.8~8顏色由紅變黃，常用濃度為0.04％。02常見(jiàn)指示劑的配制16．孔雀綠指示液取孔雀綠0.3g，加冰醋酸100mL使溶解，即得。變色范圍pH0.0~2.0，由黃色變?yōu)榫G色；PH11.0-13.5，由綠色變?yōu)闊o(wú)色。17．甲酚紅指示液取甲酚紅0.1g，加0.05mol/L氫氧化鈉溶液5.3mL使溶解，再加水稀釋至100mL，即得。變色范圍pH7.2~8.8由黃變紅。02常見(jiàn)指示劑的配制18．剛果紅指示液取剛果紅0.5g,加10％乙醇100mL使溶解，即得。變色范圍pH3.0~5.0由藍(lán)變紅。19．蘇丹Ⅳ指示液取蘇丹Ⅳ0.5g,加氯仿100mL使溶解，即得。20．間甲酚紫指示液取間甲酚紫0.1g,加0.01mol/L氫氧化鈉溶液10mL使溶解，再加水稀釋至100mL，即得。變色范圍pH7.5~9.2由黃色變紫色。02常見(jiàn)指示劑的配制21．茜素磺酸鈉指示液取茜素磺酸鈉0.1g，加水100mL使溶解,即得。變色范圍pH3.7~5.2由黃變紫。22．萘酚苯甲醇指示液取α-萘酚苯甲醇0.5g，加冰醋酸100mL使溶解，即得。變色范圍pH8.5-9.8（黃→綠）23．鉻黑T指示劑取鉻黑T0.1g，加氯化鈉10g，研磨均勻，即得。02常見(jiàn)指示劑的配制24．喹哪啶紅指示液取喹哪啶紅0.1g，加甲醇100mL使溶解，即得。變色范圍pH1.4~3.2由無(wú)色變成紅色。25．溴酚藍(lán)指示液取溴酚藍(lán)0.1g，加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.0mL使溶解，再加水稀釋至200mL，即得。變色范圍pH2.8~4.6從黃色變?yōu)樗{(lán)綠色。02常見(jiàn)指示劑的配制26．鄰二氮菲指示液取硫酸亞鐵0.5g，加水100mL使溶解，加硫酸2滴與鄰二氮菲0.5g,搖勻，即得。本液應(yīng)臨用新制。27．鈣紫紅素指示劑取鈣紫紅素0.1g，加無(wú)水硫酸鈉10g，研磨均勻，即得。28．熒光黃指示劑取熒光黃0.1g，加乙醇100mL使溶解，即得該指示劑。02常見(jiàn)指示劑的配制29．結(jié)晶紫指示劑取結(jié)晶紫0.5g，加冰醋酸100mL使溶解，即得。30．硫酸鐵銨指示劑取硫酸鐵銨8g，加水100mL使溶解，即得。31．鈣紫紅素指示劑取鈣紫紅素0.1g，加無(wú)水硫酸鈉10g，研磨均勻，即得。2.常見(jiàn)培養(yǎng)基的配方及其特點(diǎn)目錄/Contents1基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)基鑒別和選擇培養(yǎng)基23加富培養(yǎng)基01基礎(chǔ)培養(yǎng)基（1）馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱PDA）（分離培養(yǎng)霉菌用）

馬鈴薯300g蔗糖（或葡萄糖）20g

瓊脂20g蒸餾水1000mLpH自然培養(yǎng)基的配制：將馬鈴薯去皮切塊，加1000mL蒸餾水，煮沸10～20min。用紗布過(guò)濾，補(bǔ)加蒸餾水至1000mL。加入葡萄糖和瓊脂，加熱溶化，分裝，121℃高壓滅菌20min。01基礎(chǔ)培養(yǎng)基

（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌用）牛肉膏3g蛋白胨5g氯化鈉10g瓊脂15~20gpH7.0~7.2水1000mL121℃滅菌20min。01基礎(chǔ)培養(yǎng)基（3）吲哚培養(yǎng)基（蛋白胨水）用于細(xì)菌靛基質(zhì)試驗(yàn)胰酪蛋白胨10g氯化鈉5gL-色氨酸0.5g蒸餾水1000mLpH7.4。121℃滅菌15min。（4）玉米粉瓊脂（培養(yǎng)真菌用）玉米浸粉7.0g瓊脂15.0gpH值6.0±0.201基礎(chǔ)培養(yǎng)基（5）月桂基硫酸鹽胰蛋白胨MUG培養(yǎng)基胰蛋白胨20.0g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀2.75g月桂基硫酸鈉0.1g磷酸二氫鉀2.75gpH值6.8±0.2溫度25℃（6）改良山梨醇麥康凱(CT-SMAC)瓊脂蛋白胨20.0g山梨醇10.0g三號(hào)膽鹽1.5g氯化鈉5.0g中性紅0.03g結(jié)晶紫0.001g瓊脂15.0gpH值7.2±0.201基礎(chǔ)培養(yǎng)基（7）營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面蛋白胨5.0g牛肉粉3.0g瓊脂15.0gpH值7.3±0.1（8）PSE瓊脂（用于糞鏈球菌的選擇性分離和計(jì)數(shù)（SN標(biāo)準(zhǔn)）蛋白胨20.0g酵母浸粉5.0g牛膽汁物10.0g檸檬酸鈉1.0g氯化鈉5.0g檸檬酸鐵銨0.5g疊氮化鈉0.25g七葉苷1.0g瓊脂15.0gpH值7.1±0.201基礎(chǔ)培養(yǎng)基（9）沙氏瓊脂培養(yǎng)基（用于真菌檢測(cè)）蛋白胨10.0g葡萄糖40.0g瓊脂20.0gpH值5.6±0.2（10）葡萄糖瓊脂胰蛋白胨10.0g酵母粉1.5g氯化鈉5.0g溴甲酚紫0.015g葡萄糖10.0g瓊脂12.0gpH值6.9-7.101基礎(chǔ)培養(yǎng)基（11）葡萄糖胰蛋白胨瓊脂胰酪蛋白胨10.0g葡萄糖5.0g瓊脂15.0g溴甲酚紫0.04pH值6.7±0.1（12）LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基蛋白胨10g酵母膏5g氯化鈉10g蒸餾水1000mLpH7.0。121℃滅菌20min。01基礎(chǔ)培養(yǎng)基（13）麥?zhǔn)希∕eclary）瓊脂（酵母菌）葡萄糖1g氯化鉀1.8g酵母浸膏2.5g醋酸鈉8.2g瓊脂15-20g蒸餾水1000mL113℃滅菌20min。（14）玉米粉蔗糖培養(yǎng)基玉米粉60g磷酸二氫鉀3g維生素B1100mg蔗糖10g七水合硫酸鎂1.5g水1000mL121℃滅菌30min，維生素B1單獨(dú)滅菌15min后另加。01基礎(chǔ)培養(yǎng)基（15）馬丁氏（Martin）瓊脂培養(yǎng)基（分離真菌用）葡萄糖10g蛋白胨5g磷酸二氫鉀1g七水合硫酸鎂0.5g1/3000孟加拉紅（rosebengal，玫瑰紅水溶液）100mL瓊脂15~20g蒸餾水800mLpH自然112℃滅菌30min。臨用前加入0.03%鏈霉素稀釋液100mL，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30μg。01基礎(chǔ)培養(yǎng)基（16）查氏（Czapek）培養(yǎng)基（培養(yǎng)霉菌用）硝酸鈉2g磷酸氫二鉀1g氯化鉀0.5g硫酸鎂0.5g硫酸亞鐵0.01g蔗糖30g瓊脂15~20g水1000mLpH自然121℃滅菌20min。01基礎(chǔ)培養(yǎng)基（17）無(wú)氮培養(yǎng)基（自生固氮菌、鉀細(xì)菌）甘露醇（或葡萄糖）10g磷酸二氫鉀0.2g七水合硫酸鎂0.2g氯化鈉0.2g二水合硫酸鈣0.2g碳酸鈣5g蒸餾水1000mLpH7.0~7.2。113℃滅菌30min。