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1、.,現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2008 Vol.8 1729,.,很長(zhǎng)時(shí)間里,蛋白質(zhì)翻譯后修飾并未引起足夠重視,直到2004 年泛素介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的發(fā)現(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)之后,這一情形才有明顯改觀。迄今,人們已發(fā)現(xiàn)多達(dá)200 多種的蛋白質(zhì)修飾。蛋白質(zhì)翻譯后修飾是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的關(guān)鍵步驟之一,是蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)反應(yīng)和相互作用的一個(gè)重要分子基礎(chǔ),同時(shí),它也是細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的重要靶點(diǎn)。 蛋白質(zhì)翻譯后修飾幾乎參與了細(xì)胞所有的正常生命活動(dòng)過程,并發(fā)揮十分重要的調(diào)控作用,目前已經(jīng)成為國(guó)際上蛋白質(zhì)研究的一個(gè)極其重要的領(lǐng)域。,.,第三章 蛋白質(zhì)翻譯后修飾,第一節(jié) 原核生物的翻譯后修飾 第二節(jié) 真核生物的翻譯后修飾,.,一
2、些新生肽鏈從核糖體上釋放下來后可以直接折疊成最終的三維結(jié)構(gòu)。但多數(shù)情況下是新生肽要經(jīng)過一系列的加工修飾,才具有功能。,第一節(jié) 原核生物的翻譯后加工,1.切除加工 2.糖基化 3.甲基化 4.磷酸化 5.乙?;?6.泛素化,.,1.切除加工 包括去掉N端的甲酰甲硫氨酸和信號(hào)肽序列。 信號(hào)肽(Signal peptide),也叫引導(dǎo)肽(leader peptide),是決定多肽最終去向的一段序列,通常較短,典型情況下位于N端。在細(xì)菌中的一個(gè)例子就是多肽要插入細(xì)胞質(zhì)膜必須借助信號(hào)肽序列。 2.糖基化 曾經(jīng)一度認(rèn)為糖基化只存在于真核細(xì)胞中,但研究表明,原核生物中也存在蛋白質(zhì)的糖基化修飾,而且由于在糖基
3、的單糖結(jié)構(gòu)和組成上的不同而顯得比真核生物中的更加豐富多樣。,.,3.甲基化 蛋白質(zhì)的甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下,甲基基團(tuán)由S- 腺苷基甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至相應(yīng)蛋白質(zhì)的過程,既可以形成可逆的甲基化修飾,如羧基端的甲基化修飾;也可以形成不可逆的甲基化修飾,如氨基端的甲基化修飾。在原核生物中也普遍存在蛋白質(zhì)的甲基化。 在大腸桿菌和有關(guān)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種甲基轉(zhuǎn)移酶能甲基化膜結(jié)合的化學(xué)受體蛋白的谷氨酸殘基。這種甲基轉(zhuǎn)移酶和另外一種甲基酯酶催化的甲基化/去甲基化過程在細(xì)菌趨化性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。,.,4.磷酸化 蛋白質(zhì)的磷酸化是指通過酶促反應(yīng)將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到目的蛋白特定的氨基酸殘基上的過程,是可逆的。這是
4、生物體內(nèi)存在的一種普遍的調(diào)節(jié)方式,在細(xì)胞信號(hào)的傳遞過程中占有極其重要的地位。 近年來,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由蛋白激酶和蛋白磷酸化酶催化的蛋白質(zhì)磷酸化/去磷酸化在原核生物中十分普遍。磷酸化/去磷酸化的意義還不太清楚。目前只知在細(xì)菌趨化性和氮代謝調(diào)空中有瞬間的磷酸化作用。,.,5.乙?;?乙?;揎検紫仁窃谡婧松镏邪l(fā)現(xiàn)的,發(fā)生乙酰化的位點(diǎn)是結(jié)合在DNA 上組蛋白的賴氨酸殘基著-NH2,對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起到重要的調(diào)節(jié)作用。隨著研究的深入,近些年在原核生物中也發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)乙酰化修飾。 DNA結(jié)合蛋白的乙酰化修飾 乙酰輔酶A合成酶(ACS)的乙?;揎?核糖體蛋白的乙?;揎?.,6.類泛素化 2008 年之前在原核生
