第4章 人工染色體載體.ppt

1、西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,1,第四章 人工染色體載體,第一節(jié) 粘粒載體 第二節(jié) 酵母人工染色體載體 第三節(jié) 細(xì)菌人工染色體載體 第四節(jié) P1噬菌體載體和P1人工染色體載體,本課件是在網(wǎng)絡(luò)資源基礎(chǔ)上改進(jìn)而成，在此對(duì)有關(guān)人士特致感謝！,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,2,常規(guī)載體在工作時(shí)都是在不影響質(zhì)?；蚴删w復(fù)制功能的基礎(chǔ)上裝載外源DNA片段的，同時(shí)保持質(zhì)?；蚴删w的基本特性。這樣一來(lái)，這些載體所裝載的容量就受到限制。利用染色體的復(fù)制元件來(lái)驅(qū)動(dòng)外源DNA片段的載體稱為人工染色體載體，其裝載外源DNA片段的容量可以與染色體的大小媲美。,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,3,第一節(jié) 粘粒載體,一

2、、粘粒的結(jié)構(gòu)特征和用途 粘粒實(shí)際是質(zhì)粒的衍生物，是帶有cos序列的質(zhì)粒。cos序列是l噬菌體DNA中將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需的DNA序列。粘粒的組成包括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)、抗性標(biāo)記、cos位點(diǎn)，因而能像質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。 它的大小一般5-7kb左右，用來(lái)克隆大片段DNA，克隆的最大DNA片段可達(dá)45kb。有的粘粒載體含有兩個(gè)cos位點(diǎn)，在某種程度上可提高使用效率。,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,4,二、粘粒載體的工作原理 粘粒載體的主要工作原理類似l噬菌體載體。在外源片段與載體連接時(shí)，粘粒載體相當(dāng)于l噬菌體載體的左右臂， cos位點(diǎn)通過(guò)粘段退火后，再于外源片段相間連接成多聯(lián)體。當(dāng)多聯(lián)體與l

3、噬菌體包裝的蛋白質(zhì)混合時(shí)l噬菌體A基因蛋白的末端酶功能將切割成兩個(gè)cos位點(diǎn)，并將兩個(gè)同方cos位點(diǎn)之間的片段包裝到l噬菌體顆粒中去。 允許插入片段為30-45kb。,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,5,三、粘?？寺≥d體 粘粒pJB8、含雙cos位點(diǎn)的粘粒載體、pcos1 EMBL等。 四、粘粒載體文庫(kù)的擴(kuò)增和貯存 噬菌體顆粒狀的粘粒文庫(kù)在含有幾滴氯仿的SM溶液中可以保存幾周。 可以采用影印到硝酸纖維素膜上保存、挑取所有菌落混合培養(yǎng)后深冷保存，等。 五、粘粒載體文庫(kù)的常見問(wèn)題 載體分子自連，重組率降低 多個(gè)外源片段串聯(lián)進(jìn)入載體中 原料DNA片段短于200kb時(shí)，制備的目的DNA中相當(dāng)一部分的末

4、端的一端不帶酶切位點(diǎn) 總DNA純度影響目的DNA的制備 空載體現(xiàn)象 不同重組子的拷貝數(shù)不同 文庫(kù)的代表性不足，缺泛一些目標(biāo)基因。,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,6,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,7,第二節(jié) 酵母人工染色體載體,酵母人工染色體載體（yeast artificial chromosome，YAC）：就是模擬酵母菌染色體的復(fù)制而構(gòu)建的載體。,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,8,一、YAC載體的復(fù)制元件 YAC載體的復(fù)制元件是其核心組成成分，騎在酵母中復(fù)制的必須元件包括復(fù)制起點(diǎn)序列即自主復(fù)制序列、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒和兩個(gè)端粒。這些元件能夠滿足自主復(fù)制、染色體在子代細(xì)