01基礎(chǔ)培養(yǎng)基（18）營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）（一般細(xì)菌培養(yǎng),轉(zhuǎn)種,復(fù)壯,增菌等（GB標(biāo)準(zhǔn)）（19）乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（“水的細(xì)菌學(xué)檢查”用）（20）煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）（用于大腸菌群、大腸桿菌的測(cè)定(GB2008、SN標(biāo)準(zhǔn))）（21）BBL瓊脂培養(yǎng)基（用于雙岐桿菌分離培養(yǎng)（GB標(biāo)準(zhǔn)））（22）皰肉培養(yǎng)基基礎(chǔ)（加入牛肉粒,用于肉毒梭菌及厭氧梭狀芽孢桿菌的檢驗(yàn)(GB標(biāo)準(zhǔn))）（23）檸檬酸鹽培養(yǎng)基（用于測(cè)定血清，血漿及相關(guān)液體等樣本）02鑒別和選擇培養(yǎng)基（1）伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）蛋白胨10.0g乳糖10.0g磷酸氫二鉀2.0g瓊脂15.0g伊紅0.4g美藍(lán)0.065gpH值7.1±0.2培養(yǎng)基的配制：將已滅菌的蛋白胨水培養(yǎng)基（pH7.6）加熱熔化，冷卻至60℃左右時(shí)，再把已滅菌的乳糖溶液，伊紅水溶液及美藍(lán)水溶液按上述量以無(wú)菌操作加入。搖勻后，立即倒平板。乳糖在高溫滅菌易被破壞必須嚴(yán)格控制滅菌溫度，115℃滅菌20min。02鑒別和選擇培養(yǎng)基（1）伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）蛋白胨10.0g乳糖10.0g磷酸氫二鉀2.0g瓊脂15.0g伊紅0.4g美藍(lán)0.065gpH值7.1±0.2培養(yǎng)基的配制：將已滅菌的蛋白胨水培養(yǎng)基（pH7.6）加熱熔化，冷卻至60℃左右時(shí)，再把已滅菌的乳糖溶液，伊紅水溶液及美藍(lán)水溶液按上述量以無(wú)菌操作加入。搖勻后，立即倒平板。乳糖在高溫滅菌易被破壞必須嚴(yán)格控制滅菌溫度，115℃滅菌20min。02鑒別和選擇培養(yǎng)基（1）伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）蛋白胨10.0g乳糖10.0g磷酸氫二鉀2.0g瓊脂15.0g伊紅0.4g美藍(lán)0.065gpH值7.1±0.202鑒別和選擇培養(yǎng)基（2）復(fù)紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基）（3）SS瓊脂（用于沙門氏菌，志賀氏菌的選擇性分離培養(yǎng)）（4）卵黃瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)（用于肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng)（GB標(biāo)準(zhǔn)））(5)沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（用于沙門氏菌的顯色培養(yǎng)，沙門氏菌顯紫色）03加富培養(yǎng)基（1）EEM培養(yǎng)基（用于致病性大腸桿菌的增菌培養(yǎng)和腸桿菌的增菌培養(yǎng)）（2）腸道菌增菌肉湯（EE）（用于腸道菌的增菌培養(yǎng)(GB標(biāo)準(zhǔn))）（3）MEE肉湯（用于腸道菌的選擇性增菌培養(yǎng)(SN標(biāo)準(zhǔn))）（4）THB培養(yǎng)基（用于鏈球菌增菌培養(yǎng)）（5）腸球菌肉湯（用于腸球菌增菌培養(yǎng)）（6）改良Giolitti-Cantobi肉湯（用于金黃色葡萄球菌的增菌培養(yǎng)）（7）普通肉湯培養(yǎng)基（用于金黃色葡萄球菌的增菌培養(yǎng)（SN標(biāo)準(zhǔn)））（8）胰蛋白胨大豆肉湯（增菌培養(yǎng)）常用培養(yǎng)基的制備目錄/Contents1配制培養(yǎng)基的準(zhǔn)備工作培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備的基本程序201配制培養(yǎng)基的準(zhǔn)備工作（1）水和藥品的準(zhǔn)備配制培養(yǎng)基用的水最好用蒸餾水，但精細(xì)的試驗(yàn)需要使用重蒸餾水。化學(xué)藥品要用分析純或化學(xué)純，稱量要準(zhǔn)確，每稱一種藥品都必須準(zhǔn)確記載，以便事后查對(duì)。01配制培養(yǎng)基的準(zhǔn)備工作（2）器皿和用具的準(zhǔn)備器皿種類為：不同型號(hào)的試管、燒杯、錐形瓶、三角瓶、玻璃棒、滴管、平皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基分裝器、移液管、容量瓶等。制備培養(yǎng)基所用的試管、燒杯、錐形瓶、三角瓶、玻璃棒、滴管、平皿、培養(yǎng)瓶等玻璃儀器在使用前，先要用肥皂水洗刷，再用清水反復(fù)沖洗干凈，最后用蒸餾水沖一遍，晾干或烘干備用。02培養(yǎng)基制備的基本程序（1）培養(yǎng)基配方的選定（2）培養(yǎng)基的制備記錄每制備一次培養(yǎng)基都要作記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來(lái)源和各種成份的編號(hào)，還要記錄好pH值、消毒溫度、消毒時(shí)間和制備的日期及其制備者等，記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄保存?zhèn)洳椋瑥?fù)制記錄隨制備好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。（3）培養(yǎng)基成分的稱?。?）培養(yǎng)基各成份的混合和溶化02培養(yǎng)基制備的基本程序（5）培養(yǎng)基pH的初步調(diào)整用5%的NaOH或5%HC1將培養(yǎng)基pH調(diào)至所需范圍。（6）培養(yǎng)基的過(guò)濾02培養(yǎng)基制備的基本程序（7）培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)。分裝量不得超過(guò)容器總?cè)莘e的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎。（8）培養(yǎng)基的滅菌一般培養(yǎng)基可采用121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。

（9）培養(yǎng)基的質(zhì)量測(cè)試（10）培養(yǎng)基的保存將滅菌后的培養(yǎng)基放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，再檢驗(yàn)滅菌效果，無(wú)污染者方可使用。