5、物中只發(fā)現(xiàn)了蛋白酶體,卻從未發(fā)現(xiàn)泛素或類泛素的蛋白質(zhì)的修飾,因此一度認(rèn)為蛋白酶體對(duì)原核生物蛋白質(zhì)的降解完全依賴于蛋白質(zhì)自身的組成和結(jié)構(gòu)。 2008年,Pearce等在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)了與泛素功能相似的蛋白質(zhì),命名為原核類泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)。Pup可以在輔助因子的作用下標(biāo)記多種功能蛋白,并介導(dǎo)被標(biāo)記蛋白質(zhì)通過蛋白酶體降解。Pup-蛋白酶體通路的發(fā)現(xiàn)揭示了原核生物中一個(gè)嶄新的蛋白質(zhì)降解機(jī)制。,.,第二節(jié) 真核生物的翻譯后加工,許多真核生物的新生肽都要經(jīng)過翻譯后加工或修飾,這種加工修飾可以發(fā)生在延伸著的肽鏈中和翻譯后。 一般情況
6、下,翻譯后修飾一是為了功能上的需要,另一種情況是折疊成天然構(gòu)象的需要。,1.切除加工 2.糖基化 3.羥基化 4.磷酸化 5.脂?;?6.甲基化 7.乙酰化 8.泛素化 9.二硫鍵形成,.,1.切除加工 典型的情況包括切除N-端甲硫氨酸、信號(hào)肽序列和切除部分肽段將無活性的前體轉(zhuǎn)變成活性形式。 一些酶的前體(稱為前體酶proenzyme,或酶原zymegen)或無活性的多肽前體(稱為前體蛋白,proprotein)只有切除特定的肽段后才能從無活性形式轉(zhuǎn)變成活性形式。下圖是胰島素的翻譯后加工。,.,包含信號(hào)肽的胰島素前體稱為前胰島素原(pre-proinsulin)。 去掉信號(hào)肽的胰島素的前體稱為
7、胰島素原(proinsulin)。 進(jìn)一步切除稱為C鏈的肽段后才能形成活性形式的胰島素(insulin),.,蜂毒素能溶解動(dòng)物細(xì)胞,也能溶解蜜蜂自身的細(xì)胞,在細(xì)胞內(nèi)合成沒有活性的前毒素,分泌進(jìn)入刺吸器后,N端的22個(gè)氨基酸殘基被蛋白酶水解生成毒素。,.,蛋白質(zhì)內(nèi)含子 90年代初,發(fā)現(xiàn)了兩類新的內(nèi)含子。 一類是蛋白質(zhì)內(nèi)含子,其DNA序列與外顯子一起轉(zhuǎn)錄和翻譯,產(chǎn)生一條多肽鏈,然后從肽鏈中切除與內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的氨基酸序列,再把與外顯子對(duì)應(yīng)的氨基酸序列連接起來,成為有功能的蛋白質(zhì)。 另一類是翻譯內(nèi)含子,mRNA中存在與內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的核苷酸序列,在翻譯過程中這一序列被“跳躍”過去,因此產(chǎn)生的多肽鏈不含有內(nèi)含
8、子對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。,.,.,2.糖基化 真核生物中糖基化修飾很普遍。 通常情況下,分泌蛋白的寡糖鏈較復(fù)雜,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白含有較高的甘露糖。 下圖是細(xì)胞中涉及糖基化的蛋白,.,3.羥基化 在結(jié)締組織的膠原蛋白和彈性蛋白中pro和lys是經(jīng)過羥基化的。 此外,在乙酰膽堿酯酶(降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿)和補(bǔ)體系統(tǒng)(參與免疫反應(yīng)的一系列血清蛋白)都發(fā)現(xiàn)有4-羥輔氨酸。 位于粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)上的三種氧化酶(脯氨酰-4-羥化酶,prolyl-4-hydroxylase,脯氨酰-3-羥化酶和賴氨酰羥化酶,lysylhydroxylase)負(fù)責(zé)特定pro和lys殘基的羥化。 脯氨酰-4-羥化酶只羥化-Gly
