產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選及培養(yǎng)

1、產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選及培養(yǎng)一、篩選步驟1、菌種的采集 采集山上距濕潤的表層10cm處的土壤樣本40g左右，用研缽研成粉末稱取1g樣本加入滅菌的250mL錐形瓶中，加入99mL無菌水搖勻靜置。2、菌種初篩 （1）按照配方配制200mL CMC培養(yǎng)基，取1 X 250mL空錐形瓶和6 X 15mL試管，塞上棉塞并用報紙、棉線包扎，用報紙、棉線將試管包扎成一捆；取12套培養(yǎng)皿碼齊包扎。將上述器材與培養(yǎng)基、無菌水121高壓蒸汽滅菌20min。 （2）于無菌臺上倒9個CMC培養(yǎng)基備用。 （3）另取6支15mL經(jīng)滅菌的試管，用移液槍吸取土壤溶液（上清液）1.000mL加入1號試管，加無菌水9.000mL。

2、混勻后吸取1.000mL加入2號試管，重復(fù)上述操作，進(jìn)行6次梯度稀釋。 （4）待CMC培養(yǎng)基冷卻后，在超凈工作臺分別吸取104、105、106倍稀釋液0.100mL于CMC培養(yǎng)基上稀釋涂布，每種稀釋液涂布三份。 （5）將上述培養(yǎng)基置于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，標(biāo)記菌落并記錄各菌落形態(tài)（菌落高度、質(zhì)地、顏色、氣味、著生狀態(tài)、邊緣及表面紋理等）。 （6）配制200mL剛果紅家別培養(yǎng)基，與三套培養(yǎng)皿一起121滅菌20min。 （7）在無菌操作臺上倒3個鑒別培養(yǎng)基備用。 （8）將各菌落用牙簽接種到冷卻了的剛果紅鑒別培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)24h，挑選5株透明圈直徑與菌落直徑比最大的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。3、菌種

3、復(fù)篩 （1）配制500mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝到5只250mL的錐形瓶中，121高壓蒸汽滅菌20min。 （2）將初篩得到的菌株用接種環(huán)接種于液體培養(yǎng)基上（2環(huán)），37、150r/min下培養(yǎng)23天，轉(zhuǎn)入4冰箱保藏。二、培養(yǎng)方法 1清洗實驗器具 2滅菌 3配培養(yǎng)基（纖維素作唯一能量源的培養(yǎng)基） 4倒平板 +選擇培養(yǎng)原菌（可能會用搖床） 5稀釋菌樣 6涂布平板或平板劃線 7放入恒溫箱（調(diào)制均適宜的溫度）12-24h ，之后就可以收獲細(xì)菌了 8觀察記錄（數(shù)量、分布等）三、培養(yǎng)基種類及其組成1、初篩CMC培養(yǎng)基：CMC 5g、蛋白胨1 g、FeSO47H2O 0.005 g、NaCl 0.25 g、

4、瓊脂粉10g 于1000mL錐形瓶中加蒸餾水至500mL、調(diào)節(jié)pH 7276，加棉塞121滅菌20min。剛果紅培養(yǎng)基： (NH4)2S04 2 g，MgS047H20 0.5 g，K2HP04 1 g，NaCl 0.5 g，微晶纖維素2 g，剛果紅0.4 g，瓊脂20 g，加水至1000 mL。 無菌水：取1只1000mL的錐形瓶，各加水1000mL，加棉塞與CMC培養(yǎng)基一起滅菌20 min。另取1只250mL空錐形瓶、6支15mL試管和12套培養(yǎng)皿滅菌備用。2、復(fù)篩基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10g，蛋白胨10g，KH2PO4 19，MgSO4 029，Nacl 10g水1000mL，pH調(diào)至7，121滅菌20min3、培養(yǎng)纖維素培養(yǎng)基:硫酸銨2.0g，硫酸鎂0.5g，磷酸二氫鉀1.0g，氯化鈉0