3.常用染色液的配制目錄/Contents1常用染色液的配制染色液01常用染色液的配制1.呂氏堿性美藍(lán)染色液美藍(lán)0.3g95％乙醇30mL0.01％氫氧化鉀溶液100mL將美藍(lán)溶解于乙醇中，然后于氫氧化鉀溶液混合。染色時(shí)，先將涂片在火焰上固定，待冷卻后滴加染液，染1min~3min，水洗，待干，鏡檢。01常用染色液的配制2.奧爾特氏莢膜染色液（1）成分沙黃3g蒸餾水100mL用乳缽研磨溶解。01常用染色液的配制（2）染色法將涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加熱至產(chǎn)生蒸汽后，繼續(xù)染3min，水洗，待干，鏡檢。（3）結(jié)果炭疽芽孢桿菌菌體呈赤褐色，莢膜呈黃色。01常用染色液的配制3.瑞氏染色液（2015年新法）（1）成分瑞氏色素0.1g甲醇60mL用乳缽研磨溶解01常用染色液的配制3.瑞氏染色液（2015年新法）（2）染色法①待涂片自然干燥后，滴加染色液，固定1min。②加入等量磷酸鹽緩沖液，輕輕晃動(dòng)玻片或采用其他方式混合，使磷酸鹽緩沖液與瑞氏染液混勻靜置；③再用蒸餾水從一端輕輕沖洗，待干燥后，鏡檢。01常用染色液的配制4.革蘭氏染色法（1）染色液①結(jié)晶紫染色液結(jié)晶紫1g95％乙醇20mL1％草酸銨水溶液80mL將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。01常用染色液的配制②革蘭氏碘液碘1g碘化鉀2g蒸餾水300mL將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，在加蒸餾水至300mL。01常用染色液的配制③沙黃復(fù)染法染色液沙黃0.25g95％乙醇10mL蒸餾水90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。01常用染色液的配制（2）染色法①將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗；②滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；③滴加95％乙醇脫色，約30s；或?qū)⒁掖嫉螡M整個(gè)涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個(gè)涂片，脫色10s；④水洗，滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。（3）結(jié)果革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。01常用染色液的配制5.耐酸性染色法（1）染色液①石炭酸品紅染色液堿性品紅0.3g95％乙醇10mL5％苯酚水溶液90mL將品紅溶解于乙醇中，然后與苯酚溶液混合。01常用染色液的配制②3％鹽酸-乙醇濃煙酸3mL95％乙醇97mL③復(fù)染液呂氏堿性美藍(lán)染色液01常用染色液的配制（2）染色法①將涂片在火焰上固定，滴加石炭酸品紅染色液，徐徐加熱至有蒸汽出現(xiàn)，但切不可使沸騰。染液因蒸發(fā)減少時(shí)，應(yīng)隨時(shí)添加。染5min，傾去染液，水洗；②滴加鹽酸-乙醇脫色，直至無(wú)紅色脫落為止，（所需時(shí)間視涂片厚薄而定，一般為1min~3min），水洗；③加呂氏堿性美藍(lán)染色液，復(fù)染30min，水洗，待干，鏡檢。（3）結(jié)果耐酸性細(xì)菌呈紅色，其他細(xì)菌、細(xì)胞等物質(zhì)呈藍(lán)色。01常用染色液的配制6.柯氏染色法（1）染色液成分0.5％沙黃液0.5％孔雀綠液（2）染色法①將涂片在火焰上固定，滴加0.5％沙黃液，并加熱至出現(xiàn)氣泡，約2min~3min，水洗；②滴加0.5％孔雀綠液，復(fù)染40s~50s，水洗，待干，鏡檢。（3）結(jié)果布氏桿菌呈紅色，其他細(xì)菌及細(xì)胞呈綠色。01常用染色液的配制7.鞭毛染色法（1）染色液的配制①甲液稱丹寧酸5g、氯化高鐵（FeCl3）1.5g，溶于100mL蒸餾水中，待溶解后加入1％的氫氧化納溶液1mL和15％的甲醛溶液2mL。01常用染色液的配制7.鞭毛染色法②乙液稱2g硝酸銀溶于100mL蒸餾水中。在90mL乙液中滴加濃氫氧化銨溶液，到出現(xiàn)沉淀后，繼續(xù)滴加使其變?yōu)槌吻?，然后用其?0mL乙液小心滴加至澄清液中，至出現(xiàn)輕微霧狀為止（此為關(guān)鍵性操作，應(yīng)特別小心）。滴加氫氧化銨和用剩余乙液回滴時(shí)，要邊滴邊充分搖蕩，染液當(dāng)天配，當(dāng)天使用，2d~3d后基本無(wú)效。01常用染色液的配制（2）染色法在風(fēng)干的載玻片上滴加甲液，4min~6min后，用蒸餾水輕輕沖凈，再加乙液，緩緩加熱至冒汽，維持約半分鐘（加熱時(shí)注意勿出現(xiàn)干燥面），在菌體多的部位可呈深褐色到黑色，停止加熱，用水沖凈，干后鏡檢。菌體及鞭毛為深褐色到黑色。01常用染色液的配制8．考馬斯亮藍(lán)R-250染色液考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理,定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。01常用染色液的配制8．考馬斯亮藍(lán)R-250染色液考馬斯亮藍(lán)R-250染色液的配置方法（1L的量）：（1）稱取1g考馬斯亮藍(lán)R-250，置于1L燒杯中。（2）量取250mL的異丙醇加入上述燒杯中，攪拌溶解。（3）加入100mL的冰乙醋酸，均勻攪拌。（4）加入650mL的去離子水，均勻攪拌。（5）用濾紙出去顆粒物質(zhì)后，室溫保存。4.緩沖液的配制目錄/Contents1緩沖液的配制緩沖液01緩沖液的配制1．磷酸鹽緩沖液(簡(jiǎn)稱PBS)磷酸鈉緩沖液是常用的一種阻礙溶液pH變化的緩沖溶液，其鹽溶液中含有氯化鈉，磷酸鹽，磷酸鹽，氯化鉀和磷酸鉀組成。（1）常規(guī)磷酸鹽緩沖液①成分磷酸二氫鉀34g，1mol/L氫氧化鈉溶液175mL，蒸餾水825mL01緩沖液的配制1．磷酸鹽緩沖液(簡(jiǎn)稱PBS)②配置先將磷酸鹽溶解于500mL蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉溶液校正pH為7.2后，再用蒸餾水稀釋至1000mL。③稀釋液取儲(chǔ)存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL。分裝每瓶100mL或每管10mL，于121℃高壓滅菌15min，備用。01緩沖液的配制（2）改良磷酸鹽緩沖液①成分磷酸氫二鈉34g，山梨醇10.0g，磷酸二氫鈉1.2g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000mL，膽鹽1.5g。②制法將磷酸鈉及氯化鈉溶于蒸餾水中，再加入山梨醇及膽鹽，溶解后，校正PH值為7.6，分裝試管。于121℃高壓滅菌15min，備用。01緩沖液的配制（3）明膠磷酸緩沖液①成分磷酸氫二鈉4.0g，明膠2.0g，蒸餾水1000mL。