江南大學(xué)微生物綜合

1、第四章 微生物的代謝與調(diào)節(jié)及其人工控制,新陳代謝 metabolism The complex of physical and chemical processes occurring within a living cell or organism that are necessary for the maintenance of life. In metabolism some substances are broken down to yield energy for vital processes while other substances, necessary for life,

2、are synthesized.,合成代謝anabolism 在合成酶系的催化下，由簡單的小分子、能量（ATP）和還原力（H）一起合成復(fù)雜的生物的大分子的過程。,分解代謝catabolism 指復(fù)雜的有機(jī)分子通過分解代謝酶系的催化產(chǎn)生簡單分子、能量(ATP)、和還原力（H）的過程。,分解代謝的三個(gè)階段,將大分子的營養(yǎng)物質(zhì)降解成氨基酸、單糖、脂肪酸等小分子物質(zhì)。 進(jìn)一步降解成為簡單的乙酰輔酶A、丙酮酸、及能進(jìn)入TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物。 將第二階段的產(chǎn)物完全降解生成CO2 ， 并將前面形成的還原力（NADH2）通過呼吸吸鏈氧化、 同時(shí)形成大量的ATP。,微生物代謝的特點(diǎn),多樣性 適應(yīng)性 可控性,初級(jí)

3、代謝和初級(jí)代謝產(chǎn)物,初級(jí)代謝primary metabolism 微生物從外界吸收各種營養(yǎng)物質(zhì)，通過分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動(dòng)的物質(zhì)和能量的過程。 初級(jí)代謝產(chǎn)物primary metabolites 包括所有與細(xì)胞合成有關(guān)的物質(zhì) 如：氨基酸、核苷酸、乙醇、有機(jī)酸、酶,次級(jí)代謝和次級(jí)代謝產(chǎn)物,次級(jí)代謝 secondary metabolism 微生物在一定的生長時(shí)期，以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體，合成一些對微生物的生命活動(dòng)無明顯確切功能的物質(zhì)的過程。 次級(jí)代謝產(chǎn)物secondary metabolites 抗生素、激素、生物堿、色素、維生素等,第一節(jié) 微生物的代謝,一、微生物的能量代謝 新陳代

4、謝中的核心問題： 能量代謝 能量代謝的中心任務(wù)：是生物體如何把環(huán)境中多種形式的最初能源轉(zhuǎn)換成為對一切生命活動(dòng)都能使用的通用能源。 生物體能量代謝的實(shí)質(zhì)：ATP和?；o酶A、酰基磷酸等的生成和利用問題。即ATP的生成和利用的問題。,能源的轉(zhuǎn)化,（一）生物氧化反應(yīng),一系列酶在溫和條件下按一定次序的催化 放能分階段進(jìn)行 釋放的能量部分貯藏在能量載體中,生物氧化與普通氧化反應(yīng)的區(qū)別,生物氧化反應(yīng)的三個(gè)階段,脫氫：一種失去電子或氫的過程 電子供體：被氧化的物質(zhì) 電子受體：接受電子的物質(zhì) 遞氫：電子供體氧化脫下的氫交給氫載體，并通過多個(gè)載體完成電子從供體到受體的傳遞 不直接交給電子受體 受氫：最終電子受體

5、接受載體上電子的過程,（二）電子載體,自由擴(kuò)散型 NAD+和NADP+，氫原子的載體 電極對的還原電勢相同，功能不同 NAD+/NADH直接參與產(chǎn)能反應(yīng) NADP+/NADPH主要參與合成反應(yīng) 與細(xì)胞膜緊密結(jié)合型 電子傳遞系統(tǒng)或電子傳遞鏈 組成：多酶體系，一系列能夠進(jìn)行氧化和還原的載體 分布：不對稱排列在膜上，定向有序傳遞,（三）生物能的產(chǎn)生,借助于磷酸化反應(yīng) ADP形成ATP，實(shí)現(xiàn)能量存儲(chǔ),1. 底物水平磷酸化,生物氧化過程中生成的含有高能鍵的化合物在酶的作用下，直接將能量轉(zhuǎn)給ADP（GDP）生成ATP（GTP） 存在于呼吸和發(fā)酵過程中 發(fā)酵過程中唯一能量獲取方式,微生物代謝中的底物水平磷酸

