分子克隆工具酶-13級(jí).ppt

1、第三章 分子克隆工具酶,第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶 第二節(jié) 甲基化酶 第三節(jié) DNA聚合酶 第四節(jié) 其他分子克隆工具酶,第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶,一、限制與修飾 二、限制酶識(shí)別的序列 三、限制酶產(chǎn)生的末端 四、線性DNA末端對(duì)酶切的影響 五、酶切反應(yīng)條件 六、酶切位點(diǎn)的引入,一、限制與修飾,細(xì)菌的限制與修飾系統(tǒng)(R/M系統(tǒng)) 由限制酶（限制性核酸內(nèi)切酶）和修飾酶（甲基化酶）組成。 R / M系統(tǒng)的作用：保護(hù)自身的DNA不受切割；破壞外源DNA使之迅速降解。 噬菌體在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率。（見p17） 實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：K菌株和B菌株中存在一種限制作 用，可排除外來(lái)的DNA.,限制酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)

2、定的保護(hù)機(jī)制,識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來(lái)遺傳物質(zhì),AN6-MeA C5-MeC,限制酶的發(fā)現(xiàn) 美國(guó)約翰.霍布金斯大學(xué)的H.Smith于1970年偶然發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)能迅速降解外源的噬菌體DNA，其細(xì)胞提取液可降解E.coli DNA，但不能降解自身DNA，從而找到Hind II限制性內(nèi)切酶。 限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)是一類能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶。 限制酶的生物學(xué)功能 用來(lái)保護(hù)宿主不受外來(lái)DNA的感染，可降解外來(lái)的DNA，從而阻止其復(fù)制和整合到細(xì)

3、胞中。,限制酶的種類 型酶 (種類很少，只占1%) 三亞基雙功能酶，分子量較大，反應(yīng)需Mg2+、ATP 有特異識(shí)別位點(diǎn)但沒有特異切割位點(diǎn) 型酶 (占90%以上) 分子量較小，反應(yīng)只需Mg2+； 識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，切割位點(diǎn)在回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)上； 多數(shù)型酶切割DNA后形成粘性末端 型酶 (種類更少，不到1%) 二亞基雙功能酶，能識(shí)別特定順序，在該順序的3端2426 bp處切開DNA，切割位點(diǎn)沒有特異性。,限制酶的命名原則 第1個(gè)字母：大寫，來(lái)自微生物屬名第1個(gè)字母 第2和3字母：小寫，來(lái)自微生物種名前兩個(gè)字母 其它字母：大寫或小寫，來(lái)自微生物菌株號(hào) 羅馬數(shù)字：該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào) 例：E

4、coR I 來(lái)源于Escheria coli RY13的第一個(gè)限制酶，其識(shí)別序列為：GAATTC；,二、限制酶識(shí)別的序列,識(shí)別序列的長(zhǎng)度 一般為48個(gè)堿基，最常見的為6個(gè)堿基. 4 bp識(shí)別序列：Sau3AI GATC 5 bp識(shí)別序列：EcoR CCWGG (W=A/T) 6 bp識(shí)別序列：EcoR GAATTC 7 bp識(shí)別序列：BbvCI CCTCAGC 8 bp識(shí)別序列：NotI GCGGCCGC 當(dāng)DNA中可識(shí)別的序列在完全隨機(jī)的情況下： 識(shí)別序列為4個(gè)堿基時(shí)，平均每256個(gè)(44)堿基中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)； 識(shí)別序列為6個(gè)堿基時(shí)，平均每4096個(gè)(46)堿基中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。,

5、識(shí)別序列的結(jié)構(gòu) 大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，切割位點(diǎn)在DNA兩條鏈相對(duì)稱的位置。 限制酶切割的位置 大多數(shù)在識(shí)別序列的內(nèi)部，如EcoRI、SmaI等； 但也有在外部的：有兩端、兩側(cè)和單側(cè)之分，如Sau3AI (GATC)。,三、限制酶產(chǎn)生的末端,限制酶產(chǎn)生黏性末端 在對(duì)稱軸5側(cè)切割底物，DNA雙鏈交錯(cuò)斷開產(chǎn)生5突出黏性末端，如 EcoR I； 在3側(cè)切割，則產(chǎn)生3突出黏性末端，如Pst I；,限制酶產(chǎn)生平末端 在回文對(duì)稱軸上同時(shí)切割DNA兩條鏈，產(chǎn)生平末端，如Hpa。 限制酶產(chǎn)生非對(duì)稱突出末端 當(dāng)識(shí)別序列為非對(duì)稱序列時(shí)，切割的DNA產(chǎn)物的末端是不同的，如BbvC的識(shí)別切割位點(diǎn)如下： CCTCAGC