②制法加熱溶解，校正PH為6.2，于121℃高壓滅菌15min。01緩沖液的配制（4）磷酸-三乙胺緩沖液取磷酸約4mL與三乙胺約7mL，加50％甲醇稀釋至1000mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.2，即得磷酸-三乙胺緩沖液。01緩沖液的配制（5）PH值在2.0~8.0范圍內(nèi)常用磷酸鹽緩沖液的配制方法①磷酸鹽緩沖液(pH2.0)：甲液:取磷酸16.6mL，加水至1000mL，搖勻。乙液：取磷酸氫二鈉71.63g，加水使溶解成1000mL。取上述甲液72.5mL與乙液27.5mL混合，搖勻，即得。②磷酸鹽緩沖液(pH2.5)：取磷酸二氫鉀100g，加水800mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5，用水稀釋至1000mL。01緩沖液的配制（5）PH值在2.0~8.0范圍內(nèi)常用磷酸鹽緩沖液的配制方法③磷酸鹽緩沖液(pH5.0)：取0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液一定量，用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.0，即得。④磷酸鹽緩沖液(pH5.8)：取磷酸二氫鉀8.34g與磷酸氫二鉀0.87g,加水使溶解成1000mL，即得。01緩沖液的配制（5）PH值在2.0~8.0范圍內(nèi)常用磷酸鹽緩沖液的配制方法⑤磷酸鹽緩沖液(pH6.5)：取磷酸二氫鉀0.68g，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液15.2mL，用水稀釋至100mL，即得。⑥磷酸鹽緩沖液(pH6.8)取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250mL，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118mL，用水稀釋至1000mL，搖勻，即得。⑦磷酸鹽緩沖液(pH7.0)取磷酸二氫鉀0.68g，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液29.1mL，用水稀釋至100mL，即得。01緩沖液的配制⑧磷酸鹽緩沖液(pH7.8)：甲液：取磷酸氫二鈉35.9g，加水溶解，并稀釋至500mL。乙液：取磷酸二氫鈉2.76g，加水溶解，并稀釋至100mL。取上述甲液91.5mL與乙液8.5mL混合，搖勻，即得。⑨磷酸鹽緩沖液(pH7.8-8.0)：取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使溶解成1000mL，即得。01緩沖液的配制（6）0.2mol/L的磷酸-檸檬酸緩沖液母液A（0.2mol/L的Na2HPO4

溶液）：稱取143.256g的Na2HPO4?12H2O，用去離子水定容至2L。母液B（0.1mol/L的檸檬酸溶液）：稱取檸檬酸42.028g用去離子水溶解定容至2L。01緩沖液的配制（6）0.2mol/L的磷酸-檸檬酸緩沖液母液A（0.2mol/L的Na2HPO4

溶液）：稱取143.256g的Na2HPO4?12H2O，用去離子水定容至2L。母液B（0.1mol/L的檸檬酸溶液）：稱取檸檬酸42.028g用去離子水溶解定容至2L。01緩沖液的配制2.醋酸鹽緩沖液：（1）醋酸-醋酸鈉緩沖液①醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH3.7)取無(wú)水醋酸鈉20g，加水300mL溶解后，加溴酚藍(lán)指示液1mL及冰醋酸60~80mL，至溶液從藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榧兙G色，再加水稀釋至1000mL，即得。01緩沖液的配制2.醋酸鹽緩沖液：（1）醋酸-醋酸鈉緩沖液②醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.6)取醋酸鈉5.4g，加水50mL使溶解，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.6，再加水稀釋至100mL，即得。01緩沖液的配制（6）0.2mol/L的磷酸-檸檬酸緩沖液③pH6.6的緩沖液取727.5mL母液A，與272.5mL的母液B混勻即可。并將其放于4℃冰箱保存。01緩沖液的配制③醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH6.0)取醋酸鈉54.6g，加1mol/L醋酸溶液20mL溶解后，加水稀釋至500mL，即得。（2）醋酸-醋酸鉀緩沖液取醋酸鉀14g，加冰醋酸20.5mL，再加水稀釋至1000mL，即得pH=4.3的緩沖液。01緩沖液的配制（3）醋酸-醋酸銨緩沖液①醋酸-醋酸銨緩沖液（PH3.5）取醋酸銨25g，加水25mL溶解后，加7mol/L鹽酸溶液38mL，用2mol/L鹽酸溶液或5mol/L氨溶液準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH值至3.5(電位法指示)，用水稀釋至100mL，即得。01緩沖液的配制（3）醋酸-醋酸銨緩沖液②醋酸-醋酸銨緩沖液(pH4.5)取醋酸銨7.7g，加水50mL溶解后，加冰醋酸6mL與適量的水使成100mL，即得。01緩沖液的配制③醋酸-醋酸銨緩沖液(pH6.0)取醋酸銨100g，加水300mL使溶解，加冰醋酸7mL，搖勻即得。（4）醋酸-鉀鹽緩沖液(pH3.0)取冰醋酸50mL，加水800mL混合后，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至3.0，再加水稀釋至1000mL，即得。01緩沖液的配制3．硼酸鹽緩沖液（1）硼酸-氯化鈣緩沖液(pH8.0)取硼酸0.572g與氯化鈣2.94g，加水約800mL溶解后,用1mol/L鹽酸溶液約2.5mL調(diào)節(jié)pH值至8.0，加水稀釋至1000mL，即得。01緩沖液的配制（2）硼酸-碳酸鈉緩沖液(pH=10.8~11.2)取無(wú)水碳酸鈉5.30g，加水使溶解成1000mL；另取硼酸1.91g，加水使溶解成100mL。臨用前取碳酸鈉溶液973mL與硼酸溶液27mL，混勻，即得。（3）硼酸-氯化鉀緩沖液(pH9.0)取硼酸3.09g，加0.1mol/L氯化鉀溶液500mL使溶解，再加0.1mol/L氫氧化鈉溶液210mL，即得。01緩沖液的配制4．檸檬酸鹽緩沖液取枸櫞酸4.2g，加1mol/L的20％乙醇制氫氧化鈉溶液40mL使溶解，再用20％乙醇稀釋至100mL，即得。（1）檸檬酸鹽緩沖液(pH6.2)取2.1％枸櫞酸水溶液，用50％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.2，即得所需溶液。01緩沖液的配制（2）檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液（PH2.2）

