課題2　土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

1、1.研究和應(yīng)用微生物的前提是？ 2.實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物關(guān)鍵是什么？,防止雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物,（1）需要為培養(yǎng)的微生物提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件,復(fù)習(xí)回顧,（2）需要確保無處不在的微生物無法混入。,固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基,碳源、氮源、水、無機(jī)鹽,計(jì)算、稱量、溶化、（調(diào)pH）滅菌、倒平板,確保培養(yǎng)物不被污染,確保實(shí)驗(yàn)員不被污染,3.分離、純化大腸桿菌的方法及原理？,方法：（1）利用平板劃線法或稀釋涂布平板法接種培養(yǎng) （2）挑選單一菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),原理：不同微生物菌落特征不同,專題二 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用 課題2.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),實(shí)例分析：,尿素是一種有機(jī)物，不能被農(nóng)作物吸收，

2、植物如何才能利用尿素？,土壤中的細(xì)菌可以將尿素分解為氨,這類細(xì)菌可以產(chǎn)生脲酶,土壤中的細(xì)菌為什么可以分解尿素？,思考：怎么從土壤中分離出這些細(xì)菌呢？,閱讀課本P21，感悟科學(xué)家尋找耐高溫的DNA聚合酶給你的啟示。你如何將土壤中分解尿素的細(xì)菌分離出來？,1.原理：,（一）篩選菌株,人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物的生長。,一、研究思路,利用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。,2.尿素分解菌分離的原理：,思考：分離土壤中分解尿素的細(xì)菌時(shí)，你將如何配置培養(yǎng)基( ) 加尿素 不加尿素 加瓊脂 不加瓊脂 加葡萄糖 不加葡萄糖 加硝酸鹽 不加硝酸鹽 A

3、B C D,C,能。只有產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌才能利用尿素作為氮源而生存,此培養(yǎng)基能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌？為什么？,學(xué)生活動(dòng)下表為分離分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基配方，請分析、回答下列問題。,無機(jī)鹽,無機(jī)鹽,無機(jī)鹽,碳源,氮源、碳源,不提供營養(yǎng)，凝固劑,水,3.選擇培養(yǎng)基：,允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。,舉一反三分離下列微生物，你將如何配制培養(yǎng)基,無氮源的培養(yǎng)基,無碳源的培養(yǎng)基,含有青霉素的培養(yǎng)基,含有高濃度食鹽的培養(yǎng)基,（1）將土壤中的固氮菌分離出來,（2）將土壤中自養(yǎng)微生物分離出來,（3）篩選出抗青霉素的微生物,（4）篩選出耐高濃度食鹽的微生物,延伸思考,不一定

4、，只要能利用尿素的微生物都可以分離出來。如芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。,1.含有尿素的選擇培養(yǎng)基只能分離出一種分解尿素的細(xì)菌嗎？,2.如何鑒定分離得到的就是能分解尿素的細(xì)菌？,在以尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑,接種培養(yǎng)該細(xì)菌，若指示劑變紅，說明該種菌分解了尿素。（見：教材P26課題延伸）,實(shí)驗(yàn)探究,要驗(yàn)證以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基對土壤中的細(xì)菌確實(shí)具有選擇作用，你該如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。,實(shí)驗(yàn)組:,對照組:,培養(yǎng)基中的氮源只加尿素,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,接種,接種,只生長尿素細(xì)菌,生長多種微生物,閱讀課本22頁統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目部分：

5、,1.微生物計(jì)數(shù)都有哪些常用方法？,（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,因?yàn)槠桨鍎澗€法無法較準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，一般只用于菌種的分離,顯微鏡直接計(jì)數(shù) 活菌計(jì)數(shù)法：,：利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察,為什么不用平板劃線法？,在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。,a、原理：,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)， V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)， M代表稀釋倍數(shù)。,b

6、、計(jì)算：,稀釋涂布平板法,活學(xué)活用某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106 的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1ml） A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4,沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具說服力。,1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另 2個(gè)相差太遠(yuǎn),說明操作過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性。 在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致（30-300個(gè)），結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。不能簡單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來求平均值。 統(tǒng)計(jì)的

