高通量測序技術(shù)的類型原理及應(yīng)用ppt課件

1、,高通量測序技術(shù),姓 名：趙 淑 莉 學(xué) 校：吉林大學(xué),1,主要內(nèi)容,概 述,致 謝,2,概 述,高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing),又稱“下一代”測序技術(shù)”、深度測序,以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。,這使得對一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能。,3,類型及原理,目前，所說的高通量測序技術(shù)主要是指454 Life Sciences 公司、ABI 公司和Illumina公司推出的第二代測序技術(shù)以及Helicos Heliscope TM 和Pacific Biosciences 推出的單分子測序技術(shù)

2、。,4,2005年，454 Life Sciences 公司( 現(xiàn)已被Roche公司收購) 首先推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)，開創(chuàng)了第二代測序技術(shù)的先河。,第二代測序技術(shù),5,原理：酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 1.首先將PCR 擴(kuò)增的單鏈DNA 與引物雜交，并與DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、底物熒光素酶和5-磷酸硫酸腺苷共同孵育。,第二代測序技術(shù),2.在每一輪測序反應(yīng)中只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸。,6,原理：酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 3.焦磷酸鹽被硫酸化酶轉(zhuǎn)化為ATP，ATP

3、就會(huì)促使氧合熒光素的合成并釋放可見光，CCD 檢測后通過軟件轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值，峰值與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。,第二代測序技術(shù),7,此后，Illumina 公司和ABI 公司相繼推出了Solexa和SOLiD(supported oligo ligation detetion)測序技術(shù)。,第二代測序技術(shù),8,即生成新DNA 互補(bǔ)鏈時(shí)，要么加入的dNTP 通過酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)催化底物激發(fā)出熒光，要么直接加入被熒光標(biāo)記的dNTP 或半簡并引物，在合成或連接生成互補(bǔ)鏈時(shí)釋放出熒光信號(hào)。 通過捕獲光信號(hào)并轉(zhuǎn)化為一個(gè)測序峰值，獲得互補(bǔ)鏈序列信息。,原理：與焦磷酸測序法的類似，核心思想都是邊合成邊測序(se

4、quencing by synthesis)。,第二代測序技術(shù),9,第二代測序技術(shù),優(yōu)點(diǎn)： 操作極為簡便：無需進(jìn)行電泳； 可以在芯片上進(jìn)行高通量分析； 大大節(jié)省了成本和時(shí)間。,10,Illumina公司目前擁有三種測序平臺(tái)，分別為HiSeq 2000、HiSeq 1000、Genome Analyzer IIx ( )； ABI 公司則主要是SOLiD 3 和SOLiD 4 兩個(gè)測序平臺(tái)。 從通量這個(gè)最直觀的數(shù)字看來，HiSeq 2000領(lǐng)先于SOLiD 4。 HiSeq 2000 測序平臺(tái)單次反應(yīng)可以讀取200G的數(shù)據(jù)，而SOLiD 4 僅為100G 左右。,第二代測序技術(shù),11,就測序讀長

5、來說，454 測序平臺(tái)讀長最長，目前已經(jīng)達(dá)到400nt。因此，454 平臺(tái)比較適合對未知基因組從頭測序，但是在判斷連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)時(shí)準(zhǔn)確度不高。 Solexa 測序讀長較454 短，僅為100nt 左右，但測序通量高、價(jià)位低，適合基因組重測序等。 SOLiD 讀長也較短，但測序精度較高，特別適合SNP 檢測等。,12,在第二代測序平臺(tái)不斷完善和廣泛應(yīng)用的同時(shí)，以對單分子DNA進(jìn)行非PCR測序?yàn)橹饕卣鞯母碌臏y序技術(shù)也初顯端倪。 2008年4月Helico BioScience公司的Harris等在Science上報(bào)道了他們開發(fā)的基于全內(nèi)反射顯微鏡(total Internal reflect

6、ion microscopy,TIRM) 的測序技術(shù)單分子測序技術(shù)。,單分子測序技術(shù),13,基于全內(nèi)反射顯微鏡(total Internal reflection microscopy, TIRM) 的測序技術(shù)原理： 1.將待測DNA樣品隨機(jī)打斷成小片段，在每個(gè)小片段的末端加上poly-dA； 2.將小片段DNA模板與固定在檢測芯片上的poly-dT 引物進(jìn)行雜交并精確定位，并逐一加入熒光標(biāo)記的末端終止子；,單分子測序技術(shù),14,3.洗滌、成像，切開熒光染料和抑制基團(tuán)； 4.洗滌、加帽，允許下一個(gè)核苷酸的摻入； 5.這樣通過摻入、檢測和切除的反復(fù)循環(huán)，即可實(shí)時(shí)讀取大量序列。,15,單分子實(shí)時(shí)技

7、術(shù)(SMRT),單分子測序技術(shù),該技術(shù)利用單分子技術(shù)和DNA聚合酶，在聚合反應(yīng)的同時(shí)就可以讀取測序產(chǎn)物。,SMRT測序技術(shù)在測序速度、讀長和成本方面有著巨大的優(yōu)勢和潛力。,16,Ion PGM測序技術(shù) 原理 基于半導(dǎo)體芯片技術(shù)，在半導(dǎo)體芯片的微孔中固定DNA鏈，隨后依次摻入ACGT，隨著每個(gè)堿基的摻入，釋放出氫離子，在它們穿過每個(gè)孔底部時(shí)能被檢測到。,單分子測序技術(shù),17,主要優(yōu)點(diǎn)： 大大節(jié)省了成本和時(shí)間 主要缺點(diǎn)： 測序儀的價(jià)格昂貴,單分子測序技術(shù),18,目前Helico BioScience公司的HeliScope測序儀售價(jià)近百萬美元，這是一般實(shí)驗(yàn)室和科研單位所不能承受的。 Life Te