9、-x-pro-,脯氨酰-3-羥化酶羥化Gly-pro-4-Hyp(Hyp: hydroxyproline),賴氨酸羥化酶只作用于-Gly-X-lys-。 膠原蛋白的脯氨酸殘基和賴氨酸殘基羥化需要Vc,飲食中Vc不足時(shí)就易患?jí)难Y(血管脆弱,傷口難愈),原因就是膠原纖維的結(jié)構(gòu)不力(weak collagen fiber structure)。,.,4.磷酸化 磷酸化是通過蛋白質(zhì)磷酸化激酶將ATP 的磷酸基轉(zhuǎn)移到蛋白的特定位點(diǎn)上的過程。大部分細(xì)胞過程實(shí)際上是被可逆的蛋白磷酸化所調(diào)控的, 至少有30%的蛋白被磷酸化修飾。 在磷酸化調(diào)節(jié)過程中,細(xì)胞的形態(tài)和功能都發(fā)生改變??赡娴牧姿峄^程幾乎涉及所有的
10、生理及病理過程, 如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生、新陳代謝、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮以及細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化等。 Fisher 和Krebs 因其在蛋白質(zhì)可逆磷酸化作為一種生物調(diào)節(jié)機(jī)制方面的研究而獲得1992 年諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。,.,.,蛋白質(zhì)磷酸化,蛋白質(zhì)磷酸化可分為4類:O-磷酸鹽、N-磷酸鹽、?;姿猁}和S-磷酸鹽。 O-磷酸鹽是通過羥基氨基酸的磷酸化形成的,如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸、羥脯氨酸或羥賴氨酸磷酸化; N-磷酸鹽是通過精氨酸、賴氨酸或組氨酸的磷酸化形成的; ?;姿猁}是通過天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的; 而S-磷酸鹽則通過半胱氨酸磷酸化形成。,.,有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK
11、s),MAPKs家族成員存在于所有的真核生物中,在多種信號(hào)傳遞過程中起作用。 它們是一類絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,Mr約為38000-55000,具有11個(gè)保守的蛋白激酶亞區(qū)。,.,該家族成員包括3種類型 :,1.分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK);,2.分裂原激活蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK),3.分裂原激活蛋白激酶的激酶之激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MAPK
12、KK),在真核細(xì)胞中,這3種類型的激酶構(gòu)成一個(gè)MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)(mitogen-activated protein kinase cascade),通過MAPKKK- MAPKK- MAPK逐級(jí)磷酸化,將外來信號(hào)級(jí)聯(lián)放大并傳遞下去。,.,MAPKKK位于級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的最上游。它能夠通過脅迫信號(hào)感受器或者信號(hào)分子的受體,或者其本身就直接感受胞外信號(hào)刺激而發(fā)生磷酸化。 MAPKKK磷酸化后變?yōu)榛罨癄顟B(tài),可以使MAPKK磷酸化。,MAPKK始終存在于細(xì)胞質(zhì)中。MAPKK磷酸化以后通過雙重磷酸化作用將MAPK激活,磷酸化的位點(diǎn)是蘇氨酸/酪氨酸(Thr/Tyr)殘基。,MAPK被磷酸化后有3種可能的去向:,
