感染性疾病的分子診斷.ppt

1、感染性疾病的分子診斷,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,二、耐藥監(jiān)測與分子流行病學調(diào)查,三、醫(yī)院獲得性感染的監(jiān)測與控制,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,分子生物學檢驗技術(shù)在感染性疾病中的應用主要包括對病原生物進行鑒定、分型、耐藥診斷和治療過程中的療效監(jiān)測等 檢測核酸分子或蛋白質(zhì)分子 目前已經(jīng)應用于一些重要的感染性疾病，如結(jié)核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,（一）結(jié)核分枝桿菌,（二）乙型肝炎病毒,（三）人類免疫缺陷病毒,（四）SARS冠狀病毒,（五）人禽流感病毒,結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)，俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌?？汕址溉?/p>

2、身各器官，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。估計世界人口中1/3感染結(jié)核分枝桿菌。據(jù)WHO報道，每年約有800萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病。我國建國前死亡率達200-300人/10萬，居各種疾病死亡原因之首，建國后人民生活水平提高，衛(wèi)生狀態(tài)改善，特別是開展了群防群治，兒童普遍接種卡介苗，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率大為降低。但應注意，世界上有些地區(qū)因艾滋病、吸毒、免疫抑制劑的應用、酗酒和貧困等原因，發(fā)病率又有上升趨勢。,（一）結(jié)核分枝桿菌,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,（一）結(jié)核分枝桿菌,1.生物學特性與致病性,2.基因組特點,3.結(jié)核分枝桿菌核酸的檢測,（一）結(jié)核分枝桿菌

3、,1.生物學特性與致病性 結(jié)核分枝桿菌復合群包括人結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌，其中前三者對人類致病 人型結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)病率最高,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，增殖一代需1520小時，生長成可見菌落一般需46周 在組織細胞內(nèi)大量繁殖引起炎癥，菌體成分和代謝物質(zhì)的毒性以及菌體成分誘發(fā)的機體免疫損傷,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,2.基因組特點 共價封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu) 標準株結(jié)核分枝桿菌基因組全長4.4kb,包含4000個蛋白質(zhì)編碼基因和50個RNA編碼基因,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,(1)重復序列：如IS61

4、10，僅存于結(jié)核分枝桿菌復合群細菌染色體上長1355bp的重復插入序列，具有復合群特異性 (2)蛋白質(zhì)編碼基因 (3)rRNA基因：每個細胞約含有103104 個rRNA，含有結(jié)核分枝桿菌高度保守的序列，也有分枝桿菌種特異性序列,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,3.結(jié)核分枝桿菌核酸的檢測 實驗室檢查手段主要包括標本直接涂片染色鏡檢、分離培養(yǎng)鑒定以及血清學抗原檢測方法 分子生物學理論和技術(shù)已經(jīng)用于分枝桿菌的分子結(jié)構(gòu)和功能的研究中，并開始用于臨床菌種和耐藥株的鑒定及監(jiān)測,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,PCR菌種鑒定法 PCR直接測序鑒定法 PCR-DNA探針鑒定法 PCR-基因芯片法,(1)結(jié)核

5、分枝桿菌菌種鑒定：,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,(2)藥物敏感性試驗與耐藥基因檢測： 縮短培養(yǎng)和鑒定的時間，及時指導臨床選藥 藥物敏感性試驗 直接檢測耐藥基因,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,（二）乙型肝炎病毒,1.生物學特性及致病性,2.乙型肝炎病毒核酸的檢測,3.變異株與耐藥突變檢測,乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒。是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae）。 根據(jù)目前所知，HBV就只對人和猩猩有易感性，引發(fā)乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙肝病毒成顆粒狀，也會被稱為丹娜顆粒（Dane）。1965年由丹娜發(fā)現(xiàn)。直徑為42納米。顆粒分為外殼和核心兩部分。,（二）乙型肝炎病

6、毒,1.生物學特性及致病性 HBV對外界環(huán)境的抵抗力較強，且傳染性較強 輸血或注射是重要的傳播途徑 HBV感染后潛伏期約26個月，HBV DNA在肝細胞內(nèi)以游離DNA和整合到宿主細胞染色體的方式存在 HBV分為8個基因型，AH型,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,2.乙型肝炎病毒核酸的檢測,（1）熒光定量PCR技術(shù)：測定HBV病毒載量 HBV DNA 107拷貝/毫升，提示病毒復制活躍 HBV DNA 103拷貝/毫升、HBeAg轉(zhuǎn)為陰性， 正常的病人預后相對較好,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,（2）支鏈DNA（bDNA）技術(shù)： 一種核酸探針雜交標志信號放大技術(shù) 。 優(yōu)點：穩(wěn)定性和重復性較好，