6、化,2. 電子傳遞氧化磷酸化,生物氧化中伴隨著電子傳遞發(fā)生的磷酸化作用 發(fā)生在呼吸作用（有氧或無氧）中 呼吸時(shí)大多數(shù)伴隨ATP的合成 典型的呼吸鏈： 3分子ATP ， 2分子ATP （黃素蛋白起始）,化學(xué)滲透學(xué)說(chemiosmotic hypothesis),呼吸過程中ATP的形成,3. 光合磷酸化,只發(fā)生在光合細(xì)胞中 循環(huán)式光合磷酸化：反應(yīng)產(chǎn)物只有ATP 非循環(huán)式光合磷酸化：反應(yīng)的產(chǎn)物是ATP、氧和NADPH,循環(huán)式光合磷酸化,非循環(huán)式光合磷酸化,（四）微生物能量代謝的多樣性,能源物質(zhì)的多樣性 能源物質(zhì)在微生物中的代謝途徑多樣性 不同環(huán)境條件下微生物產(chǎn)能方式的多樣性,不同微生物中葡萄糖降

7、解途徑的分布,二.化能營養(yǎng)型微生物的能量代謝,（一）能源化合物 有機(jī)化合物 糖類、醇、醛、有機(jī)酸、氨基酸、烴類、芳香族化合物 葡萄糖：化能有機(jī)營養(yǎng)型微生物的主要能源 其它單糖代謝轉(zhuǎn)化為糖酵解的中間產(chǎn)物 多糖經(jīng)轉(zhuǎn)化或降解 其它非糖有機(jī)化合物經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入葡萄糖降解途徑 有機(jī)能源化合物代謝的基本途徑：葡萄糖降解途徑或單糖降解途徑,（二）能源化合物的生物氧化 生物氧化的形式：某物質(zhì)與氧結(jié)合、脫氫、失去電子 生物氧化的過程： 脫氫（或電子），遞氫（或電子），受氫（或電子） 生物氧化的功能：產(chǎn)能（ATP）、產(chǎn)還原力H、產(chǎn)小分子中間代謝物 生物氧化的類型：有氧呼吸、無氧呼吸、發(fā)酵,1、有氧呼吸 aerobic

8、 respiration,以分子氧作為最終電子受體的生物氧化作用 需氧和兼性厭氧微生物在有氧條件下進(jìn)行有氧呼吸,（1）與磷酸化作用相偶聯(lián) C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O +68800卡 （部分轉(zhuǎn)化成ATP） （2）不與磷酸化作用相偶聯(lián) C6H12O6 + H2O + O2 C6H12O7 + H2O2 +能量 （不能轉(zhuǎn)化成ATP）,2、無氧呼吸anaerobic respiration,以外源無機(jī)氧化物（少數(shù)為有機(jī)氧化物）作為最終電子受體的生物氧化作用。 一些厭氧微生物和兼性厭氧微生物在無氧條件下進(jìn)行有無氧呼吸 無氧呼吸產(chǎn)生的ATP比有氧呼吸少。,（1）外源電子受體為無機(jī)物

9、 硝酸鹽、硫酸鹽、硫、鐵、碳酸鈣 脫氮小球菌的反硝化作用 C6H12O6 + 4NO3- 6CO2 + 6H2O +2N2 + 42900卡 （2）外源電子受體為有機(jī)物 延胡索酸、甘氨酸、二甲基亞砜、氧化三甲基胺 Escherichia 的延胡索酸呼吸 延胡索酸+2H 琥珀酸,3、發(fā)酵作用 fermentation,在沒有外源最終電子受體時(shí)發(fā)生的生物氧化作用叫發(fā)酵作用。電子受體為內(nèi)源性中間代謝產(chǎn)物 3-磷酸甘油醛 + Pi + 乙醛 1、3-二磷酸甘油酸 + 乙醇,呼吸作用與發(fā)酵作用的比較,相同點(diǎn)： 氧化時(shí)，底物上脫下的氫和電子都和相同的載體結(jié)合，形成NADH和FADH。 不同點(diǎn)： NADH和

