實(shí)驗(yàn)3質(zhì)粒的提取和鑒定.ppt

1、堿變性法小量提取質(zhì)粒DNA的限制性酶切,廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)組,目的,掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法:最常用的提取基因工程中運(yùn)載基因的載體 掌握質(zhì)粒酶切鑒定原理, 學(xué)會(huì)根據(jù)目的基因和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適載體與限制性內(nèi)切酶，設(shè)計(jì)構(gòu)建體外重組分子,質(zhì)粒(plasmid)是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的DNA分子，在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。,質(zhì)粒DNA的提取方法,方法：堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法，質(zhì)粒DNA釋放法；酸酚法等。 概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理 所有分離質(zhì)粒DNA

2、的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA(有時(shí)還要求純化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需),選擇哪一種方法主要取決于以下幾個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)要求,堿裂解法,基本原理： 1. 當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不復(fù)性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來,2.在一定電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型(相對分子質(zhì)量不同的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣)，且DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)

3、量的對數(shù)值成反比關(guān)系。因此，凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子：其中超螺旋結(jié)構(gòu)泳動(dòng)最快，其次為線性結(jié)構(gòu)，最慢的可能是復(fù)制中間體（沒有復(fù)制完的兩個(gè)質(zhì)粒連在一起），而不是開環(huán)結(jié)構(gòu)（用EcoRI來線性化質(zhì)粒后再進(jìn)行瓊脂糖電泳，就會(huì)看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣）,3. 溴化乙錠是一種熒光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴鹽)，其分子可以嵌入到核酸的堿基對之間，在紫外線的激發(fā)下，發(fā)出橙色熒光,原理示意圖,限制性核酸內(nèi)切酶: 一類能識別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶。 限制性切酶以內(nèi)切的方式水解核酸鏈中的磷酸二酯

4、鍵，產(chǎn)生的DNA片段5端帶磷酸基團(tuán)，3端為-OH。,限制性核酸內(nèi)切酶分類,識別切割特性 催化條件 是否具有修飾酶活性 至2005年1月，共發(fā)現(xiàn)限制酶3681種 型59種 型3612種 型10種 商業(yè)化的限制酶有 588 種，在 型限制酶中共有 221 種特異性。,型限制與修飾系統(tǒng),占90%以上，即通常指的DNA限制性內(nèi)切酶，它們能識別雙鏈DNA的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的DNA片段； 型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識別順序一般為4-6個(gè)堿基對的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序； 型內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口：5端突出，3端突出和平末端。,酶切反應(yīng)中應(yīng)注意以下幾個(gè)

5、問題：,1. 內(nèi)切酶：不應(yīng)混有其他雜蛋白特別是其他內(nèi)切酶或外切酶的污染；注意內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)和形成的粘性末端； 2. 內(nèi)切酶的用量：根據(jù)內(nèi)切酶的單位和DNA用量而定。使用中一般以1 g DNA用2-3U酶進(jìn)行酶切為宜； 3. 內(nèi)切酶體積：不能超過反應(yīng)體系的10%，因內(nèi)切酶中含50%甘油，體系中甘油超過5%會(huì)抑制內(nèi)切酶的活力； 4. 操作條件：應(yīng)在低溫下進(jìn)行（冰上）；使用時(shí)防止操作中對內(nèi)切酶的污染。,5. DNA：作為內(nèi)切酶的底物，DNA應(yīng)該具備一定的純度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，這些因素的存在均在不同程度影響限制性內(nèi)切酶的活性。,反應(yīng)緩沖液：,1. 反應(yīng)緩沖液: 主要由T

6、ris-HCl、NaCl、Mg2+組成，其中Mg2+ 為內(nèi)切酶的輔基； A. Tris-HCl維持反應(yīng)體系的PH值在7.27.6之間； B. NaCl濃度： 低鹽(10mM NaCl) 中鹽(50mM NaCl) 高鹽(100mM NaCl),2. 酶解的溫度：大多數(shù)限制酶的反應(yīng)時(shí)間為37，如EcoR、Hind、BamH、Pst等，也有如Bcl需在50下進(jìn)行反應(yīng)。 3. 酶解反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)酶的單位與DNA用量之比來定，原則是酶/DNA23，12小時(shí)即可充分酶解。 4. 酶單位定義：在每種內(nèi)切酶理想的反應(yīng)條件下 ， 0.05mL反應(yīng)混合物中, 1小時(shí)消化1g底物DNA的酶量為1單位(1U)。,三

7、 質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)材料與試劑,（一）實(shí)驗(yàn)材料： 過夜培養(yǎng)大腸桿菌DH-5a （二）實(shí)驗(yàn)試劑： LB培養(yǎng)基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL（pH8.0）、1mM EDTA、 Amp 50mg/ml、酚、氯仿、Rnase、瓊脂糖 TE：10mM Tris.CL （pH8.0），1mM EDTA 溶菌酶 10mg/ml（用10mM Tris.CL，pH8.0，新鮮配制）,溶液溶菌液： 50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。 溶液 NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。 溶液 3mol/L NaAc（pH4.8）溶

