植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基ppt課件.ppt

1、植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基,1,上節(jié)課小結(jié),外植體的選擇 1、基因型；2、取材部位；3、取材季節(jié)；4、生理狀態(tài)發(fā)育年齡；5、大小 滅菌和外植體的消毒 無(wú)菌操作技術(shù) 細(xì)節(jié)決定成敗，良好操作習(xí)慣的養(yǎng)成 外植體的褐化及預(yù)防 外植體的玻璃化及預(yù)防,2,培養(yǎng)基種類和特點(diǎn),離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對(duì)培養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長(zhǎng)。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，植物組織培養(yǎng)才能成功。,3,培養(yǎng)基的發(fā)展簡(jiǎn)史,最早是Sacks（1680）和Knop（

2、1681），他們對(duì)綠色植物的成分進(jìn)行了分析研究，根據(jù)植物從土中主要是吸收無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)，設(shè)計(jì)出了由無(wú)機(jī)鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作為基本的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基得到廣泛應(yīng)用。,4,culture medium,培養(yǎng)基：含有各種被培養(yǎng)生物材料所需要的營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基質(zhì)。 培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)中最重要的基質(zhì)，選擇合適的培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)成功與否關(guān)系很大。 培養(yǎng)基有各種種類，不同的植物和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的需選用不同的培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基的名稱，一直根據(jù)沿用的習(xí)慣。多數(shù)以發(fā)表人的名字來(lái)命名，再加上年號(hào)，如White(1943)培養(yǎng)基，Murashing和Skoog(1962)培養(yǎng)基。,5,培養(yǎng)基的分類,培

3、養(yǎng) 基 種 類,完全培養(yǎng)基,初代培養(yǎng)基,繼代培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)基,誘導(dǎo)培養(yǎng)基,增殖和生根培養(yǎng)基,6,培養(yǎng)基的分類,根據(jù)培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽成分和元素的濃度，可將培養(yǎng)基分為以下四類： 1. 富鹽平衡培養(yǎng)基： MS培養(yǎng)基；LS培養(yǎng)基；BL培養(yǎng)基；BM培養(yǎng)基；ER培養(yǎng)基等。 2. 高硝態(tài)氮培養(yǎng)基： B5培養(yǎng)基；N6培養(yǎng)基；SH培養(yǎng)基等。 3. 中鹽培養(yǎng)基： Miller培養(yǎng)基；H培養(yǎng)基；Nitsch培養(yǎng)基；Blaydes培養(yǎng)基。 4. 低鹽培養(yǎng)基： White培養(yǎng)基；WS培養(yǎng)基；HE培養(yǎng)基；改良Nitsch培養(yǎng)基及HB培養(yǎng)基。,7,常見培養(yǎng)基及特點(diǎn),MS培養(yǎng)基：1962年由Muras

4、hige和Skoog為煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。,8,9,MS培養(yǎng)基特點(diǎn),特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高（鉀鹽、鐵鹽、硝酸鹽含量均較高），特別是硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基高，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖能力,是一種較穩(wěn)定的平衡溶液。 微量元素種類齊全，濃度高；培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，在一般的培養(yǎng)中，無(wú)需額外加入氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機(jī)附加成分。 養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營(yíng)養(yǎng)和生理需要。 能加速愈傷組織和培養(yǎng)物生長(zhǎng)。廣泛用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來(lái)。,10,MS固體培養(yǎng)基可用來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織，或用于胚、莖段、莖尖及花藥培養(yǎng)，MS液體培養(yǎng)基用于

5、細(xì)胞懸浮培養(yǎng),都能獲得明顯成功。,MS培養(yǎng)基特點(diǎn),11,B5培養(yǎng)基,1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。,12,較含有較高的硝酸鉀,較低的銨和較高VB1，這可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用。 實(shí)踐表明有些植物在B5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更適宜，如南洋杉、葡萄及豆科與十字花科植物等的培養(yǎng)。,B5培養(yǎng)基的特點(diǎn)高硝態(tài)氮培養(yǎng)基,五個(gè)桑樹品種芽再生的比較,13,White培養(yǎng)基低鹽培養(yǎng)基,是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MeSO4的濃度和增加了硼素。 無(wú)機(jī)鹽量較低；有機(jī)成分含量相對(duì)也較低。 適合生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)等。,14,