10、FADH上的電子和氫的去路不同。 消耗1分子葡萄糖產(chǎn)生的ATP數(shù)量不同。,化能營養(yǎng)型微生物的代謝產(chǎn)能方式,三、 葡萄糖分解代謝與工業(yè)發(fā)酵,葡萄糖 丙酮酸 途徑-EMP、HMP、ED、PK 丙酮酸 ？產(chǎn)物 進(jìn)行各種發(fā)酵，一般以產(chǎn)物來命名。,無氧條件下,EMP途徑,ED途徑（單磷酸己糖途徑）,HMP途徑,TCA循環(huán),PK途徑,PPK途徑 PHK途徑,1.乙醇發(fā)酵,酵母菌乙醇發(fā)酵EMP途徑 C6H12O6+2ADP 2C2H5OH+2ATP+2CO2+2H2O 細(xì)菌的乙醇發(fā)酵(運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌) ED途徑 C6H12O6+ADP 2C2H5OH+ATP+2CO2+H2O,酵母酒精發(fā)酵,酵母發(fā)酵的類型,

11、2. 乳酸發(fā)酵,同型乳酸發(fā)酵： 發(fā)酵產(chǎn)物只有乳酸的發(fā)酵稱同型乳酸發(fā)酵 菌種：德氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、酪乳桿菌 C6H12O6 + 2ADP 2 乳酸 + 2ATP,異型乳酸發(fā)酵： 發(fā)酵產(chǎn)物中除乳酸外還有乙醇和CO2的發(fā)酵 菌種：短乳桿菌、甘露乳桿菌、巴氏乳桿菌 C6H12O6 乳酸 + 乙醇 + CO2,同型乳酸發(fā)酵途徑,3.混合酸發(fā)酵 微生物將葡萄糖轉(zhuǎn)變成琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、氫氣、二氧化碳等多種產(chǎn)物的生物學(xué)過程。 甲基紅試驗(yàn)（M.R.反應(yīng)） 將細(xì)菌接種至葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)48小時(shí)，然后沿管壁加入甲基紅指示劑, 呈紅色者為陽性, 不呈紅色者為陰性。 MR反應(yīng)的結(jié)果：

12、大腸桿菌為陽性，產(chǎn)氣桿菌為陰性,4.丁二醇發(fā)酵 微生物發(fā)酵葡萄糖得到大量的丁二醇與少量的乳酸 、乙酸、二氧化碳、氫氣等產(chǎn)物的代謝過程。 Voges-Proskauer試驗(yàn)（V.P反應(yīng)） 將細(xì)菌接種至葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，于37培養(yǎng)24小時(shí)，加入與培養(yǎng)基等量的VP試劑，置37保溫30分鐘，呈紅色者為陽性，不呈紅色者為陰性。 VP反應(yīng)結(jié)果 產(chǎn)氣桿菌為陽性，大腸桿菌 的為陰性,V.P反應(yīng)機(jī)理,5.丁酸發(fā)酵,丙酮酸 乙酰輔酶A 乙酰乙酰輔酶A 乙酸 乙酰輔酶A 丁酰輔酶A 丁酸,6.丙酮丁醇發(fā)酵 丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌 丙酮酸 乙酰輔酶A 乙酰乙酰輔酶A乙酰乙酸丙酮 丙酮酸 丁酸 丁醛 丁醇,7.多元

13、醇發(fā)酵 ( 高滲酵母) 葡萄糖,葡萄糖發(fā)酵的主要終產(chǎn)物,不同菌種的發(fā)酵終產(chǎn)物,三、光能營養(yǎng)型微生物的能量代謝 四、還原力的獲得 五、代謝產(chǎn)物的合成,第二節(jié) 微生物的代謝調(diào)節(jié),代謝調(diào)節(jié)：Regulation of metabolism 微生物按照需要改變體內(nèi)的代謝活動(dòng)的速度和方向的一種作用。 調(diào)節(jié)方式： 酶合成和活性的調(diào)節(jié) 實(shí)現(xiàn)代謝途徑、代謝流量及速率的調(diào)控 區(qū)域分隔調(diào)節(jié) 細(xì)胞透性調(diào)節(jié),一. 微生物代謝調(diào)節(jié)的部位與方式,物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞 胞內(nèi)的生化反應(yīng) 代謝反應(yīng)的區(qū)域分割及關(guān)聯(lián),（一）物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞,（二）胞內(nèi)的代謝反應(yīng),通過酶的生物合成與活性調(diào)節(jié) 而實(shí)現(xiàn)對代謝反應(yīng)的調(diào)節(jié)！,1、胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng) 代