8、液：5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。,四步驟(一) 細(xì)菌培養(yǎng)與質(zhì)粒擴(kuò)增,1. 挑單克隆E.coli菌株接種到4ml LB培養(yǎng)液中（含Amp 50g/ml），37 225rpm振蕩培養(yǎng)過夜。 （活化菌種） 2.從中取2ml種子菌液于含Amp培養(yǎng)基500ml中，37振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)（OD6001.0） 3.取4ml培養(yǎng)液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 離心30秒，棄上清，用1ml STE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復(fù)一次，棄上清，取沉淀。,步驟二 質(zhì)粒提取,取4ml培養(yǎng)物至Eppendorf管中，12000rpm，4，離心30sec，棄上清。

9、用1ml STE懸浮菌體，再離心回收菌體，并重復(fù)一次，棄上清取沉淀，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。 將細(xì)菌沉淀懸浮于100l預(yù)冷的溶液I中，加入10 l溶菌酶（10mg/ml），劇烈振蕩均勻，冰上放置1分鐘。 加200L溶液II（新鮮配制），蓋緊Eppendorf管，快速輕柔顛倒5次，混勻內(nèi)容物，將Eppendorf管放在冰上3分鐘 。,5.加入150L溶液III （冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻，冰上放置5min。 6.12000r/min， 4 離心5min，將上清夜轉(zhuǎn)至另一1.5ml Eppendorf管中。7.加入等體積酚/氯仿（1：1），振蕩混勻，室溫放置5-10min，12000 r

10、pm，4 下離心2分鐘，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水紙上，吸干液體。 8.加入2倍體積冰預(yù)冷無水乙醇，振蕩混勻，12000 rpm 4 離心5分鐘。,9. 倒去上清，加入1ml冰預(yù)冷70%乙醇振蕩漂洗DNA沉淀。12000 rpm，4 離心2分鐘。 10棄上清并盡量吸除液體，打開管蓋，室溫放置5min。室溫放置15min干燥。 1150L TE緩沖液（含無DNase的RNase 20 g/ml） ，使DNA完全溶解（-20保存） 12取樣品10 l加2ul 6 Loading buffer于1 %瓊脂糖電泳，電泳凝膠在凝膠成像系統(tǒng)上成像。,雙酶切實(shí)驗(yàn)材料,限制性內(nèi)切酶：EcoR、

11、Xba和Hind DNA：DNA和質(zhì)粒pCDNA-p38 10buffer H （37, PH7.5） 90mM TrisCl 50mM NaCl 10M MgCl2 10buffer M（37, PH7.5） 6mM TrisCl 100mM NaCl 6M MgCl2 1mM DTT 10BSA： 1mg/ml 無菌水,方法和步驟,1. 反應(yīng)體系配制： 質(zhì)粒pCDNA3p38 10 l（1g） 10buffer M 2 l 10BSA 2 l EcoR 1 l Xba 1 l H2O 4 l 總體積 20 l,2. 將反應(yīng)體系充分混勻，并于臺式離心機(jī)上短暫離心收集液體。 3. Eppend

12、orf管于37水浴中反應(yīng)23小時(shí)。 4. 反應(yīng)結(jié)束后70滅活15min或者加入EDTA至終濃度10mM終止反應(yīng)。 5. 取20l反應(yīng)液加入6loading buffer混勻于1.2瓊脂糖凝膠膠上150伏電泳，約30min 加入5l未酶切對照。 6. 凝膠成像體系觀察記錄結(jié)果。 7.當(dāng)DNA條帶充分分開后，在紫外燈下細(xì)心切取所要的DNA條帶。盡量去除多余的凝膠。紫外燈照射DNA片段不要超過30秒。注意保護(hù)眼睛免受紫外線傷害。,五 實(shí)驗(yàn)結(jié)果,雙鏈DNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù)50/1000。 RNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù)40/1000。 （在波長260

13、nm紫外光下，1 OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml；單鏈DNA為37 g/ml；RNA為40 g /ml。）,凝膠成像結(jié)果,1.2% Agarose Gel,1 2 3 4,1.1000bp DNA ladder 2. CDNA3-p38/EcoRI+XbaI 3. ppCDNA3-p38 4.100bp DNA ladder,六注意事項(xiàng),為提高質(zhì)粒產(chǎn)量，要注意下面步驟： 加入溶液I 后，渦旋振蕩應(yīng)充分打散菌體使之均勻懸??； 加溶液II裂解要完全(快速輕柔顛倒5-10次) ，使蛋白質(zhì)和核酸變性； 加溶液III后PH要達(dá)到中性(輕柔振蕩5-10次 )，使質(zhì)粒DNA復(fù)性，這樣才能使質(zhì)粒DNA與染色體DNA完全分開，否則，難分開，所以裂解和復(fù)性這兩步要從嚴(yán)掌握。 加入乙醇沉淀DNA時(shí)，要把離心管蓋上蓋子倒翻搖動(dòng)幾次，注意觀察水相和乙醇之間沒有分層現(xiàn)象之后，才可以放到冰箱中去沉淀DNA。,七思考題,1.要得到高質(zhì)量質(zhì)粒樣品，用堿變性法小量提取質(zhì)粒時(shí)要注意什么事項(xiàng)？ 2.溶液I、溶液II和溶液III的作用是什么？在實(shí)驗(yàn)中分別加入上述溶液后反應(yīng)體系出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成