5、胞間的分離及保持染色體穩(wěn)定的需要。,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,9,端粒重復(fù)序列：是定位于染色體末端的一段序列，用于保護(hù)線狀DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，已形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。 著絲粒：是有絲分裂過(guò)程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過(guò)程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)人工染色體的作用。,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,10,二、YAC載體的工作原理 YAC載體主要是用來(lái)構(gòu)建大片段DNA文庫(kù)，特別是用來(lái)構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫(kù)，并不用作常規(guī)的基因克隆。圖示是pYAC4載體的遺傳結(jié)構(gòu)圖，當(dāng)用BamH切割成現(xiàn)狀后，就形成了一個(gè)微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元

6、件。這些元件在酵母菌中可以驅(qū)動(dòng)染色體的復(fù)制和分配，從而決定著個(gè)微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的DNA片段。 允許插入片段大?。簺](méi)有限制，一般為250-400kb。,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,11,YAC載體的原理性工作流程：,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,12,對(duì)于BamH切割后形成的微型酵母染色體，當(dāng)用EcoR或Sma切割抑制基因sup4內(nèi)部的位點(diǎn)后形成染色體的兩條臂，與外源大片段DNA在該切點(diǎn)相連就形成一個(gè)大型人工酵母染色體，轉(zhuǎn)化到酵母菌后可像染色體一樣復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中去，達(dá)到克隆大片段DNA的目的外源DNA片段的裝載導(dǎo)致抑制基因sup4插入失活，從而使重組菌形成

7、紅色菌落；而載體自身連接轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞后所形成的菌落為白色。 YAC的缺點(diǎn)：插入片段容易出現(xiàn)缺失和重排現(xiàn)象，YAC與酵母染色體大小相似不容易分離和純化。 YAC的優(yōu)點(diǎn)：酵母細(xì)胞比大腸桿菌對(duì)不穩(wěn)定的、重復(fù)的和極端的DNA片段有更強(qiáng)的容忍性，文庫(kù)的代表性強(qiáng)，適合作真核染色體片段功能研究。,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,13,第三節(jié) 細(xì)菌人工染色體載體,細(xì)菌人工染色體載體（bacterial artificial chromosome，BAC）：就是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的高容量低拷貝質(zhì)粒載體。 F質(zhì)粒：是一個(gè)約100kb的質(zhì)粒，編碼60多種參與復(fù)制、分配和結(jié)合過(guò)程的蛋白質(zhì)。,西南大學(xué)生物技術(shù)專

8、業(yè) 基因工程,14,一、BAC載體及其結(jié)構(gòu)組成 BAC載體大小約7.5kb，其本質(zhì)是一個(gè)質(zhì)?？寺≥d體。BAC載體與常見克隆載體的核心區(qū)別在于其復(fù)制單元的特殊性。 復(fù)制單元來(lái)自F質(zhì)粒，包括嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制區(qū)oriS、啟動(dòng)DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動(dòng)的解旋酶（RepE），以及3個(gè)確保低拷貝并使質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座（parA、parB、parC）。,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,15,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,16,二、BAC載體工作原理 BAC載體的工作原理與常規(guī)的質(zhì)粒克隆載體相似。不同的是，BAC載體裝載的是大片段DNA，一般在100300kb。對(duì)如此大的DNA片段一般要通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳來(lái)分離。另外，由于BAC載體的拷貝數(shù)小，制備難度大。為解決這個(gè)問(wèn)題，有的學(xué)者將BAC載體作為外源片段克隆到常規(guī)高拷貝質(zhì)粒載體上，從而在大腸桿菌中以多拷貝的形式復(fù)制，便于載體的制備，使用時(shí)將高拷貝質(zhì)粒去掉。,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,17,第四節(jié) P1噬菌體載體和P1工人染色體載體,一、P1噬菌體的分子特征： 雙鏈線狀DNA，110kb，末端具有10kb左右冗余序列，感染進(jìn)入大腸桿菌后冗余序列發(fā)生重組，形成環(huán)狀分子，c決定進(jìn)入溶原或裂解狀態(tài)。 包裝方式與不同。 二、P1噬菌體載體元件：復(fù)制元件、環(huán)化和