14、謝流向控制 代謝速度控制 酶活性和合成量的調(diào)節(jié)是代謝調(diào)節(jié)的核心,代謝流向的調(diào)控,可逆反應(yīng)：不同的輔基（輔酶）控制流向 谷氨酸脫氫酶： 谷氨酸合成：NADP+ 谷氨酸的分解：NAD+ 互逆單向反應(yīng)：不同的酶控制不同方向的反應(yīng),2. 代謝反應(yīng)區(qū)域分割及關(guān)聯(lián) 原核微生物 細(xì)胞膜 酶 酶與底物相對位置 真核微生物 細(xì)胞膜與細(xì)胞器膜 酶 酶與底物的相對位置及間隔狀況,微生物酶的調(diào)節(jié),粗調(diào)節(jié)：酶合成量的調(diào)節(jié)，是發(fā)生在基因水平上的調(diào)節(jié)。 精細(xì)調(diào)節(jié)：酶活性的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)已有酶分子的活性，是發(fā)生在酶化學(xué)水平上的調(diào)節(jié)。,二、 酶活性調(diào)節(jié),以酶分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ) 指調(diào)節(jié)胞內(nèi)已有酶分子的構(gòu)象或分子結(jié)構(gòu)來改變酶活性，從

15、而調(diào)節(jié)所催化的代謝反應(yīng)的速率 特點(diǎn)：作用直接、響應(yīng)快、可逆,酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制,酶的變構(gòu)調(diào)節(jié) allosteric regulation 激活 抑制 酶的共價(jià)修飾 covalent modification of enzyme 激活 抑制 酶蛋白的降解失活 能荷調(diào)節(jié),Allosteric regulation,激活的調(diào)節(jié)類型,前體激活 在分解代謝途徑和合成體系中，處于途徑前面的代謝產(chǎn)物促進(jìn)催化后面反應(yīng)的酶活性 補(bǔ)償性激活 在關(guān)聯(lián)分支合成途徑中，從H到I的反應(yīng)需要E的參與，則H可激活催化合成E的途徑中的第一個(gè)酶活性,分支途徑酶活性的調(diào)節(jié)類型,能荷 energy charge 對酶活力的調(diào)節(jié),巴斯德

16、效應(yīng)： 在有氧情況下，由于呼吸作用，酒精產(chǎn)量大大下降，糖的消耗速率大幅減慢。,能荷=,ATP+1/2ADP,ATP+ADP+AMP,通氧,ATP,檸檬酸,能荷,異檸檬酸脫氫酶活性,磷酸果糖激酶活性,6磷酸葡萄糖,基團(tuán)移位吸收葡萄糖速率,三、酶合成的調(diào)節(jié),組成酶 constitutive enzyme 是一類對環(huán)境不敏感的酶，這類酶在細(xì)胞內(nèi)的合成量相對比較穩(wěn)定。 適應(yīng)酶 adaptive enzyme 是一類對環(huán)境敏感的酶，它們響應(yīng)環(huán)境條件而開始合成或終止合成。 誘導(dǎo)酶 inducible enzyme 阻遏酶repressible enzyme,操縱子的構(gòu)造,操縱子的構(gòu)成,1、誘導(dǎo) Induc

17、tion,Gene induction,2、阻遏 repression,Gene repression,分解代謝物阻遏 指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物存在時(shí)，利用快的那種底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。 末端產(chǎn)物阻遏 指由某代謝途徑末端產(chǎn)物過量積累而引起的阻遏。,Positive control of the lac operon,cAMP receptor protein,Diauxic growth of E. coli,Negative control of the trp operon,3、阻尼 attenuation,氨基酸生物合成途徑中的酶的合成受相應(yīng)的氨基酰-tRNA濃度的

