免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)

1、免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù),一 淋巴細(xì)胞的功能檢測,淋巴細(xì)胞功能測定可分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要是間接了解淋巴細(xì)胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)；體外實(shí)驗(yàn)主要包括淋巴細(xì)胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)及淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)物的測定,淋巴細(xì)胞,T細(xì)胞（負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫功能） B細(xì)胞（執(zhí)行體液免疫功能） NK細(xì)胞（非特異性免疫作用）,一、T細(xì)胞功能的檢測,T細(xì)胞增殖試驗(yàn) T細(xì)胞分泌功能測定 T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn) 體內(nèi)試驗(yàn),（一）T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn),1. 原理：,淋巴細(xì)胞,DNA合成,分化,母細(xì)胞,刺激物,細(xì)胞變大,細(xì)胞漿擴(kuò)大,空泡,核仁明顯,核染色質(zhì)疏松,2. 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺

2、激物,非特異性刺激物： PHA -T細(xì)胞 ConA -T細(xì)胞 PWM -T、 B細(xì)胞 LPS -B細(xì)胞 特異性刺激物： 異種抗原 同種組織抗原,3. 檢測方法,形態(tài)法：刺激物 淋巴細(xì)胞（4-6天） 母細(xì)胞化 同位素法：PHA 淋巴細(xì)胞（54h） DNA合成期 + 3HTdR摻入 收集細(xì)胞 檢測射線,測定細(xì)胞內(nèi)的3HTdR,（1）形態(tài)學(xué)檢查法,方法學(xué)評價(jià)：,優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)學(xué)方法簡便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。 缺點(diǎn)：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。,（2）3H-TdR摻入法,優(yōu)點(diǎn)：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好。 缺點(diǎn)

3、：但需一定設(shè)備條件，同時(shí)還存在放射性核素污染問題。,MTT,測吸光度,(3) MTT 比色法,(二) T細(xì)胞分泌功能測定,體外培養(yǎng)的T細(xì)胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細(xì)胞因子,可借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測細(xì)胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達(dá)水平，以反映T細(xì)胞功能。,（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn),1.原理：,靶細(xì)胞抗原,T細(xì)胞,觀察殺傷活力,致敏CTL,靶細(xì)胞,形態(tài)學(xué)方法：淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞 計(jì)數(shù)殘留腫瘤細(xì)胞,2.方法,意義： 腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力,51Cr釋放法,(四) 體內(nèi)試驗(yàn),特異性抗原皮膚試驗(yàn) PHA皮膚試驗(yàn),二、B細(xì)胞功能檢測,B細(xì)胞增殖能力的試驗(yàn)

4、溶血空斑試驗(yàn) B細(xì)胞抗體形成功能的檢測 體內(nèi)試驗(yàn),(一)B細(xì)胞增殖能力的試驗(yàn),抗IgM 細(xì)菌脂多糖 SAC的SPA,B細(xì)胞增殖,形態(tài)學(xué),3HTdR摻入法,(二) 溶血空斑試驗(yàn),1. 原理：,2. 方法學(xué)：,經(jīng)典溶血空斑形成試驗(yàn) 被動(dòng)溶血空斑試驗(yàn),3臨床應(yīng)用與評價(jià),溶血空斑試驗(yàn)主要用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響 評價(jià)免疫治療或免疫重建后機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力。,(三) B細(xì)胞抗體形成功能的檢測 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法ELISPOT,1.原理：,2應(yīng)用與方法學(xué)評價(jià)：,該方法既可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可檢測抗體分泌量。 優(yōu)點(diǎn)： 穩(wěn)定、特異、抗原用量少； 可同時(shí)檢測不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量

5、；可檢測組織切片中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞。,(四)體內(nèi)試驗(yàn),體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、多價(jià)肺炎鏈球菌菌苗等。 將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價(jià)，判斷受檢者體內(nèi)B細(xì)胞的功能。,染色計(jì)數(shù),離心取上清 測LDH或AKP,離心取沉淀 測活細(xì)胞熒光,測發(fā)光強(qiáng)度,測CPM值,形態(tài)法 酶釋法 熒光法 同位素法 化學(xué)發(fā)光法,三、NK細(xì)胞活性測定,靶細(xì)胞溶解,常用靶細(xì)胞: K562細(xì)胞株,二 吞噬細(xì)胞功能檢測技術(shù),按其形態(tài)大小分為兩類： 大吞噬細(xì)胞單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng) 小吞噬細(xì)胞中性粒細(xì)胞,一、中性粒細(xì)胞功能

6、的檢測,細(xì)胞趨化功能的檢測 吞噬和殺菌功能的檢測,(一) 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能趨化功能檢測,1.原理：,2. 方法：,瓊脂糖平板法,濾膜滲透法（Boyden 小室法）,(二)吞噬和殺菌功能測定,1顯微鏡檢查法：,2. 溶菌法,NBT還原試驗(yàn),原理：,N-N- C + H+ N=N-R-,N-NH2 C N=NH,四氮唑基（淡黃色）,甲臜（紫黑色）,3NBT還原試驗(yàn),中性粒細(xì)胞,NBT,甲臜顆粒沉積于胞質(zhì)中,二、巨噬細(xì)胞功能檢測,(一)炭粒廓清試驗(yàn),正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10%炭粒。據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時(shí)間反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。,(二)吞噬功能檢測,巨噬細(xì)胞對顆粒性抗原物質(zhì)具有很強(qiáng)的吞噬功能，常用雞紅細(xì)胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母細(xì)胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人巨噬細(xì)胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨噬細(xì)胞。,(三)巨噬細(xì)胞溶酶體酶的測定,1酸性磷酸酶的測定 硝酸鉛法 偶氮法 2非特異性酯酶的測定 常用-萘醋酸法,(四) 細(xì)胞毒作用測定,用IFN-激活小鼠巨噬細(xì)胞，觀察其對125I-UdR標(biāo)記的DBA/2小鼠肥大細(xì)胞瘤P815的殺傷活性。,(五) 巨噬細(xì)胞促凝