稱取210g檸檬酸（C6H8O7?H2O）84g氫氧化鈉NaOH，加水溶解，再用量筒量取160mL的濃鹽酸，混勻，加水定容至10L即得PH=2.2的緩沖液。使用時(shí)可以每升中加入1g酚，若最后pH有變化，再用少量50%氫氧化鈉溶液或濃鹽酸調(diào)節(jié)，冰箱保存。01緩沖液的配制（3）檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液取9.2mL0.1M檸檬酸和10.8mL0.1M檸檬酸鈉溶液混合，即得PH=4.8的緩沖液。（4）檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（PH=5.0）取10.30mL0.2MNa2HPO4液和9.70mL0.1M檸檬酸混合，即得PH=5.0的緩沖液。01緩沖液的配制（5）檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液(pH4.0)甲液：取枸櫞酸21g或無(wú)水枸櫞酸19.2g,加水使溶解成1000mL，置冰箱內(nèi)保存。乙液：取磷酸氫二鈉71.63g，加水使溶解成1000mL。取上述甲液61.45mL與乙液38.55mL混合，搖勻，即得。01緩沖液的配制5．巴比妥緩沖液（1）巴比妥緩沖液(pH7.4)取巴比妥鈉4.42g，加水使溶解并稀釋至400mL，用2mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，過(guò)濾即得。（2）巴比妥緩沖液(pH8.6)取巴比妥5.52g與巴比妥鈉30.9g，加水使溶解成2000mL，即得。01緩沖液的配制5．巴比妥緩沖液（3）巴比妥-氯化鈉緩沖液(pH7.8)取巴比妥鈉5.05g，加氯化鈉3.7g及水適量使溶解，另取明膠0.5g加水適量，加熱溶解后并入上述溶液中。然后用0.2mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.8，再用水稀釋至500mL，即得。01緩沖液的配制6．三羥甲基氨基甲烷緩沖液（1）三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.0)取三羥甲基氨基甲烷12.14g，加水800mL，攪拌溶解，并稀釋至1000mL，用6mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，即得。（2）三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.1)取氯化鈣0.294g，加0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液40mL使溶解，用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.1，加水稀釋至100mL，即得。01緩沖液的配制（3）三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH9.0)取三羥甲基氨基甲烷6.06g，加鹽酸賴氨酸3.65g，氯化鈉5.8g，乙二胺四醋酸二鈉0.37g，再加水溶解使成1000mL，調(diào)節(jié)pH值至9.0，即得。01緩沖液的配制7．氨－氯化銨緩沖液（1）氨－氯化銨緩沖液(pH8.0)取氯化銨1.07g，加水使溶解成100mL，再加稀氨溶液(1→30)調(diào)節(jié)pH值至8.0，即得。（2）氨－氯化銨緩沖液(pH10.0)取氯化銨5.4g，加水20mL溶解后，加濃氯溶液35mL，再加水稀釋至100mL，即得。01緩沖液的配制8．甲酸鈉緩沖液(pH3.3)取2mol/L甲酸溶液25mL，加酚酞指示液1滴，用2mol/L氫氧化鈉溶液中和，再加入2mol/L甲酸溶液75mL，用水稀釋至200mL，調(diào)節(jié)pH值至3.25~3.30，即得。9．鄰苯二甲酸鹽緩沖液(pH5.6)取鄰苯二甲酸氫鉀10g，加水900mL，攪拌使溶解，用氫氧化鈉試液(必要時(shí)用稀鹽酸)調(diào)節(jié)pH值至5.6，加水稀釋至1000mL，混勻，即得。5.生化試劑制備目錄/Contents1糖（醇）類代謝試驗(yàn)法生化試劑制備氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)法2呼吸酶類試驗(yàn)3毒性酶類試驗(yàn)401糖（醇）類代謝試驗(yàn)法（1）試驗(yàn)原理：不同的細(xì)菌對(duì)各種糖醇的分解能力及所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不同，有的能分解多種糖醇，有的只能分解1-2種糖醇，有的分解糖醇只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，有的分解糖醇能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，通過(guò)這些特點(diǎn)，我們可以鑒別細(xì)菌。01糖（醇）類代謝試驗(yàn)法糖發(fā)酵培養(yǎng)基主要有：液體糖發(fā)酵管、半固體糖發(fā)酵管、固體糖發(fā)酵管、雙糖(或三糖)高層斜面發(fā)酵管四類。01糖（醇）類代謝試驗(yàn)法糖發(fā)酵試驗(yàn)法的具體操作方法：采用無(wú)菌操作法，首先將已分離培養(yǎng)的純種細(xì)菌用接種針或者接種環(huán)移取，然后接種在糖發(fā)酵管中，如果是半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。最后放置于36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間（數(shù)小時(shí)以至二周之間）的培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中每天觀察結(jié)果，并與指示劑比對(duì)即可。01糖（醇）類代謝試驗(yàn)法（3）葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基（O/F）的制備稱取蛋白胨2.7克，氯化鈉5.0克，0.2%溴麝香酚蘭0.03克，瓊脂3克，0.3克KH2PO4，葡萄糖10.0克，水1000毫升。加熱溶解，121℃高壓滅菌20min即可。01糖（醇）類代謝試驗(yàn)法（2）V-P.試驗(yàn)的試驗(yàn)方法首先取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，將它們一一編號(hào)，第1號(hào)接種大腸桿菌，第2號(hào)接產(chǎn)氣桿菌，第3支接未知菌；然后放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，之后加入40%KOH5-10滴，再加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振蕩；最后放入37℃溫箱中保溫30min，以加快反應(yīng)速度；保溫期間注意觀察培養(yǎng)基的顏色變化：①當(dāng)發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者時(shí)，稱為陽(yáng)性，記作V-P+②當(dāng)發(fā)酵管為黃色或銅綠色時(shí)，稱為陰性，記作V-P-。01糖（醇）類代謝試驗(yàn)法（2）V-P.試驗(yàn)的制備方法制備方法：將3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂生長(zhǎng)物接種3%氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基，36℃士1℃培養(yǎng)48h。取1mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)放到一個(gè)試管內(nèi)，加0.6mL甲液，搖動(dòng)。加0.2mL乙液，搖動(dòng)。隨意加一點(diǎn)肌酸結(jié)晶，4h后觀察結(jié)果。陽(yáng)性結(jié)果是呈伊紅的粉紅色。01糖（醇）類代謝試驗(yàn)法