7、菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。,2.實(shí)例分析：兩位同學(xué)的結(jié)果是否準(zhǔn)確？導(dǎo)致不準(zhǔn)確的原因可能是什么？由此，你得出的結(jié)論是什么？,(因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落),練習(xí)題：用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確的是() A涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是230 B涂布了兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是215和260，取平均值238 C涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是21、212和256，取平均值163 D涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是210、240和250，取平均值233,D,對同一細(xì)菌培養(yǎng)液樣品分別用顯微鏡直接計(jì)數(shù)

8、法和稀釋涂布平板法測定其菌體數(shù)量，你認(rèn)為兩種方法所測數(shù)據(jù)有何差異？,延伸思考,稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)出的菌落數(shù)偏小 顯微鏡計(jì)數(shù)法不能區(qū)分活菌死菌。,1.此實(shí)驗(yàn)（微生物的分離與計(jì)數(shù)）過程中是否需要設(shè)置對照？設(shè)置對照的主要目的是？,2.請你幫一幫A同學(xué)，他該怎么辦？,需要，目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素（培養(yǎng)基是否被污染，培養(yǎng)基中是否混有其他氮源，接種、培養(yǎng)過程中是否嚴(yán)格無菌操作等）對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。,方案一：用其他同學(xué)的培養(yǎng)基培養(yǎng)A同學(xué)的土樣,（三）設(shè)置對照,3.受A同學(xué)的啟發(fā)，你在實(shí)驗(yàn)時(shí)該如何設(shè)置對照？,培養(yǎng)空白培養(yǎng)基,結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同

9、，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),（1）原理：,（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容包括實(shí)驗(yàn)方案、材料用具、實(shí)施步驟和時(shí)間安排等。 （3）實(shí)驗(yàn)流程：,從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。,(一)土壤取樣,取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的信封在使用前都要滅菌。,實(shí)驗(yàn)步驟,(二)制備培養(yǎng)基,準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。每個(gè)稀釋度下需要3(或4)個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。 還需要8個(gè)滅菌試管和1個(gè)滅菌移液管 。

10、 將稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板,（三）樣品的稀釋,問題：為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？,原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好

11、氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。 結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,.取樣涂布,實(shí)驗(yàn)時(shí)要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物

12、往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,微生物的培養(yǎng)與觀察,關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、隆起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。,三、操作提示,一無菌操作 1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。 2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好標(biāo)記 注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品 的稀釋度等。 三規(guī)劃時(shí)間,1.通過對照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選

13、擇出分解尿素的微生物。 2.提示：選擇每個(gè)平板上長有30300個(gè)菌落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。,四、課題成果評價(jià),1.本課題只是對分解尿素的細(xì)菌進(jìn)行了初步的篩選，對菌種進(jìn)一步鑒定還需借助生物化學(xué)方法： 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑(酸性呈黃色、堿性呈紅色、中性呈橙色)。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。 2. 細(xì)菌數(shù)目的測定還可以通過 濾膜法,五、課題延伸,大腸桿菌菌落呈黑色,中心有或無金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征,例1 下表是培養(yǎng)分解尿素的細(xì)

14、菌的培養(yǎng)基配方，請回答下面的問題：,(1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物提供碳源的是_，提供氮源的是_。 (2)絕大多數(shù)微生物都能利用_，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解_。,(3)分析該培養(yǎng)基的配方，該培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，又是如何進(jìn)行選擇的？,葡萄糖,尿素,尿素,葡萄糖,該培養(yǎng)基對微生物具有選擇作用。以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基可以分離得到產(chǎn)生脲酶的微生物(即分解尿素的微生物)。,例2 自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生物時(shí)一般要將它們分離提純，然后進(jìn)行數(shù)量的測定。下面是對大腸桿菌進(jìn)行數(shù)量測定的實(shí)驗(yàn)，請回答有關(guān)問題。 實(shí)驗(yàn)步驟： (1)制備稀釋倍數(shù)為102、103、104、105、106的系列稀釋液。 (2)選用_法接種樣品。 (3)適宜溫度下培養(yǎng)。 結(jié)果分析： (1)測定的大腸桿菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確可信的是 () A一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是23 B兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是22和26，取平均值24 C三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、5和52，取平均值26 D四個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、30、24和25，取平均值25,稀釋