第5講-染色體與DNA(4).ppt

1、2.4 原核生物和真核生物DNA的復制特點,2.4.1 原核生物DNA的復制特點,大腸桿菌DNA復制起始點（OriC）保守序列分布圖,OriCin E.colichromosomal DNA,2.4.1.1 DNA雙螺旋的解旋,由大腸桿菌oriC復制起始點處引發(fā)的DNA復制過程,(1)單鏈結(jié)合蛋白（SSB蛋白）,T4噬菌體的32 kDa蛋白可以結(jié)合單鏈DNA，它還能使雙鏈DNA在遠低于解鏈溫度時分開。 大部分原核SSB蛋白與DNA結(jié)合時還表現(xiàn)出協(xié)同效應：如第一個SSB蛋白結(jié)合到DNA上去的能力為1，第二個SSB結(jié)合能力則可高達103。 SSB蛋白的作用是穩(wěn)定單鏈DNA。,(2)DNA解鏈酶（D

2、NA helicase）,大部分DNA解鏈酶都沿滯后鏈模板的53方向并隨著復制叉的前進而移動，只有Rep蛋白沿前導鏈模板的35方向移動。 因此，Rep蛋白和其他DNA解鏈酶分別在DNA的兩條母鏈上協(xié)同作用，解開雙鏈DNA。,Replication of SV40 DNA,2. 4. 1. 3 復制的引發(fā)和終止,DNA聚合酶只能延長已存在的DNA鏈，而不能從頭合成DNA鏈，那么，新DNA的復制是怎樣開始的呢？ 研究發(fā)現(xiàn)，DNA復制時，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從RNA引物3端開始合成新的DNA鏈。滯后鏈的引發(fā)過程比較復雜，需要多種蛋白質(zhì)和酶的協(xié)同作用，

3、還牽涉到岡崎片段的形成和連接。,滯后鏈的引發(fā)過程由引發(fā)體（primosome）來完成。引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)n、n、n、Dna B、C和I共同組成，只有當引發(fā)前體（preprimosome）把這6種蛋白質(zhì)合在一起并與引發(fā)酶（primase）進一步組裝后形成引發(fā)體，才能發(fā)揮其功能。 引發(fā)體在滯后鏈分叉的方向上前進，并在模板上間斷性引發(fā)生成滯后鏈引物-RNA短鏈，再由DNA聚合酶III作用合成DNA，直至遇到下一個引物或?qū)槠螢橹?。由RNase H降解RNA引物并由DNA聚合酶I將缺口補齊，再由DNA連接酶將兩個岡崎片段連在一起形成大分子DNA。,鏈的終止需要Tus蛋白參與,當復制叉前移，遇到20b

4、p重復性終止子序列（Ter）時，Ter-Tus復合物能阻擋復制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復制叉到達后在DNA拓撲異構(gòu)酶IV的作用下使復制叉解體，釋放子鏈DNA。,鏈的終止（Termination）,2.4.1.4 DNA聚合酶,大腸桿菌中主要有DNA聚合酶I、II、III。,表2-10 大腸桿菌DNA聚合酶I、II和III的性質(zhì)比較,DNA聚合酶的共同點：,1、都以dNTP為底物。2、都需要Mg2+激活。3、聚合時必須有模板鏈和具有3OH末端的引物鏈。4、鏈的延伸都方向為53。 DNA聚合酶I不是復制大腸桿菌染色體的主要聚合酶，它有53核酸外切酶活性，保證了DNA復制的準確性。它也可用來除去

5、岡崎片段5端RNA引物，使岡崎片段間缺口消失，保證連接酶將片段連接起來。,DNA聚合酶II的活性很低，若以每分鐘酶促核苷酸摻入DNA的轉(zhuǎn)化率計算，只有DNA聚合酶I的5%，所以也不是復制中主要的酶。目前認為DNA聚合酶II的生理功能主要是起修復DNA的作用。 DNA聚合酶III包含有7種不同的亞單位和9個亞基，其生物活性形式為二聚體。它的聚合活性較強，為DNA聚合酶I的15倍，聚合酶II的300倍。它能在引物的3OH上以每分鐘約5萬個核苷酸的速率延長新生的DNA鏈，是大腸桿菌DNA復制中鏈延長反應的主導聚合酶。,2.4.2 真核生物DNA的復制特點,真核生物DNA的復制子被稱為ARS（auto

6、nomouslyreplicating sequences），長約150bp左右，包括數(shù)個復制起始必需的保守區(qū)。真核生物DNA復制叉的移動速度大約只有50bp/秒。因此，人類DNA中每隔30,000-300,000bp就有一個復制起始位點。,真核細胞中有5種DNA聚合酶，分別稱為DNA聚合酶、和。,DNA聚合酶的主要作用： DNA聚合酶主要參與引物合成。 DNA聚合酶活性水平穩(wěn)定，主要在DNA損傷的修復中起作用。 DNA聚合酶是主要負責DNA復制的酶。 DNA聚合酶的主要功能可能是在去掉RNA引物后把缺口補全。,The mechanism of telomere extension by te

7、lomerase Reverse,2. 4. 3 DNA復制的調(diào)控（了解）,DNA鏈延伸的速度在同種生物的不同細胞中幾乎是恒定的，只是復制叉的數(shù)量不同。 迅速分裂的細胞具較多的復制叉，而分裂緩慢的細胞復制叉較少并出現(xiàn)復制的間隙。 復制起始頻率的直接調(diào)控因子是蛋白質(zhì)和RNA。,ColEl質(zhì)粒DNA的復制調(diào)控,ColEl是一個6646堿基對的小質(zhì)粒，在宿主細胞內(nèi)有2030個拷貝，其DNA的復制完全依靠宿主DNA聚合酶。 質(zhì)粒DNA編碼兩個負調(diào)控因子Rop蛋白和反義RNA（RNA1），它們控制了起始DNA復制所必需的引物合成。,ColE1質(zhì)粒DNA復制起始部位調(diào)控因子之間關系,大腸桿菌染色體DNA的復制調(diào)控,染色體的復制與分裂一般是同步的，但二者并不直接偶聯(lián)。 在一定生長速度范圍內(nèi)，細胞與染色體的質(zhì)量之比相對恒定。 復制子由起始物位點和復制起點兩部分組成。起始物位點編碼復制體調(diào)節(jié)蛋白，復制起點與調(diào)節(jié)蛋白相互作用并啟動復制。調(diào)節(jié)蛋白通過與復制復合物的相互作用確定復制起始頻率和復制方式。 復制起點有OriC和OriH兩種。,真核細胞DNA的復制調(diào)控,細胞生活周期水平調(diào)控（限制點調(diào)控）：決定細胞停留在G1期還是進入S期(by Cyclins, Cdc(Cel