3．甲基紅（MR）試驗(yàn)（1）試驗(yàn)原理腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基pH值下降至pH=4.5以下，使甲基紅指示劑變紅，即為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性；有的細(xì)菌使丙酮酸脫羧后形成酮、醇類中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液pH＞5.4，甲基紅指示劑呈桔黃色，示為甲基紅試驗(yàn)陰性。簡(jiǎn)而言之，甲基紅試驗(yàn)原理就是檢測(cè)不同細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸的能力。01糖（醇）類代謝試驗(yàn)法（2）試驗(yàn)方法首先挑取少許新鮮的待測(cè)試驗(yàn)培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中；然后放于36±1℃或30℃（以30℃較好）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5天；其中注意，從培養(yǎng)的第48h起，每天要取培養(yǎng)液1mL，加入甲基紅指示劑1~2滴，立即觀察結(jié)果。01糖（醇）類代謝試驗(yàn)法（3）結(jié)果觀察與記錄①呈鮮紅色或橘紅色為陽(yáng)性，呈淡紅色為弱陽(yáng)性，記MR+；②呈橘黃色或黃色為陰性，記MR-。從發(fā)現(xiàn)陰性并培養(yǎng)至第5天仍為陰性，即可判定結(jié)果。（4）試驗(yàn)中所用培養(yǎng)基和試劑的制備①磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的制備稱取蛋白胨5g，葡糖糖5g，磷酸氫二鉀2g，加入蒸餾水1000mL，充分溶解后調(diào)pH7.0-7.2，過(guò)濾。分裝于試管中，每管10mL，121℃滅菌30min。01糖（醇）類代謝試驗(yàn)法②甲基紅試劑稱取甲基紅（Methylred）0.04g，溶于60mL的95％乙醇中，再加入40mL的蒸餾水即可。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)法（1）原理某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可以用顯色反應(yīng)來(lái)表現(xiàn)。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，此物質(zhì)為紅色化合物。也就是說(shuō)，這一試驗(yàn)反應(yīng)原理包括兩個(gè)過(guò)程，一個(gè)是色氨酸分解反應(yīng)，一個(gè)是吲哚反應(yīng)。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)法（2）試驗(yàn)方法先找取3支胰蛋白水培養(yǎng)基，分別編號(hào)，1號(hào)接種大腸桿菌，2號(hào)接種產(chǎn)氣桿菌，第3支接未知菌；然后將三個(gè)培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2天；培養(yǎng)完成后，沿試管壁滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結(jié)果。若結(jié)果呈現(xiàn)玫瑰紅色，則為陽(yáng)性反應(yīng)，記吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性；若結(jié)果無(wú)紅色者，則為陰性反應(yīng)，記作吲哚陰性。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)法（2）試驗(yàn)方法先找取3支胰蛋白水培養(yǎng)基，分別編號(hào)，1號(hào)接種大腸桿菌，2號(hào)接種產(chǎn)氣桿菌，第3支接未知菌；然后將三個(gè)培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2天；培養(yǎng)完成后，沿試管壁滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結(jié)果。若結(jié)果呈現(xiàn)玫瑰紅色，則為陽(yáng)性反應(yīng)，記吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性；若結(jié)果無(wú)紅色者，則為陰性反應(yīng)，記作吲哚陰性。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)法（2）試驗(yàn)方法與結(jié)果①瓊脂穿刺法培養(yǎng)基為三糖鐵培養(yǎng)基、含硫酸亞鐵(或醋酸鉛)的半固體培養(yǎng)基兩種。操作方法：將試驗(yàn)細(xì)菌用接種針沿著管壁穿刺接種到含醋酸鉛或硫酸亞鐵培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h-48h后，觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基變成黑色則為陽(yáng)性。當(dāng)產(chǎn)生硫化氫量少時(shí)，為了便于觀察結(jié)果，在穿刺接種培養(yǎng)時(shí)，一定要沿培養(yǎng)基管壁進(jìn)行。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)法（2）試驗(yàn)方法與結(jié)果②醋酸鉛試紙法培養(yǎng)基為含胱氨酸的半固體培養(yǎng)基，還需要準(zhǔn)備一個(gè)浸有醋酸鉛的濾紙條。操作方法：待檢菌穿刺接種培養(yǎng)基，懸掛醋酸鉛紙條，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h-48h。結(jié)果：如果試紙呈現(xiàn)黑色，則為陽(yáng)性。此方法比較敏感。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)法3.