6、SH培養(yǎng)基高硝態(tài)氮培養(yǎng)基, 特點(diǎn)與B5相似，硫酸銨改用磷酸二氫銨。 無(wú)機(jī)鹽濃度較高。,15,WPM培養(yǎng)基,WPM(Woody Plant Medium),16,N6培養(yǎng)基高硝態(tài)氮培養(yǎng)基,是1975年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的,獲國(guó)家發(fā)明二等獎(jiǎng)。在國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)基和其他組織培養(yǎng)。 主要特點(diǎn)： 成分簡(jiǎn)單； 硝酸鉀和硫酸銨含量高； 適合花粉、花藥培養(yǎng)。,17,KM-8P培養(yǎng)基, 有機(jī)成分復(fù)雜，包括了所有單糖和維生素，呼吸代謝中的主要有機(jī)酸； 主要用于原生質(zhì)體培養(yǎng)(包括原生質(zhì)融合的培養(yǎng))。,18,19,培養(yǎng)基的組成成分,培養(yǎng)基的成分,植物激素,無(wú)機(jī)鹽,有

7、機(jī)物,培養(yǎng)體支持材料,輔助物質(zhì),水 分,20,一、水,培養(yǎng)基大部分是水，配制培養(yǎng)基時(shí)一般用三級(jí)水(水中不含或少含某些離子)，保證培養(yǎng)基中成分完全人為控制。 水的作用 1.水是細(xì)胞原生質(zhì)的主要組成成分； 2.水是重要代謝過程的反應(yīng)物質(zhì)和產(chǎn)物； 3.細(xì)胞分裂及伸長(zhǎng)都需要水分； 4.水是植物物質(zhì)吸收和運(yùn)輸及生化反應(yīng)的良好溶劑； 5.水能使植物保持固有姿態(tài)，有利于光合作用和傳粉； 6.調(diào)節(jié)植物體周圍的溫、濕度，維持植物體溫穩(wěn)定。 總之，水是植物原生質(zhì)體的組成成分，是一切代謝過程的介質(zhì)和溶液，是生命活動(dòng)過程中不可缺少的物質(zhì)。,21,二、無(wú)機(jī)鹽,大量元素：N，P，K，Ca，Mg，S等元素。 以鹽的形式加在

8、培養(yǎng)基中，它們對(duì)植物細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)都是必不可少的，需要量大于0.5mmol/L。其中特別說明的是：培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)氮的供應(yīng)可以有兩種形式，一種是硝酸鹽；另一種是銨鹽。 微量元素：Fe，Mn，Zn，B，Cu，Co，I等。 對(duì)于植物細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)需要量小于0.5mmol/L，但必不可少，其中Fe較為關(guān)鍵，以螯合形式提供，可使用FeSO4.7H2O和Na2-EDTA進(jìn)行制備。,22,大量元素的功能,（1）N 是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分。是生命不可缺少的物質(zhì)。在制備培養(yǎng)基時(shí)以NO3N和NH4N兩種形式供應(yīng)。大多數(shù)培養(yǎng)基既含有NO3N又含有NH4N，NH4N對(duì)植物生長(zhǎng)較

9、為有利，供應(yīng)的物質(zhì)有KNO3、NH4NO3等。也添加氨基酸來(lái)補(bǔ)充氮素。,23,（2）P 是磷脂的主要成分，而磷脂又是原生質(zhì)、細(xì)胞核的重要組成部分。磷也是ATP、ADP等的組成成分。在植物培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷、不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進(jìn)對(duì)N的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。常用的物質(zhì)有KH2PO4或NaH2PO4等。,大量元素的功能,24,（3）K 對(duì)碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等密切關(guān)系。K增加時(shí)，蛋白質(zhì)合成增加，維管束、纖維組織發(fā)達(dá)，對(duì)胚的分化有促進(jìn)作用。但濃度不易過大，一般為13mg/L為好。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以KCL、KNO3等鹽類提供。,大量元素的功能,25,（4

10、）Mg、S和Ca Mg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑； S是氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgSO47H2O提供。用量為1-3mg/l較為適宜； Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，Ca對(duì)細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl2H2O提供。,大量元素的功能,26,微量元素的功能,鐵是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過氧化氫等酶的組成成分。同時(shí)，它又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中鐵對(duì)胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。在制作培養(yǎng)基時(shí)不用FeSO4和FeCl3（因其在PH值5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀），而使用FeSO47H2O和Na-EDTA的結(jié)合成的結(jié)合物。 B