6、GGAGTCG,同裂酶：識(shí)別相同序列的限制酶稱為同裂酶。 同序同切酶：識(shí)別序列和切割位置都相同 Hpa與Msp識(shí)別切割位點(diǎn)為CCGG Mob與Sau3A識(shí)別切割位點(diǎn)為GATC 同序異切酶：識(shí)別序列相同，但切割位點(diǎn)不同 Kpn：GGTACC Acc65：G GTACC “同工多位”酶：識(shí)別簡(jiǎn)并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。 EcoR I：GAATTC Apo I: RAATTY (R=A/G Y=C/T),同尾酶 可產(chǎn)生相同的黏性突出末端的酶統(tǒng)稱為同尾酶。 同尾酶切割DNA得到的產(chǎn)物可進(jìn)行互補(bǔ)連接。 EcoR： GAATTC Apo I: RAATTY Mfe I: CAATTC 稀切酶

7、 有較長(zhǎng)的識(shí)別序列和富含GC或AT的識(shí)別序列的限制酶稱為稀切酶。 在基因操作中使用稀切酶可以獲得大的片段。,四、線性DNA末端對(duì)酶切的影響,DNA末端長(zhǎng)度的影響 限制酶切割DNA時(shí)，識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則難以發(fā)揮切割活性。 一般在識(shí)別序列末端有3 4個(gè)堿基對(duì)時(shí)能滿足常規(guī)的酶切需要。,位點(diǎn)偏愛(site preference) 某些限制酶對(duì)不同位置的同一識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率，這種現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛。 pBR322質(zhì)粒上有4個(gè)Nar位點(diǎn)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下1單位Nar可在1h內(nèi)將2個(gè)位點(diǎn)完全切割，但另外2個(gè)位點(diǎn)在50單位16h內(nèi)也不能切割完全。 造成位點(diǎn)偏愛的原因 在切割DNA之

8、前需要同時(shí)與2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)作用； 在要切割的DNA序列上有兩個(gè)明顯不同的結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)是為DNA切割時(shí)激活另一個(gè)的變構(gòu)位點(diǎn)。,五、酶切反應(yīng)條件,緩沖液 包括Tris-HCl、Mg2+、DTT、BSA(小牛血清蛋白) 限制酶緩沖液按離子強(qiáng)度的差異分為高、中、低3種類型 H Buffer (100 mM NaCl)； M Buffer (50 mM)； L Buffer (0 mM) 反應(yīng)溫度：大多數(shù)為37 反應(yīng)時(shí)間：通常為1h或更多 終止酶切的方法： 10 mM EDTA；加熱失活；苯酚抽提除去蛋白質(zhì),星星活性 在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性。

9、 引起星星活性的原因 甘油濃度高（5%） 酶過(guò)量（100 U/l ） 離子強(qiáng)度低（25 mM） pH值過(guò)高（8.0 ） 加了有機(jī)溶劑，如乙醇等 降低星星活性的措施 減少甘油濃度；減少酶用量；中性pH；提高鹽濃度；反應(yīng)體系中無(wú)有機(jī)溶劑；保證使用Mg2+作為2價(jià)陽(yáng)離子,六、酶切位點(diǎn)的引入,將產(chǎn)生的5突出末端補(bǔ)平后，再連接可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn) 同尾末端的連接 平末端連接,第二節(jié) 甲基化酶,甲基化酶 (methylase) 的概念 甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。 甲基化酶與對(duì)應(yīng)的限制酶識(shí)別相同的序列，在兩條鏈上對(duì)某個(gè)堿基進(jìn)行甲基化。,甲基化酶的種類 在E