尿素酶（Urease）試驗(yàn)（2）試驗(yàn)方法挑取大量培養(yǎng)18h~24h的待試菌，濃密涂布接種于尿素瓊脂斜面上，不要到達(dá)底部，留底部作變色對(duì)照。在培養(yǎng)2h、4h和24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，分別觀察一次結(jié)果。如果培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色則為陽(yáng)性，顏色不變者即為陰性。倘若初步判斷為陰性，則應(yīng)該繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)法（3）尿素瓊脂培養(yǎng)基的制備①成分蛋白胨1g，瓊脂20g，氯化鈉5g，葡萄糖1g，磷酸二氫鉀2g，0.4%酚紅溶液3mL，20%尿素溶液100mL，蒸餾水1000mL。pH7.2±0.1②培養(yǎng)基的配制在蒸餾水或去離子水100mL中，加入上述所有成分（除尿素和瓊脂外），混合均勻并校正pH，121℃滅菌15min。冷至50～55℃，加入經(jīng)除菌過(guò)濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2%，最終pH應(yīng)為7.2±0.1。03呼吸酶類試驗(yàn)（三）呼吸酶類試驗(yàn)1.氧化酶試驗(yàn)（1）試驗(yàn)原理氧化酶使細(xì)胞色素C氧化，氧化型細(xì)胞色素C再使鹽酸二甲基對(duì)苯二胺氧化，生成由玫瑰紅色變成暗紫色的醌類化合物，它再和α-萘酚結(jié)合生成吲哚酚藍(lán)。03呼吸酶類試驗(yàn)（三）呼吸酶類試驗(yàn)（2）試驗(yàn)方法用滴管直接滴加1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試劑在培養(yǎng)物上，滴加量為1-2滴；再加入1%α-萘酚-乙醇液1-2滴，于30秒內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。如果在30秒內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)，則為陽(yáng)性，記作+；如果不變色或?yàn)榉奂t色者，為陰性，記作-。03呼吸酶類試驗(yàn)2.過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)（1）原理某些細(xì)菌能夠分泌過(guò)氧化氫酶，當(dāng)加入過(guò)氧化氫以后，可將過(guò)氧化氫分解生成水和氧氣，產(chǎn)生氣泡，此為陽(yáng)性反應(yīng)。03呼吸酶類試驗(yàn)2.過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)（2）試驗(yàn)方法取下固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，放置在一個(gè)干凈玻璃片上或者試管上，向其上滴加3%過(guò)氧化氫液數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。若產(chǎn)生氣泡，就是陽(yáng)性，記為+，若不產(chǎn)生氣泡，則為陰性，記-。03呼吸酶類試驗(yàn)3.硝酸鹽還原試驗(yàn)（1）原理某些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。在酸性條件下，亞硝酸鹽可以生成亞硝酸，亞硝酸與對(duì)氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，而重氮苯磺酸又與α-萘胺作用，生成紅色的化合物，呈紅色反應(yīng)，為陽(yáng)性反應(yīng)。03呼吸酶類試驗(yàn)（2）試劑A試劑是對(duì)氨基苯磺酸試劑：將對(duì)氨基苯磺酸0.8g，溶解于2.5mol/L，乙酸溶液100mL中；B試劑是α-萘胺試劑：將甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。03呼吸酶類試驗(yàn)（3）試驗(yàn)方法取新鮮的純培養(yǎng)物待檢菌，接種在硝酸鹽培養(yǎng)基上，于36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~4天，每天取2mL培養(yǎng)液，加入等量的A、B試劑混合物各二滴，混和均勻，立即觀察結(jié)果。若結(jié)果是紅色，則為陽(yáng)性，記+；若無(wú)紅色出現(xiàn)，即為陰性，記-。03呼吸酶類試驗(yàn)4.氰化鉀試驗(yàn)（1）原理氰化鉀是細(xì)菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑，它能與呼吸酶作用，讓酶失去活性，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，但有的細(xì)菌在一定濃度的氰化鉀存在時(shí)，仍能生長(zhǎng)，依此來(lái)鑒別細(xì)菌。03呼吸酶類試驗(yàn)4.氰化鉀試驗(yàn)（2）試驗(yàn)方法取下1環(huán)已培養(yǎng)20h~24h的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，將其接種到對(duì)照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，立即用橡膠塞塞緊，放置于36±1℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h~48h，觀察結(jié)果。當(dāng)對(duì)照管中有菌生長(zhǎng)，同時(shí)試驗(yàn)管也有菌生長(zhǎng)時(shí)，為陽(yáng)性，記作+；當(dāng)對(duì)照管中有菌生長(zhǎng)，而試驗(yàn)管中無(wú)菌生長(zhǎng)為陰性，記作-。04毒性酶類試驗(yàn)1．溶血試驗(yàn)（1）原理某些細(xì)菌在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生溶血素，可使人或動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生溶解，不同的細(xì)菌有不同的溶血反應(yīng)，借此可鑒別細(xì)菌。（2）試驗(yàn)方法方法有平板法和試管法兩種，這里只介紹試管法。先把待檢菌培養(yǎng)液與2%的羊血球等量混合，然后于36±1℃培養(yǎng)16h-18h，觀察其結(jié)果。如果溶血，培養(yǎng)液可出現(xiàn)透明狀，即為陽(yáng)性，記作+；如果無(wú)溶血現(xiàn)象，則為陰性，記作-。04毒性酶類試驗(yàn)2．血漿凝固酶試驗(yàn)（1）原理致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著在細(xì)菌的表面，形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固現(xiàn)象，為陽(yáng)性。