11、，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)、發(fā)育異?，F(xiàn)象。,27,三、有機(jī)物,有機(jī)化合物（organic compound） 培養(yǎng)基中只含有大量元素與微量元素，常稱為基本培養(yǎng)基（basic medium）。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機(jī)物以利于快速生長(zhǎng)。常加入的的有機(jī)成分要以下幾類：,維生素,肌 醇,氨基酸,天然復(fù)合物,碳水化合物,28,碳水化合物,最常用的碳源是蔗糖、葡萄糖和果糖，可支持許多組織很好生長(zhǎng)。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使用濃度在2%3%，常用3%，即配制一升培養(yǎng)基稱取30g蔗糖，有時(shí)可用2.5%。但在

12、胚培養(yǎng)時(shí)采用4%15%的高濃度，因蔗糖對(duì)胚狀體的發(fā)育起重要作用。 不同糖類對(duì)生長(zhǎng)的影響不同。從各種糖對(duì)水稻根培養(yǎng)的影響來(lái)看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相當(dāng)，麥芽糖差一些。不同植物不同組織的糖類需要量也不同，實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)配方規(guī)定按量稱取，不能任意取量。 高壓滅菌時(shí)，一部分糖會(huì)發(fā)生分解，制訂配方時(shí)要給予考慮。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的棉白糖代替。,29,維生素（vitamin）,這類化合物在植物細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)，對(duì)生長(zhǎng)、分化等有很好的促進(jìn)作用。雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)基中都能合成所必須的維生素，但在數(shù)量上還明顯不足，通常需要加入一至數(shù)種維生素，以便獲得最良好的生長(zhǎng)。

13、主要有VB(鹽酸硫胺素) 、VB6(鹽酸吡多醇)、VPP(煙酸)、VC(抗壞血酸)，有時(shí)還使用生物素、葉酸、VB12等。一般用量為0.11.0mg/L。有時(shí)用量較高。VB1對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進(jìn)根的生長(zhǎng)，VPP與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。VC有防止組織變褐的作用。,30,肌醇（myoinosltol）,又叫環(huán)己六醇，在糖類的轉(zhuǎn)化中起重要作用。通?？捎闪姿崞咸烟寝D(zhuǎn)化而成，還可進(jìn)一步生成果膠物質(zhì)，用于構(gòu)建細(xì)胞壁。肌醇與6分子磷酸殘基相結(jié)合形成植酸，植酸與鈣、鎂等陽(yáng)離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸可進(jìn)一步形成磷脂，參與細(xì)胞膜的構(gòu)建。使用濃度一般為100mg/L，適當(dāng)使用肌醇，能

14、促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。,31,天然復(fù)合物,天然復(fù)合物的成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，它對(duì)器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，所以一般應(yīng)盡量避免使用。,32,氨基酸,是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞利用。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有時(shí)應(yīng)用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它們是牛乳用酶法等加工的水解物，是含有20種氨基酸的混合物，用量在10-100mg/L之間。由于它們營(yíng)養(yǎng)豐富，極易引

15、起污染。如在培養(yǎng)中無(wú)特別需要，以不用為宜。,33,四、植物激素,1）生長(zhǎng)素類（auxin）：生長(zhǎng)素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。天然的生長(zhǎng)素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受體內(nèi)酶的分解，組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長(zhǎng)素類物質(zhì)。 2）細(xì)胞分裂素類（cytokinin）：這類激素是腺嘌呤的衍生物，多用于誘導(dǎo)不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培養(yǎng)中使用較少或用量較低。,34,3）GA（gibberellic acid 赤霉素）： 有二十多種，組織培養(yǎng)中常添加的是GA3。它主要是促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株；赤霉素和生長(zhǎng)素協(xié)同