10、.coli中，大多數(shù)都有3個(gè)位點(diǎn)特異性的DNA甲基化酶 Dam甲基化酶 可在GATC序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基 當(dāng)需要在敏感位點(diǎn)上完全切割DNA時(shí)，可利用dam- E.coli擴(kuò)增并提取DNA Dcm甲基化酶 識(shí)別CCAGG或CCTGG序列，在第二個(gè)胞嘧啶C 的C5位置上引入甲基 EcoK甲基化酶 識(shí)別AAC(N)6GTGC 和 GCAC(N)6GTT 序列中A的N6位置,甲基化對(duì)限制酶切的影響 修飾酶切位點(diǎn) Hinc可識(shí)別序列GTCGAC，甲基化酶 M.Taq可甲基化 TCGA中的A ，M.Taq處理DNA后，GTCGAC 將不受 Hinc切割 產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn) Dpn是依賴甲基化的限制

11、酶，TCGATCGA 受 M.Taq處理后形成甲基化(A)產(chǎn)物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即為 Dpn位點(diǎn)。 對(duì)基因組作圖的影響,第三節(jié) DNA聚合酶,一、大腸桿菌DNA聚合酶 二、Klenow DNA聚合酶 三、T4噬菌體DNA聚合酶 四、T7噬菌體DNA聚合酶 五、耐熱DNA聚合酶 六、反轉(zhuǎn)錄酶 七、末端轉(zhuǎn)移酶,DNA聚合酶 (DNA polymerase) 的概念 催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下)及其相輔的活性。 原核細(xì)胞有3種DNA聚合酶 DNA聚合酶：催化單鏈或雙鏈DNA的延長(zhǎng) DNA聚合酶：與低分子DNA鏈的延長(zhǎng)有關(guān) DNA聚合酶：促進(jìn)DNA

12、鏈延長(zhǎng)的主要酶,大腸桿菌DNA聚合酶 功能 53DNA聚合酶活性 53外切核酸酶活性 35外切核酸酶活性 用途 在沒有dNTP的情況下，外切活性占主導(dǎo)地位； 當(dāng)存在足夠的dNTP時(shí)，外切活性和合成活性處在動(dòng)態(tài)平衡中，結(jié)果使得雙鏈DNA成為平末端。 利用53外切核酸酶活性,可用切口平移法標(biāo)記DNA。,切口平移法標(biāo)記DNA，制備分子雜交探針,KlenowDNA聚合酶 由E.coli DNA聚合酶經(jīng)蛋白酶裂解后，除去53外切核酸酶活性的肽段后的大片段酶。 功能 53DNA聚合酶活性 35外切核酸酶活性 用途 補(bǔ)平DNA的3凹端 抹平DNA的3凸端 通過(guò)置換反應(yīng)對(duì)DNA進(jìn)行末端標(biāo)記 隨機(jī)引物標(biāo)記,T4

13、噬菌體DNA聚合酶 從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出來(lái)的一種特殊的DNA聚合酶。 功能 53DNA聚合酶活性 35外切核酸酶活性（200倍） 用途 35外切核酸酶活性強(qiáng)，且不從單鏈DNA模板上替換引物。在誘變反應(yīng)中可提高誘變率近一倍。,T7噬菌體DNA聚合酶 來(lái)源于T7噬菌體感染的大腸桿菌，是由兩種緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)形成的復(fù)合體。 功能 53DNA聚合酶活性 35外切核酸酶活性（1000倍） 應(yīng)用 DNA聚合能力強(qiáng)，可用于長(zhǎng)模板的引物延伸，在DNA測(cè)序中有優(yōu)勢(shì)。,耐熱DNA聚合酶 指在高溫下具有活性的DNA聚合酶，來(lái)自嗜高溫的細(xì)菌，主要用于PCR反應(yīng)。 Taq DNA聚合酶 Vent D

14、NA聚合酶 PfuDNA聚合酶 PwoDNA聚合酶,反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase) 即依賴于RNA的DNA聚合酶，有53合成DNA活性，但是無(wú) 35外切核酸酶活性。 禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV） 包含兩條多肽鏈，具 53DNA聚合酶活性和很強(qiáng)的RNaseH活性，在42能有效發(fā)揮作用。 Moloney鼠白血病病毒（M-MuLV） 單鏈多肽，其RNaseH活性弱，有利于合成較長(zhǎng)的cDNA 用途：以mRNA為模板合成cDNA ；5突出DNA的補(bǔ)平和標(biāo)記；DNA測(cè)序等。,末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 來(lái)源于小牛胸腺，是一種不依賴于模板的DNA聚合酶。 在