04毒性酶類試驗(yàn)2．血漿凝固酶試驗(yàn)（2）試驗(yàn)方法以試管法為主。即找滅菌小試管3支，向三個(gè)試管中各加入1:1體積的血漿－無(wú)菌水0.5mL，1支加入被檢菌株的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.5mL；其余2支作對(duì)照管，其中一支加入金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.5mL作陽(yáng)性對(duì)照；另一支加入0.9％氯化鈉溶液0.5mL作空白對(duì)照。將3個(gè)試管同時(shí)放在37℃恒溫箱或水浴中培養(yǎng)，每0.5h觀察一次，4h內(nèi)無(wú)凝固現(xiàn)象者，觀察直至24小時(shí)。04毒性酶類試驗(yàn)2．血漿凝固酶試驗(yàn)（3）試管法的結(jié)果觀察與記錄空白對(duì)照管的血漿流動(dòng)自如，陽(yáng)性對(duì)照管血漿凝固。若試驗(yàn)管血漿凝固，則為陽(yáng)性；如果三管均無(wú)凝固現(xiàn)象，即為陰性。本試驗(yàn)法所用到的試劑和培養(yǎng)基在血清學(xué)反應(yīng)里介紹過(guò)，此處不再贅述。6.物質(zhì)的量濃度溶液的配制目錄/Contents1物質(zhì)的量濃度溶液的配制物質(zhì)的量濃度溶液的配制01物質(zhì)的量濃度溶液的配制（1）計(jì)算與稱量所稱固體質(zhì)量或量取液體的體積，用托盤天平或電子天平稱量固體或用量筒量取液體。（2）溶解或稀釋在燒杯中溶解，并用玻璃棒攪拌。（3）轉(zhuǎn)移待溶液冷卻到室溫，將燒杯中的溶液沿玻璃棒注入容量瓶中。01物質(zhì)的量濃度溶液的配制（4）洗滌用少量蒸餾水洗滌燒杯內(nèi)壁和玻璃棒2~3次，并把洗滌液全轉(zhuǎn)移到容量瓶中。（5）定容向容量瓶中加入蒸餾水，在距離刻度2~3cm時(shí)，改用膠頭滴管滴加蒸餾水至凹液面的最低點(diǎn)與刻度線相平。（6）搖勻并貼簽蓋好瓶塞，把容量瓶倒轉(zhuǎn)和搖動(dòng)多次，使得溶液混合均勻。貼好標(biāo)簽，并注明溶液的名稱和濃度。01物質(zhì)的量濃度溶液的配制物質(zhì)的量濃度溶液的配制關(guān)鍵程序01物質(zhì)的量濃度溶液的配制操作程序：以配制0.5mol·L－1的NaCl溶液250mL為例01物質(zhì)的量濃度溶液的配制（4）洗滌用少量蒸餾水洗滌燒杯內(nèi)壁和玻璃棒2~3次，并把洗滌液全轉(zhuǎn)移到容量瓶中。（5）定容向容量瓶中加入蒸餾水，在距離刻度2~3cm時(shí)，改用膠頭滴管滴加蒸餾水至凹液面的最低點(diǎn)與刻度線相平。（6）搖勻并貼簽蓋好瓶塞，把容量瓶倒轉(zhuǎn)和搖動(dòng)多次，使得溶液混合均勻。貼好標(biāo)簽，并注明溶液的名稱和濃度。01物質(zhì)的量濃度溶液的配制3．誤差分析配制溶液時(shí)能引起誤差的一些操作7.血清學(xué)反應(yīng)試劑制備目錄/Contents1基本概念pH指示劑的配制技術(shù)血清學(xué)鑒定2血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備301基本概念血清是指血液凝固析出的淡黃色透明液體。血清蛋白是指為避免抗凝劑的干擾，血液中許多化學(xué)成分的分析，都以血清為樣品。血清學(xué)檢驗(yàn)就是利用抗原-抗體反應(yīng)的顯著特異性，進(jìn)行細(xì)菌的鑒別和血清學(xué)定型。細(xì)菌菌體或鞭毛等抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來(lái)檢測(cè)以食品為載體的病原。01基本概念血清學(xué)檢驗(yàn)指根據(jù)抗原與相應(yīng)的抗體在適宜的條件下，能在體外發(fā)生特異性結(jié)合的原理，在體外用已知抗體（或抗原）檢測(cè)抗原（或抗體）。01基本概念

2.血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn)（1）抗原抗體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。（2）抗原抗體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。01基本概念

2.血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn)（3）抗原抗體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。（4）血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無(wú)嚴(yán)格界限。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長(zhǎng)時(shí)間。01基本概念3.血清學(xué)檢驗(yàn)的類型血清學(xué)試驗(yàn)可分為血清學(xué)鑒定和血清學(xué)診斷兩部分。血清學(xué)試驗(yàn)既可定性，又可定量。用已知抗體（即含特異抗體的免疫血清或單克隆抗體等）檢測(cè)標(biāo)本中或分離培養(yǎng)物中未知細(xì)菌的種、型或細(xì)菌抗原，稱為血清學(xué)鑒定；而用已知細(xì)菌或特異性抗原檢測(cè)患者血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及其效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化，作為某些感染性疾病的輔助診斷，稱為血清學(xué)診斷。02血清學(xué)鑒定1．凝集反應(yīng)（1）直接凝集反應(yīng)①玻片凝集法方法是取已知抗體（診斷血清）滴加在載玻片上，直接從培養(yǎng)基上刮取待檢菌混勻于診斷血清中，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)細(xì)菌凝集成塊或肉眼可見(jiàn)的顆粒，即為反應(yīng)陽(yáng)性。02血清學(xué)鑒定1．凝集反應(yīng)（1）直接凝集反應(yīng)②試管凝集法此法是一種定量試驗(yàn)方法。多用已知抗原來(lái)檢測(cè)血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及其含量。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。02血清學(xué)鑒定（2）間接凝集反應(yīng)法此反應(yīng)法是指將可溶性抗原或抗體吸附于某種與免疫無(wú)關(guān)一定大小的顆粒載體表面，制成致敏載體，再與相應(yīng)抗體或抗原作用，在電解質(zhì)存在的適宜條件下，被動(dòng)地使致敏載體凝集的反應(yīng)。02血清學(xué)鑒定（2）間接凝集反應(yīng)法間接凝集反應(yīng)主要可分為正向間接凝集試驗(yàn)