7、結(jié)果準確，操作簡單， 將待測病毒裂解釋放核酸后變性為單鏈，即 可進行檢測 。 缺點：敏感性較低、檢測范圍窄而不適用于低水平病 毒的檢測 。,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,還可以用于乙肝病毒基因檢查的方法主要有：熒光PCR法、競爭PCR法、PCR酶聯(lián)免疫吸附法、熒光標記物法和PCR酶聯(lián)化學發(fā)光等方法。,3.變異株與耐藥突變檢測,HBV可能發(fā)生自然變異 HBV在人體活疫苗接種和抗病毒治療等壓力下發(fā)生變異 HBV基因組的變異常引起病毒生物學特性的改變，從而導致HBV感染發(fā)病機制的變化、血清學檢測指標的改變以及免疫逃逸，給乙型肝炎的診斷和治療帶來困難,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,HBV耐藥突變類

8、型及其核苷酸、氨基酸變化,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,（三）人類免疫缺陷病毒,1.形態(tài)結(jié)構(gòu)與致病性,2.HIV核酸檢測,人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV），顧名思義它會造成人類免疫系統(tǒng)的缺陷。1981年，人類免疫缺陷病毒在美國首次發(fā)現(xiàn)。它是一種感染人類免疫系統(tǒng)細胞的慢病毒（Lentivirus），屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種。至今無有效療法的致命性傳染病。該病毒破壞人體的免疫能力，導致免疫系統(tǒng)的失去抵抗力，而導致各種疾病及癌癥得以在人體內(nèi)生存，發(fā)展到最后，導致艾滋病（獲得性免疫缺陷綜合征）。,（三）人類免疫缺陷病毒,1.形態(tài)結(jié)構(gòu)與致病性 HIV根據(jù)血

9、清學反應和病毒核酸序列分為 HIV-1型、HIV-2型 HIV結(jié)構(gòu)分為 包膜、核心,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,HIV直接或間接損傷CD4+T細胞 HIV抑制抗原遞呈細胞功能 HIV誘發(fā)自身免疫性疾病及誘導細胞凋亡 HIV導致CD8+T細胞喪失抗病毒活性等,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,HIV感染以侵犯CD4+T細胞為主,原位雜交 PCR NASBA技術(shù) bDNA技術(shù) 熒光定量RT-PCR技術(shù),一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,2.HIV核酸的檢測的分子生物學方法,（四）SARS冠狀病毒,從SARS病人體內(nèi)分離到的冠狀病毒與任何以往確定特征的冠狀病毒關(guān)系不密切，且該病毒的有限區(qū)域的復制酶（

10、rep）基因序列與其它冠狀病毒明顯不同，因而被稱為SARS相關(guān)冠狀病毒。,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,SARS相關(guān)冠狀病毒的檢測 WHO推薦SARS-CoV特異性檢測方法： 分子生物學檢測 免疫學檢測 細胞分離培養(yǎng),一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,免疫學方法難以在感染的窗口期對病毒感染進行早期檢測 細胞培養(yǎng)所需時間較長，分離陽性率不高 PCR方法可以確診早期疑似病人，但PCR試驗陰性并不能說明沒有SARS-CoV感染,（五）人禽流感病毒,人禽流行性感冒（簡稱人禽流感）是由禽甲型流感病毒某些亞型的毒株引起的急性呼吸道傳染病，感染者大多因多臟器功能衰竭而死亡 。

11、,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,近年來，由H5N1亞型禽流感病毒引起的疫情廣泛傳播對人類的健康造成全球性的重大威脅。由于病毒的不斷變異，開發(fā)新型抗流感藥物成為各國極為迫切的重大課題。其中，揭示與流感病毒密切相關(guān)的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)不僅對揭示流感病毒復制機制具有重要科學意義，而且對開發(fā)抗流感病毒藥物具有重要價值。最近，由中科院生物物理研究所劉迎芳研究員領(lǐng)導的研究組和饒子和院士領(lǐng)導的研究小組在這一領(lǐng)域取得突破性進展，他們在國際上率先揭示了流感病毒聚合酶關(guān)鍵部分PA亞基與PB1多肽復合體的精細三維結(jié)構(gòu)。,（五）人禽流感病毒,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,1.病原學特征及致病性,2.人禽流感病毒的檢