18、控制 當(dāng)有過量的氨基酰-tRNA存在時(shí)，對于已被引發(fā)的轉(zhuǎn)錄，但在第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因被轉(zhuǎn)錄之前即終止轉(zhuǎn)錄。 阻遏是對轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的控制； 阻尼是對已被引發(fā)的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止的控制 trp operon 受trp-tRNA的阻尼，受trp的阻遏,4、基于rRNA水平的調(diào)節(jié),酶的轉(zhuǎn)譯受rRNA形成的控制,前體 氨基酸 AA-tRNA 蛋白質(zhì) 酶 核糖體(rRNA+P),ppGpp,第三節(jié) 微生物代謝的人工控制及其應(yīng)用,微生物代謝的人工控制,代謝的人工控制：人為地打破微生物細(xì)胞內(nèi)代謝的自動(dòng)調(diào)節(jié)，使細(xì)胞過量積累目的代謝產(chǎn)物。 代謝控制發(fā)酵： 利用生物化學(xué)和遺傳學(xué)的原理，控制培養(yǎng)條件，使微生物代謝朝向人們希望的方

19、向進(jìn)行，過量積累代謝產(chǎn)物 代謝控制育種： 通過遺傳變異來改變微生物的正常代謝，使某種代謝產(chǎn)物形成和積累,代謝控制育種,目的代謝產(chǎn)物大量累積 人為打破自動(dòng)調(diào)節(jié)，改變代謝流向 減少或切斷支路產(chǎn)物的形成 提高細(xì)胞膜的通透性 減少育種的盲目性 初級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)，成效顯著 次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)，效果不明顯,代謝調(diào)控育種的措施,(一）解除目的產(chǎn)物對合成途徑的反饋調(diào)節(jié)-代謝控制育種 1、應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型突變株條件解除反饋抑制 營養(yǎng)缺陷型auxotroph： 因某種突變的結(jié)果而失去合成某種生長及代謝所需物質(zhì)（生長因子）的能力的突變菌株。必須在培養(yǎng)基中補(bǔ)加該物質(zhì)，否則不能生長。,C. glutamicum,高絲氨酸脫

20、氫酶,aaaaaaaaaaaaaa,(AK),例：高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株(Hser-)條件解除（Thr+Lys)對AK的協(xié)同反饋抑制 Hser-不能合成高絲氨酸，進(jìn)而不能合成蘇氨酸和蛋氨酸，在補(bǔ)給適量的高絲氨酸（或蘇氨酸和蛋氨酸）的條件下，可大量積累賴氨酸。 Hser-的篩選 野生型菌株誘變CM培養(yǎng)基分離挑選Hser-突變株 CM MM MM+Hser 野生型 + + + Hser- + +,2、應(yīng)用滲漏突變株(leakage mutant)解除反饋抑制 例：利用Hserl解除（Thr+Lys)對AK的協(xié)同反饋抑制： Hserl細(xì)胞能合成Hser，但合成的量僅能維持細(xì)胞的最低生長，胞內(nèi)的濃度

21、達(dá)不到進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)的濃度。 篩選： Hser- 誘變 挑選在MM上生長緩慢而且菌落小的回復(fù)突變株,3、應(yīng)用抗反饋調(diào)節(jié)突變株解除反饋調(diào)節(jié) （結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株） 抗反饋調(diào)節(jié)突變株：是指一種對反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐缘慕M成型突變株，或兼而有之的突變株。 結(jié)構(gòu)類似物 analog（抗代謝物antimetabolite） 是一種與初級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似但缺乏生理功能的化合物。 例1：黃色短桿菌AHVr突變株可解除Thr的反饋抑制而積累蘇氨酸,Brevibacterium flavum,(AK),Threonine AHV a-Amino-b-hydroxyvaleric acid a-氨基-b-羥戊酸,突變前 突變后 抗反饋抑制突變的機(jī)制,抗反饋?zhàn)瓒敉蛔兊臋C(jī)制,Lys AEC S-(2-Aminoethyl)-L-Cysteine,例2：谷氨酸棒桿菌的(Thr+AEC)r突變株可解除（Thr+Lys)對AK的協(xié)同反饋抑制而積累Lys,(Thr+AEC)r,抗結(jié)構(gòu)類似物突變株(Thr+AEC)r的篩選,將誘變以后的菌懸液涂布在特定的基本培養(yǎng)基上（加入致死量的AEC+Thr)，在此平板上長出的菌落即為(Thr+AEC)r菌株。 驗(yàn)證長出的突變株是否真正解除的反饋調(diào)節(jié)-過量積累Lys。 其它可能出現(xiàn)AECr突變的情況 細(xì)胞膜對AEC