13、(1)停留在細(xì)胞質(zhì)中,激活一系列其它的蛋白激酶; (2)在細(xì)胞質(zhì)中使細(xì)胞骨架成分磷酸化; (3)進(jìn)入細(xì)胞核,通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控基因的表達(dá)。,.,5.脂?;?真核生物體內(nèi)的許多蛋白質(zhì)在翻譯合成的同時(shí)或之后,常與脂類共價(jià)連接。其連接方式有的是直接的,有的是間接的;其存在部位有的是在細(xì)胞膜外表面,有的是在細(xì)胞膜內(nèi)表面,還有的存在于細(xì)胞漿的可溶性區(qū)域中; 其功能涉及蛋白質(zhì)與膜的連接、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、形態(tài)發(fā)生、受體表達(dá)、膜融合以及保護(hù)蛋白免受水解作用等。尤其對(duì)于生物體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程起著非常關(guān)鍵的作用, 脂化蛋白相當(dāng)于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的開關(guān)。 脂化修飾多在蛋白質(zhì)分子的N端甘氨酸殘基的氨基或靠近c(diǎn)端半胱氨酸殘
14、基的巰基通過酰胺鍵或硫酯鍵與脂肪酸連接。能與蛋白質(zhì)直接相連的脂肪酸有兩種,一種是肉豆蔻酸,另一種是棕櫚酸。,.,非正常修飾的脂蛋白, 會(huì)影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程。在30的人體腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了Ras 蛋白的變體, 其中80腫瘤為惡性。在細(xì)胞內(nèi), 產(chǎn)生非正常修飾的原因是Ras 蛋白發(fā)生了點(diǎn)突變, 是化學(xué)信號(hào)刺激還是基因變異導(dǎo)致了Ras 蛋白的突變, 尚不清楚。以蛋白質(zhì)脂基化作為藥物靶點(diǎn)已取得一定成績(jī)。 法呢基轉(zhuǎn)移酶把焦磷酸法呢酯(FPP)轉(zhuǎn)移到Ras蛋白的Cys巰基上。法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在抗腫瘤治療中具有很好的療效, 而對(duì)于正常的細(xì)胞卻沒有任何毒性。同樣, 棕櫚?;D(zhuǎn)移酶抑制劑也表現(xiàn)出抗腫瘤特性, 對(duì)于乳
15、腺癌、前列腺癌等均有作用。,圖片:Ras蛋白的脂化修飾,生命的化學(xué),1996.5,.,6.甲基化 蛋白質(zhì)的甲基化修飾是在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下, 在賴氨酸或精氨酸側(cè)鏈氨基上進(jìn)行的甲基化。甲基化增加了立體阻力, 并且取代了氨基的氫, 影響了氫鍵的形成。 因此, 甲基化可以調(diào)控分子間和分子與目標(biāo)蛋白的相互作用。 另外也有對(duì)天冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈羧基進(jìn)行甲基化形成甲酯的形式。天冬氨酸的甲基化能促進(jìn)已破壞蛋白的修復(fù)或降解。,.,組蛋白上的甲基化修飾 組蛋白對(duì)于轉(zhuǎn)錄等過程至關(guān)重要, 它是通過對(duì)其末端的化學(xué)修飾作用如磷酸化、乙?;图谆葏⑴c細(xì)胞核中生命活動(dòng)。組蛋白賴氨酸和精氨酸的甲基化同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和異染色體的形
16、成有關(guān)。組蛋白乙?;皆黾优c轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)有關(guān), 而組蛋白甲基化修飾的結(jié)果則相對(duì)復(fù)雜, 它可以是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)或轉(zhuǎn)錄抑制。 組蛋白賴氨酸甲基化 組蛋白精氨酸甲基化,.,組蛋白賴氨酸甲基化。 組蛋白賴氨酸甲基化發(fā)生在H3-K4, H3-K9, H3-K27, H3-K36, H3-K79和H4-K20 上, 還可發(fā)生于H1 N 端。 H3-K9, H3-K27,H4-K20 的甲基化與染色體的鈍化過程有關(guān), 而H4-K9 的甲基化可能與大范圍的染色質(zhì)水平的抑制有關(guān)。 H3-K4, H3-K36, H3-K79 位的甲基化與染色體轉(zhuǎn)錄激活過程有關(guān), 其中H3-K4 的單甲基化修飾可以對(duì)抗H4-K9 甲基