16、作用，對(duì)形成層的分化有影響，當(dāng)生長(zhǎng)素/赤霉素比值高時(shí)有利于木質(zhì)部分化，比值低時(shí)有利于韌皮部分化；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。 一般在器官形成后，添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長(zhǎng)。,35,五、輔助物質(zhì),抗生素（antibiotic） 添加抗生素可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丟棄成百上千瓶的培養(yǎng)物，采用適當(dāng)?shù)目股乇憧晒?jié)約人力、物力和時(shí)間； 抗生素各有其抗菌譜，要選擇加以利用，也可兩種抗生素混用； 應(yīng)當(dāng)注意抗生素對(duì)植物組織的生長(zhǎng)也有抑制作用； 不能因添加抗生素，而放松滅菌措施； 此外，在停止抗生素使用后，往往污染率顯著上升，這可

17、能是原來(lái)受抑制的菌類又滋生起來(lái)。,36,活性碳（Active carbon） 活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉末結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用。 它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附力越強(qiáng)；溫度低吸附力強(qiáng)，溫度高吸附力弱，甚至解吸附。 它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、琨類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒只產(chǎn)生的5-羥甲基糖醛，極少量的活性炭就可以完全吸附培養(yǎng)基的激素。 活性炭加入會(huì)削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加一些瓊脂?；钚蕴恳壮恋?，通常在瓊脂凝固之前，要輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。 因此，在使用時(shí)不能隨意添加，要有量的意識(shí)，物盡其用。,37,

18、六、培養(yǎng)體支持材料,瓊脂（agar）：在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40C即凝固為固體溶膠。通常所說的“煮化”培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90C以上的熱水。瓊脂的用量在6-10g/L之間，若濃度太高，培養(yǎng)基就會(huì)變得很硬，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散到培養(yǎng)的組織中去。若濃度太低，凝固性不好。 顏色淺、透明度好、潔凈的為上品瓊脂。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、PH值等因素有關(guān)。長(zhǎng)時(shí)間的高溫會(huì)使凝固力下降，過酸過堿會(huì)加之高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固力。時(shí)間過久，瓊脂變褐

19、，也會(huì)逐漸喪失凝固能力。,38,第二節(jié)、培養(yǎng)基母液的配制和保存,經(jīng)常配制培養(yǎng)基時(shí)，為減少工作量，減少稱量的誤差，一般配成比所需濃度高10100倍的母液，用時(shí)可按比例稀釋。 配好的母液需要貯存于2-4的冰箱中，定期檢查有無(wú)沉淀和微生物污染，如果出現(xiàn)沉淀或微生物污染，則不能使用。,39,母液配制流程圖,確定培養(yǎng)基,稱量,計(jì)算,溶解,分裝,定容,貼標(biāo)簽,保存,40,41,母液配制視頻,42,培養(yǎng)基配制流程,量取母液,調(diào)pH值,加入蔗糖/激素,滅菌,加瓊脂/活性炭,分裝,定容,加抗生素/激素,確定配方,分裝備用,43,當(dāng)培養(yǎng)基配制好以后，應(yīng)隨即進(jìn)行pH值的調(diào)整。最好用酸度計(jì)測(cè)試，既快又準(zhǔn)，也可用精密p

20、H試紙(應(yīng)在干燥器中保存)，培養(yǎng)基pH值調(diào)整可用1mol/L HCl或1mol /LNaOH。經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，由于某些成分的分解，如蔗糖的分解或氧化，酸度會(huì)增加，即pH值可降低0.2。因此在實(shí)際操作中，經(jīng)常在滅菌前將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至比所需pH高0.2個(gè)單位。 培養(yǎng)基的pH值(培養(yǎng)基的酸堿度)，直接影響到培養(yǎng)物對(duì)離子的吸收，所以過酸或過堿都對(duì)植物材料的生長(zhǎng)有很大影響，此外，瓊脂培養(yǎng)基的pH值還影響到凝固情況。一般來(lái)說，當(dāng)pH值高于6.0時(shí)，培養(yǎng)基將會(huì)變硬；低于5.0時(shí)，瓊脂不能很好的凝固。,pH值的調(diào)整,44,培養(yǎng)基配制視頻,45,培養(yǎng)基的選擇,首先查找文獻(xiàn)，找出同種或近源種外植體組織培養(yǎng)所

