分離以尿素為氮源的微生物(上課)...ppt

1、實(shí)驗(yàn)2 分離以尿素為氮源的微生物,此實(shí)驗(yàn)課題意義何在？,1、尿素,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、脲酶,土壤中的某些細(xì)菌能夠合成脲酶，并且向胞外分泌。,分離以尿素為氮源的微生物,怎么分離出能分解尿素的微生物呢？,菌種可能在什么環(huán)境中較多？,實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：,人為提供促進(jìn)目的菌株生長的條件(包括 營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微 生物生長。,選擇性培養(yǎng)基,分離能夠分解尿素的選擇性培養(yǎng)基成分：,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？,固體培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,培養(yǎng)

2、基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理?,分離能夠分解尿素的選擇性培養(yǎng)基成分：,氮源真的唯一嗎？,1、瓊脂作為微生物固體培養(yǎng)基不可缺少的組成 成分，其優(yōu)點(diǎn)是： 其主要成分不能被微生物利用； 可使培養(yǎng)基固化； 不影響培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)物質(zhì)被微生物吸收。 2、瓊脂的成分 瓊脂是一種未被純化的混合物，主要成分為瓊脂糖和瓊脂果膠，還含有少量的含氮化合物，及其它有機(jī)雜質(zhì)和不溶性雜質(zhì)。,用瓊脂糖代替瓊脂作為微生物培養(yǎng)基的固化劑.

3、 盡可能使培養(yǎng)基中只含尿素一種含氮化合 物，以防止瓊脂中的含氮化合物被以尿素為氮 源的細(xì)菌利用，有利于對(duì)這類細(xì)菌的篩選。,分離能夠分解尿素的選擇性培養(yǎng)基成分：,對(duì)培養(yǎng)基的滅菌方法？,G6玻璃砂漏斗過濾,怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？,以尿素為 唯一氮源 的培養(yǎng)基,牛肉膏 蛋白胨 培養(yǎng)基,是,分離 尿素 細(xì)菌,判斷該 培養(yǎng)基 有無選 擇性,只生長尿素細(xì)菌,生長多種微生物,是,選擇培養(yǎng)基,分離土壤中分解尿素的微生物并計(jì)數(shù),.篩選菌株,.分離出單個(gè)菌落并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,.設(shè)置對(duì)照,平板劃線法,稀釋涂布法,稀釋涂布平板法 原理： 將樣品進(jìn)行稀釋，在稀釋度足夠高時(shí)， 微生物在固體培養(yǎng)基上能形成單個(gè)菌落。

4、所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成 的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。,實(shí)驗(yàn)的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先滅菌好的信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。 .制備培養(yǎng)基： 制備以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基。 制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基。,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,三樣品的稀釋,移液槍（微量可調(diào)移液管）,注意事項(xiàng) 為使結(jié)果接近真實(shí)值將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。如

5、果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。 統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。,分離不同的微生物采用不同的稀釋度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,實(shí)驗(yàn)中提供的選擇培養(yǎng)基的配方中，尿素是培養(yǎng)基中的惟一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。但實(shí)際上，微生物的培養(yǎng)是一個(gè)非常復(fù)雜的問題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物不一定是所需要的微生物，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。,在實(shí)驗(yàn)中，酚紅作為酸堿指示劑被添加到了培養(yǎng)基中

6、，其變色范圍是pH6.48.2，在酸性情況下呈黃色，堿性情況下呈紅色，這種添加了酸堿指示劑的培養(yǎng)既可以鑒別和分離出能夠產(chǎn)生脲酶分解尿素的微生物，稱為鑒別培養(yǎng)基。,尿素在被脲酶催化分解前是中性的，由于尿素在脲酶的催化下分解產(chǎn)生了NH3，溶液會(huì)呈堿性。,分離能夠分解尿素的選擇性培養(yǎng)基成分：,鑒別培養(yǎng)基,酚紅,選擇培養(yǎng)基,鑒別培養(yǎng)基,在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，培養(yǎng)基中將出現(xiàn)紅色環(huán)帶的菌落，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。,測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍(lán) 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過

7、記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。,大腸桿菌呈 黑色中心 ,有或無金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征,顯微鏡直接計(jì)數(shù)：,利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容 積里樣品中微生物的數(shù)量。,顯微鏡直接計(jì)數(shù)：,不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度； 個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點(diǎn),設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。,設(shè)置對(duì)照：,實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌 落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106 倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌 落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下 只選擇出大約50個(gè)菌落。分

8、析其原因。,原因：土樣不同， 培養(yǎng)基污染或操作失誤 (或者是混入了其他的含氮物質(zhì)),小結(jié)：通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。,方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn),方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 1.通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。 2.提示：選擇每個(gè)平板上長有30300個(gè)菌落

9、的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。,六、例題解析,例1對(duì)細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是 A在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B至少接種一種細(xì)菌 C接種一個(gè)細(xì)菌 D及時(shí)補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì),解析：細(xì)菌群體生長規(guī)律的測定是人們?cè)谝欢l件下進(jìn)行的。這些條件是：一種細(xì)菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時(shí)測定細(xì)菌總數(shù)。在這些條件下，才能測定出細(xì)菌的生長規(guī)律。測定時(shí)只能用一種細(xì)菌的子細(xì)胞群體的變化規(guī)律表達(dá)微生物的生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過樣品推測細(xì)菌總數(shù)。若接種多種細(xì)菌，則會(huì)發(fā)生種間斗爭而不能測定一種微生物的

10、生長規(guī)律。在接種時(shí)，要保證一定的接種量。,答案：A,例2在微生物群體生長規(guī)律的測定中，種內(nèi)斗爭最顯著最激烈的時(shí)期是 A調(diào)整期 B對(duì)數(shù)期 C穩(wěn)定期 D衰亡期,解析：種內(nèi)斗爭是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭反應(yīng)了種內(nèi)生物對(duì)生存空間和生活資源的爭奪。在生活空間充裕，營養(yǎng)充足的時(shí)候，種內(nèi)斗爭的程度是比較低的。隨著微生物個(gè)體數(shù)目的增加，每個(gè)個(gè)體的生存空間越來越少，營養(yǎng)物質(zhì)也越來越少，每個(gè)個(gè)體對(duì)生存空間和資源的爭奪也越來越激烈，種內(nèi)斗爭就越來越激烈。由此可知，在穩(wěn)定期的種內(nèi)斗爭最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開始減少，pH已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級(jí)代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時(shí)的微生物的生存斗爭主要是與無

11、機(jī)環(huán)境的斗爭。,答案：C,1.對(duì)細(xì)菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（ ） A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B.至少接種一種細(xì)菌 C.接種一個(gè)細(xì)菌 D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細(xì)菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,實(shí)踐訓(xùn)練,A,C,D,4.下列說法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值 C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。 5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（ ） A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽,B,C,例3（2005年江蘇）抗生素作為治療細(xì)菌感染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用具有劃時(shí)代的意義。 青霉素發(fā)酵產(chǎn)生青霉素。青霉菌的新陳代謝類型是 ， 青霉素