17、化所導(dǎo)致的基因抑制。,.,組蛋白精氨酸甲基化 組蛋白精氨酸甲基化位點(diǎn)為H3-R2, H3-R4, H3-R17, H3-R26, 它們都可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。,.,7.乙酰化 組蛋白的乙?;龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄,去乙?;种妻D(zhuǎn)錄。 多聚谷氨酰胺疾病是一種神經(jīng)退行性遺傳病是由致病基因CAG 重復(fù)片段的擴(kuò)大引起的。研究顯示, 在擴(kuò)大的多谷氨酰胺誘導(dǎo)的疾病中, 蛋白的乙?;腿ヒ阴;氖Ш馐且粋€(gè)關(guān)鍵的過程。,.,8.二硫鍵形成 二硫鍵通常只發(fā)現(xiàn)于分泌蛋白(如胰島素)和某些膜蛋白中,在細(xì)胞質(zhì)中由于有各種還原性物質(zhì)(如谷胱甘肽glutathione和硫氧還蛋白thioredoxin),所以細(xì)胞質(zhì)蛋白沒有二硫鍵。 因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)
18、腔是一個(gè)非還原性環(huán)境,所以粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的新生肽只暫時(shí)形成二硫鍵。當(dāng)新生肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔時(shí),一些肽鏈可能會(huì)按氨基酸次序依次暫時(shí)形成二硫鍵,但最終會(huì)通過交換二硫鍵位置的形式形成正確的結(jié)構(gòu),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可能還有二硫鍵異構(gòu)酶(disulfide isomerase)催化該過程。,.,9.泛素化 泛素由76個(gè)氨基酸組成, 高度保守, 普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi),故名泛素。共價(jià)結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶識(shí)別并降解, 這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑。與消化道內(nèi)進(jìn)行的蛋白質(zhì)水解不同,從泛素與蛋白的結(jié)合到將蛋白水解成小的肽段, 整個(gè)水解過程需要能量參與。,.,泛素-蛋白酶系統(tǒng) 泛素-蛋白酶系統(tǒng)是存在于所有
19、真核生物細(xì)胞的調(diào)控系統(tǒng)。20 世紀(jì)7080 年代, 泛素調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解的機(jī)理之謎被揭開,降解過程中需要三種酶的參與: 泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素蛋白質(zhì)連接酶(E3)。 泛素化降解蛋白的過程中對(duì)蛋白的特異性識(shí)別依賴E3。由E2s 和E3s 介導(dǎo)的泛素化過程可以被去泛素化酶(DUBs)逆轉(zhuǎn)。 目前發(fā)現(xiàn)的DUBs 可分為兩大類:泛素碳端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolases,UCHs)和泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-spicific processing proteases,UBPs), 兩者都是半胱氨酸水解酶。通常情況下, UCHs 主要水解羰基端的酯和泛素的氨基鍵, 也可以分解泛素前體, 生成活潑的泛素分子; UBPs 分解泛素多聚體鏈。,.,泛素-蛋白酶系統(tǒng)對(duì)蛋白特異性水解機(jī)理,E1-SH,E1-SH,E2-SH,E2-SH,ATP AMP+PPi,E3,多泛素化蛋白,ATP,26S蛋白酶體,20S蛋白酶體,ATP,19S調(diào)節(jié)亞基,去折疊,水解,E1:泛素激活酶 E2:泛素載體蛋白 E3:泛素-蛋白質(zhì)連接酶,ubiquitin,.,DUBs 參與的泛素化調(diào)控,.,不同翻譯
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