15、Co2+/Mg2+存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3-OH端。 作用 標(biāo)記DNA的3末端 在cDNA或載體3末端加同聚尾，便于克隆。,第四節(jié) 其他分子克隆工具酶,一、依賴于DNA的RNA聚合酶 二、連接酶 三、T4多核苷酸激酶 四、堿性磷酸酶 五、核酸酶,一、依賴于DNA的RNA聚合酶,活性 即轉(zhuǎn)錄中的RNA合成酶，識(shí)別DNA中各自特異的啟動(dòng)子序列，并沿此DNA模板起始RNA的合成。 聚合反應(yīng)時(shí)，無(wú)需引物，但需識(shí)別特異性位點(diǎn)。 類型 SP6噬菌體RNA聚合酶 (來(lái)源于感染鼠傷寒沙門氏菌LT2菌株) T4噬菌體RNA聚合酶 T7噬菌體RNA聚合酶 (來(lái)源于噬菌體感染的大腸桿菌) 應(yīng)

16、用：體外合成RNA分子、表達(dá)外源基因。,二、連接酶(ligase),連接酶就是將兩段核酸連接起來(lái)的酶，相當(dāng)于基因工程中的“糨糊”。 連接酶的種類 T4 DNA連接酶 (16反應(yīng)) 活性：催化DNA 5-P與3-OH之間形成磷酸二酯鍵。 反應(yīng)底物：黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA連接 大腸桿菌DNA連接酶：平末端連接效率低。 Taq DNA連接酶 (4565反應(yīng)) 連接雙鏈DNA中的缺口，不能代替T4 DNA連接酶。 T4 RNA連接酶,黏性末端DNA片段的連接,三、T4 多核苷酸激酶,T4多核苷酸激酶是一種磷酸化酶，可將ATP的-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5末端。 分子克隆中呈

17、現(xiàn)2種反應(yīng) 將ATP的-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到無(wú)磷酸的DNA5末端 在過(guò)量ATP存在的情況下，可將DNA的5-P轉(zhuǎn)移給ADP，然后DNA從ATP中獲得-磷酸而重新磷酸化。 應(yīng)用 對(duì)缺乏5-P的DNA進(jìn)行磷酸化 對(duì)DNA末端進(jìn)行放射性標(biāo)記（-32P-ATP）。,四、堿性磷酸酶,堿性磷酸酶是一類能催化除去DNA或RNA分子的5 磷酸，使末端轉(zhuǎn)換成5 -OH的酶。 類型 牛小腸堿性磷酸酶（CIAP） 細(xì)菌堿性磷酸酶 (BAP) 蝦堿性磷酸酶 (SAP) 用途 去除5-P，防止DNA片段自身連接 標(biāo)記(5端)前去除DNA或RNA的5-P,如何解決質(zhì)粒自身連接？,五、核酸酶,BAL31核酸酶 具有3外切核酸酶活

18、性，可從線性DNA兩條鏈的3端迅速去除單核苷酸。 用途 從兩頭縮短DNA，用于構(gòu)建嵌套缺失體；制作DNA限制酶切圖。 S1核酸酶 一種單鏈核酸酶，降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶 5-P的單核苷酸或寡核苷酸雙鏈。 用途 DNA黏性末端變?yōu)槠侥┒耍蜷_雙鏈cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)。,核糖核酸酶A (RNase A) 內(nèi)切核酸酶，特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3端。 用途 去除DNA樣品中的RNA 核糖核酸酶H (RNaseH) 內(nèi)切核酸酶，特異性水解與DNA雜交的RNA上的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生帶有3-OH和5-P末端的產(chǎn)物，不降解單鏈核酸、dsDNA或dsRNA. 用途 在cDNA克隆合成第二鏈之前去除RNA,脫氧核糖核酸酶(DNase) 來(lái)源于牛胰，為內(nèi)切核酸酶，可優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或單鏈DNA. 用途 去除RNA樣品中的DNA 切口平移標(biāo)記時(shí)在dsDNA上產(chǎn)生隨機(jī)切口 外切核酸酶 (exonuclease) 催化從dsDNA 3-OH