8、chologies公司推出的Ion Personal Genome Machine (PGMTM) 測序儀價(jià)格僅為普通測序儀的1/10，而且研究人員能夠在2h內(nèi)獲取從10Mb到1Gb以上高精確度序列。,單分子測序技術(shù),19,大規(guī)模平行測序(massively parallel signature sequencing，MPSS)：它利用芯片進(jìn)行測序，可以在數(shù)百萬個(gè)點(diǎn)上同時(shí)閱讀測序，把平行處理的思想用到極致。,高通量測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),成本低廉：利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行人類基因組測序，耗資不到傳統(tǒng)測序法的1%。,20,高通量測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),高通量測序技術(shù)有完美的定量功能：這是因?yàn)闃悠分心撤NDNA被測序

9、的次數(shù)反映了樣品中這種DNA的豐度。這一點(diǎn)有望取代以前的基因表達(dá)芯片技術(shù)用于基因表達(dá)的研究。,21,高通量測序技術(shù)的應(yīng)用,大規(guī)?；蚪M測序 基因表達(dá)分析 非編碼小分子RNA的鑒定 轉(zhuǎn)錄因子靶基因的篩選 DNA甲基化相關(guān)研究 其他,22,全基因組測序,高通量測序技術(shù)在發(fā)展初期由于讀長較短，使其在對未知基因組從頭測序( denovo Sequencing) 的應(yīng)用受到限制，只能用于基因組重測序。 基因組重測序是指對已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測序，并在此基礎(chǔ)上對個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。,23,高通量RNA測序及其在轉(zhuǎn)錄組和基因表達(dá)調(diào)控上的應(yīng)用,最近科學(xué)家們將高通量測序技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組

10、分析開發(fā)出了RNA測序技術(shù)(RNA-Seq) ，該技術(shù)能夠在全基因組范圍內(nèi)檢測基因表達(dá)情況，進(jìn)行差異基因篩選分析。 由于RNA-Seq技術(shù)具有通量高、可重復(fù)性高、檢測范圍寬、定量準(zhǔn)等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、擬南芥、水稻和人類等生物轉(zhuǎn)錄組的研究。,24,轉(zhuǎn)錄組研究是從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)。但是，多數(shù)研究人員感興趣的是某一特定的生物過程、發(fā)育階段或處理后的基因表達(dá)情況。 建立在高通量測序基礎(chǔ)上的數(shù)字化基因表達(dá)譜(digital gene expression profiling)分析無需預(yù)先針對已知序列設(shè)計(jì)探針，即可對任何生物整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測，因此應(yīng)用范圍更加廣泛。,25,高通量

11、RNA 測序技術(shù)另一個(gè)廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小RNA 的研究。 小RNA在植物的生長、發(fā)育和外界脅迫應(yīng)答等方面具有重要功能。 但由于小RNA序列短、同源性高，因此利用基因芯片檢測小RNA非常困難。 高通量測序技術(shù)不但能夠克服這一難題，而且能夠發(fā)現(xiàn)新的小RNA。目前，高通量測序技術(shù)已經(jīng)成功的應(yīng)用于擬南芥、水稻和小麥等生物小RNA的研究。,26,ChIP-Seq 技術(shù)及其在DNA和蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用,染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immuno- precipitation，ChIP) 技術(shù)是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA 之間相互作用的強(qiáng)有力工具，在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或組蛋白特異性修飾位點(diǎn)的研究中

12、被廣泛應(yīng)用。,27,染色質(zhì)免疫共沉淀測序(chromatin immune precipitation sequencing，ChIP-Seq) 技術(shù)充 分結(jié)合了ChIP和高通量測序技術(shù)的優(yōu)勢，能夠在全基因組范圍內(nèi)高效地研究目的蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。,28,該技術(shù)的原理： 1.通過ChIP技術(shù)利用抗體特異性地富集交聯(lián)的目的蛋白-DNA復(fù)合體； 2.將得到的DNA片段進(jìn)行高通量測序； 3.將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA 區(qū)段信息。,29,基因組DNA 甲基化分析,DNA甲基化在維持細(xì)胞正常功能、遺傳印記和胚胎發(fā)育過程中起著極其重要的作

13、用。 新一代高通量測序技術(shù)使得基因組整體水平高精度的甲基化檢測成為現(xiàn)實(shí)。 目前，高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于擬南芥、水稻、蠶和人等生物DNA甲基化的研究，并取得了豐碩的成果。,30,目前，已經(jīng)建立了至少三種依賴于高通量測序的DNA甲基化分析技術(shù)： 甲基化DNA免疫共沉淀測序( methylated DNA immunoprecipitation sequencing，MeDIP-Seq)； 甲基結(jié)合蛋白測序(methyl-binding protein sequencing，MBD-Seq ) ； 亞硫酸氫鹽測序( bisulfite-sequencing，BS-Seq)。,31,MeDIP-Seq和MBD-Seq首先通過特異性結(jié)合甲基化DNA的MBD2b 或5-甲基胞嘧啶抗體富集高甲基化的DNA，然后再對富集到的片段測序； MeDIP-Seq 和MBD-Seq 都是基于富集的原理，二者是相輔相成的。MeDIP-Seq 對高度甲基化和高密度的CpG 更加敏感，而MDB-Seq 對高度甲基化和中等密度的CpG 更加敏感； BS-Seq不經(jīng)過富集直接測序。,32,存在的問題,測序速度提高了，但后續(xù)的海量測序數(shù)據(jù)的分析卻成為一大難題。 不適合小規(guī)模測序。 新一代測序儀價(jià)格昂貴