12、測,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,1.病原學特征及致病性 禽流感病毒屬甲型流感病毒，基因組為單股負鏈RNA 依外膜血凝素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，可分為15個H亞型和9個N亞型 感染人的禽流感病毒亞型主要為H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情最重,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測,2.人禽流感病毒的檢測 (1) 病毒核酸檢測：RT-PCR技術(shù)從病人呼吸道 標本中檢測禽流感病毒亞型特異性H抗原基因。 (2) 病毒抗原蛋白質(zhì)分子檢測：取病人呼吸道 標本采用免疫熒光法檢測甲型流感病毒核蛋白抗原 及禽流感病毒H亞型抗原 。,二、 耐藥監(jiān)測與分子流行病學調(diào)查,（一）耐

13、藥突變檢測,（二）分子流行病學調(diào)查,二、 耐藥監(jiān)測與分子流行病學調(diào)查,PCR-RFLP SSCP DGGE PCR-反向斑點雜交技術(shù) DNA序列分析 芯片技術(shù)等,（一）耐藥突變檢測,二、 耐藥監(jiān)測與分子流行病學調(diào)查,追蹤和控制傳染源及可能的傳播途徑 確定同一病人反復感染是源于復發(fā)或再感染 明確某一菌株是否與某些臨床表現(xiàn)相關(guān)，從而發(fā)現(xiàn)其特殊的傳播和致病機制,（二）分子流行病學調(diào)查,二、 耐藥監(jiān)測與分子流行病學調(diào)查,1.IS6110 RFLP,2.間隔區(qū)寡核苷酸探針分型技術(shù),二、 耐藥監(jiān)測與分子流行病學調(diào)查,1.IS6110 RFLP（限制性片斷長度的多態(tài)性 ） IS6110重復序列探針被稱為結(jié)核

14、分枝桿菌復合 群分型的金標準。 檢測步驟： 細菌培養(yǎng) 提取基因組DNA Pvu限制性酶水解 Southern印跡 IS6110探針雜交,IS6110-RFLP分型方法要比基于PCR的分型方法需較多的菌株材料，以產(chǎn)生足夠的DNA用于分析。這要求基因分型實驗室將菌株接種到培養(yǎng)基中，然后等待足夠的培養(yǎng)物長出。與PCR方法（MIRU和spoligotyping分析）不同的是，RFLP分析不能在非活性培養(yǎng)物上進行。,二、 耐藥監(jiān)測與分子流行病學調(diào)查,2.間隔區(qū)寡核苷酸探針分型技術(shù) 直接重復序列只在結(jié)核分枝桿菌復合群細菌染色體的某一位置出現(xiàn)，由多個高度保守的36bp的序列組成，其間被高度保守的3441bp

15、非重復的短序列間隔開 36bp重復序列出現(xiàn)的次數(shù)和某些間隔序列的出現(xiàn)或消失，在不同菌株表現(xiàn)出可變性,三、醫(yī)院獲得性感染的監(jiān)測與控制,醫(yī)院感染，又稱院內(nèi)感染，是指病人入院時尚未感染，也不處于感染的潛伏期，而是在入院以后（通常指入院48小時后）引起的感染，以及在醫(yī)院內(nèi)獲得但在出院后才發(fā)生的感染,一、與院內(nèi)感染有關(guān)的因素,（一）機體因素 一般病人均處于抵抗力低下狀況，幾乎所有傳染因子均可引起院內(nèi)感染。一個病人的正?；驐l件致病菌感染可以轉(zhuǎn)給其他病人。尤其是新生兒免疫機制尚未成熟，老年人隨年齡增長發(fā)生生理改變，故危險性大。,（二）應用某些診斷或治療手段 這些人往往對院內(nèi)感染易感性增加。例如外科手術(shù)后保留導管（尤其是靜脈內(nèi)和膀胱內(nèi)）、氣管插管或切開、輸血、麻醉、使用免疫抑制藥物、抗生素等。,（三）醫(yī)院中病人集聚 各類病人密集程度和相互接觸機會決定了院內(nèi)感染發(fā)生的可能性。醫(yī)院內(nèi)耐藥菌株常多。一般衛(wèi)生狀況不良為院內(nèi)感染創(chuàng)造條件。,二、院內(nèi)感染的種類 （一）交叉感染（cross infection） 交叉感染是在醫(yī)院內(nèi)獲得而引起的微生物感染。