21、用的培養(yǎng)基。,成熟的培養(yǎng)基,無(wú)相關(guān)報(bào)道,有種內(nèi)或種間報(bào)道,46,植物再生能力的種間差異,Morus alba L. White Mulberry (E Asia) Morus australis Poir. Chinese Mulberry (SE Asia) Morus celtidifolia Kunth (Mexico) Morus insignis (S America) Morus mesozygia Stapf African Mulberry (S and C Africa) Morus microphylla Texas Mulberry (Mexico, Texas (USA

22、) Morus nigra L. Black Mulberry (SW Asia) Morus rubra L. Red Mulberry (EN America) Morus notabilis,47,Morus indica cv. K2,48,20130425,49,50,建立新培養(yǎng)基的原則,在建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養(yǎng)基(如Ms培養(yǎng)基或B5培養(yǎng)基)開始。當(dāng)通過一系列的實(shí)驗(yàn)，對(duì)這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動(dòng)之后，即有可能得到一種能滿足實(shí)驗(yàn)需要的新培養(yǎng)基，選擇最佳培養(yǎng)基。常用試驗(yàn)方法主要有單因子試驗(yàn)、多因子試驗(yàn)及廣譜實(shí)驗(yàn)等

23、。,51,一、單因子試驗(yàn),在單因子試驗(yàn)中由于培養(yǎng)基中其他成分都維持在一般水平上，所以只變動(dòng)一個(gè)因子，就可以找出這一因子對(duì)試驗(yàn)的影響和影響的程度。例如MS基本培養(yǎng)基的其他成分和用量都不變，只變動(dòng)NAA用量對(duì)某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個(gè)因素的試驗(yàn)就是單因子試驗(yàn)。 生物學(xué)試驗(yàn)不同于物理學(xué)或化學(xué)試驗(yàn)，最顯著的差別是在生物學(xué)試驗(yàn)中必需設(shè)置對(duì)照組與試驗(yàn)組，試驗(yàn)組可以有一組或幾組，隨試驗(yàn)的復(fù)雜性而設(shè)置，對(duì)照組也可能有一組以上。,52,試驗(yàn)中要求對(duì)照組與試驗(yàn)組中的試驗(yàn)個(gè)體，即植物組織塊或其他培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗(yàn)結(jié)果是來(lái)源于試驗(yàn)因子，而不是由于試驗(yàn)

24、材料的不一致導(dǎo)致的。 試驗(yàn)中各處理一般都要設(shè)有一定的重復(fù)，以取得可靠的試驗(yàn)結(jié)果。隨試驗(yàn)規(guī)模和要求不同，大多每個(gè)項(xiàng)目要有410瓶，每瓶至少3塊培養(yǎng)物或3叢小幼苗。,53,二、多因子試驗(yàn),對(duì)培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究的試驗(yàn)稱為多因子實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)可采用完全試驗(yàn)方案，也可選用正交設(shè)計(jì)方案，完全試驗(yàn)方案具有均衡完全的特點(diǎn)，各個(gè)因子的每個(gè)水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合，如研究NAA和6BA的最佳濃度組合，每個(gè)因子各設(shè)5個(gè)濃度水平(0，0.5，2.5，5，10mgL)，這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個(gè)具有25項(xiàng)處理的試驗(yàn),如下表：,54,2種激素5種水平的實(shí)驗(yàn)組合,55,56,現(xiàn)實(shí)

25、與理論的沖突,57,正交實(shí)驗(yàn)的概念,58,59,60,完全試驗(yàn)方案試驗(yàn)因子越多，處理數(shù)越多，試驗(yàn)越復(fù)雜，消耗的精力、物力越多。為了減少試驗(yàn)處理，但又能準(zhǔn)確全面地獲得試驗(yàn)信息，通常采用正交試驗(yàn)。例如，采用正交設(shè)計(jì)，在使用此表時(shí)就可以安排4個(gè)因子，3種水平的試驗(yàn)，一共做9種不同搭配的試驗(yàn)，其結(jié)果相當(dāng)于做了27次種種搭配的試驗(yàn)。正交試驗(yàn)雖然是多因素搭配在一起的試驗(yàn)，但是在試驗(yàn)結(jié)果的分析中，每一種因素所起的作用卻又能夠明白無(wú)誤地表現(xiàn)出來(lái)。因此，一次系統(tǒng)的試驗(yàn)結(jié)果，就可以把問題分析得清清楚楚，用有限的時(shí)間取得成倍的收獲。在組織培養(yǎng)研究中，可用于同時(shí)探求培養(yǎng)基中適宜的幾種成分的用量，如細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、

26、糖和其他成分的用量。,61,62,63,三、逐步添加和逐步排除的試驗(yàn)方法,在植物組織分化與再生的研究中，在沒有取得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分，而在取得了穩(wěn)定的再生之后，就可以逐步減少這些成分。在逐步添加時(shí)是使試驗(yàn)成功，在逐步減少時(shí)是縮小范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了實(shí)用上的需要竭力使培養(yǎng)基簡(jiǎn)化，以降低成本和利于推廣。在尋求最佳激素配比時(shí)，也經(jīng)常用到這種加加減減的簡(jiǎn)單方法。,64,四、廣譜實(shí)驗(yàn)法,在廣譜實(shí)驗(yàn)法中，把培養(yǎng)基中所有組分分為4大類： 無(wú)機(jī)鹽 有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(蔗糖、氨基酸和肌醇等) 生長(zhǎng)素 細(xì)胞分裂素,65,對(duì)每一類物質(zhì)選定低(L)、中(M)、和高(H)3個(gè)濃

27、度,4類物質(zhì)各3種濃度的自由組 合即構(gòu)成了一項(xiàng)包括81個(gè)處理的實(shí)驗(yàn)。在這81個(gè)處理中最好的一個(gè)可用4個(gè)字母表示,例如，一個(gè)包含中等濃度無(wú)機(jī)鹽，低等濃度生長(zhǎng)素、中等濃度細(xì)胞分裂素和高等濃度有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的處理即可表示為MLMH。達(dá)到這個(gè)階段，再試用不同類型的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素即可找到培養(yǎng)基的最佳配方。這是因?yàn)椴煌愋偷纳L(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)不同植物的活性有所不同。,66,思考與練習(xí),如何配制MS培養(yǎng)基母液？ 配制培養(yǎng)基有哪些流程，哪些地方需要特別注意？ 如何篩選理想的培養(yǎng)基配方？,1,2,3,67,培養(yǎng)基的選擇,在建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培

28、養(yǎng)基(如Ms培養(yǎng)基或B5培養(yǎng)基)開始。當(dāng)通過一系列的實(shí)驗(yàn)，對(duì)這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動(dòng)之后，即有可能得到一種能滿足實(shí)驗(yàn)需要的新培養(yǎng)基，選擇最佳培養(yǎng)基。常用試驗(yàn)方法主要有單因子試驗(yàn)、多因子試驗(yàn)及廣譜實(shí)驗(yàn)等。,68,一、單因子試驗(yàn),在單因子試驗(yàn)中由于培養(yǎng)基中其他成分都維持在一般水平上，所以只變動(dòng)一個(gè)因子，就可以找出這一因子對(duì)試驗(yàn)的影響和影響的程度。例如Ms基本培養(yǎng)基的其他成分和用量都不變，只變動(dòng)NAA用量對(duì)某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個(gè)因素的試驗(yàn)就是單因子試驗(yàn)。 生物學(xué)試驗(yàn)不同于物理學(xué)或化學(xué)試驗(yàn)，最顯著的差別是在生物學(xué)試驗(yàn)中必需設(shè)置對(duì)照組與試驗(yàn)組，試驗(yàn)組可以有一組或幾組，隨試驗(yàn)的復(fù)雜性而設(shè)置，對(duì)照組也可能有一組以上。,69,試驗(yàn)中要求對(duì)照組與試驗(yàn)組中的試驗(yàn)個(gè)體，即植物組織塊或其他培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗(yàn)結(jié)果是來(lái)源于試驗(yàn)因子，而不是由于試驗(yàn)材料的不一致導(dǎo)致的。 試驗(yàn)中各處理一般都要設(shè)有一定的重復(fù)，以取得可靠的試驗(yàn)結(jié)果。隨試驗(yàn)規(guī)模和要求不同，大多每個(gè)項(xiàng)目要有410瓶，每瓶至少3塊培養(yǎng)物或3叢小幼苗。,70,二、多因子試驗(yàn),對(duì)培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究的試驗(yàn)稱為多因子實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)可采用完全試驗(yàn)方案，也可選用正交設(shè)計(jì)方案，完全試驗(yàn)方案具有