定量蛋白質(zhì)組學研究中的穩(wěn)定同位素標記技術(shù)

1、定量蛋白質(zhì)組學研究中的穩(wěn)定同位素標記技術(shù),北京蛋白質(zhì)組研究中心-生物質(zhì)譜實驗室 鄭兆彬 2008-03-19,定量蛋白質(zhì)組學的主要技術(shù)策略,基于凝膠電泳的策略 2DE-DIGE：difference gel electrophoresis-熒光染料(Cy2,Cy3,Cy5)-標記蛋白上的K的-氨基 穩(wěn)定同位素標記的策略 cICAT: Cleavable Isotope Coded Affinity Tags-標記含C的蛋白-只能定量含C的標記肽段親和富集標記肽段-MS水平上定量 iTRAQ: Isotope Tagging Reagents for Relative and Absolute

2、Quantificaton-多重標記（4 or 8 plex)-標記肽段上K或N末端-標記所有肽段-MS/MS水平上定量肽段ratio。 SILAC: Stable Isotope Labelling with Amino Acids in Cell Culture 細胞培養(yǎng)在分別含輕鏈氨基酸和重鏈氨基酸的培養(yǎng)液/基中 MS水平上測定肽段輕重鏈的比值。 胍基化乙?；€(wěn)定同位素標記:肽段水平上標記-輕重鏈分別標記N端- 標記所有肽段-MS水平上定量 O18標記:在胰酶的催化作用下,羧基端的2個O16原子被交換成O18原子-標記所有肽段-MS水平上定量。,(From ),2DE-DIGE流程圖,位

3、置：X為個氫原子（D0）可被同位素氘（D8）,相差8Da,ICAT試劑的結(jié)構(gòu),cICAT試劑的結(jié)構(gòu),cICAT (ABI)在ICAT基礎上做了一些改進, 其同位素標簽分別由9個12C和13C標記, 這樣由不同原子標記的cICAT分子量相差9 Da。 三部分組成：半胱氨酸特異性反應基團、含9個同位素12C或13C標簽的可裂解連接子和親和純化的生物素部分. 在同位素標簽的連接子和親和反應基團之間增加了一個酶解位點, 在ICAT標記的肽段分離純化后可以通過酸裂解將親和反應基團生物素切去, 裂解后的同位素標簽的分子量只有227(236)Da.,ICAT用于蛋白質(zhì)定量分析步驟,iTRAQ,iTRAQ試劑

4、的結(jié)構(gòu),分別還原烷基化，胰蛋白酶酶切,一級質(zhì)量數(shù)相同,LCMS/MS分析,SCX分離和餾分收集,混合標記樣品,4組蛋白樣品（等量）,分別用不同的iTRAQ試劑標記 (114 115 116 117),iTRAQ 定量分析步驟 （4重）,二級的報告基團反應定量結(jié)果,胍基化-乙?；凰貥擞浄椒?胍基化反應（K）,乙酰化反應（N-termini）,胍基化-乙?；瘶擞浄椒ㄔ韴D,采用胍基化-乙?；凰貥擞浺院?，輕鏈標記肽段和重鏈標記肽段質(zhì)量數(shù)相差3.01884 Da。,胍基化反應（Guanidination）,概述：胍基化反應是O-甲基異脲氫硫酸與賴氨酸的-氨基發(fā)生反應，使賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦呔彼帷?

5、具體反應過程： (1)肽段凍干粉（ug級）中加入50ul 硼酸緩沖液（50mM硼砂，200mM硼酸，pH8.0）. (2)加入200 ul胍基化試劑（1M O-甲基異脲氫硫酸溶于1M NaOH），振蕩混勻。 (3)37水浴6-8個小時進行胍基化反應。 胍基化反應的特點： 反應比較完全。 目的：封閉賴氨酸的-氨基，使后續(xù)的乙?；磻兄挥须亩蔚腘端發(fā)生乙?；磻?胍基化反應能提高以K結(jié)尾肽段在MALDI源質(zhì)譜中的信號強度，因為高精氨酸的胍基（PKa=12.48)比賴氨酸的氨基(PKa=10.48)有更強的堿性，更容易結(jié)合質(zhì)子帶上正電荷。,乙?；磻ˋcetyl Reaction),概述： 乙

6、酸酐與肽段的N端氨基和賴氨酸的-氨基均可發(fā)生乙酰化反應。 由于前面的胍基化封閉了賴氨酸的-氨基，所以只有N端氨基參與反應。 氘代乙?；虷代乙?；嗖?.01884Da。 反應過程（接上頁胍基化） 乙?；噭?，現(xiàn)用現(xiàn)配。H標試劑:1ul 常規(guī)乙酸酐+9 ul 四氫呋喃；D標試劑:1 ul 氘代乙酸酐+9 ul 四氫呋喃。 用1M HCL 調(diào)節(jié)樣品體系pH至8.0. 每管加入250ul 硼酸buffer,測定確認pH為8.0左右。 每管加入 1ul 乙?；噭阂话鉩ontrol組加H標試劑。病理組加D標試劑。 混勻，暗處放置過夜反應。（一般半個小時可反應完全）。 副反應： 蘇氨酸、絲氨酸和酪氨

7、酸上的-OH基會發(fā)生酯化反應。 反應中的脫水峰比較常見，需要保證H標和D標反應條件的一致性。,乙?；磻暮罄m(xù)處理,處理步驟： 加入10ul 1M 甘氨酸，除掉多余的乙酸酐。混勻，暗處放置0.5h。 將H標樣品和對應的D標樣品混合。（會出現(xiàn)沉淀，充分混勻使沉淀消失） 去酯化：用1M NaOH調(diào)節(jié)至pH11，使酯化反應產(chǎn)物水解，消除副反應。 用TFA調(diào)節(jié)至pH3.0. SPE 小柱脫鹽處理、凍干備用。 FTICR-LTQ質(zhì)譜分析。,胍基化-乙?；凰貥擞?LTQ-FTICR-MSAQ整體策略,SDS-PAGE,樣本處理及SDS-PAGE,穩(wěn)定同位素標記-質(zhì)譜分析定量分析,樣本 A,樣本 B,將

8、胍基化-乙?；凰貥擞浄椒☉糜诤嗤㈩D氏舞蹈病腦脊液樣本的差異蛋白質(zhì)組學分析,腦脊液（Cerebrospinal Fluid）的特點： 1.蛋白濃度低： 大約只有血漿蛋白濃度的千分之四，約200-700ug/ml。 鹽濃度高：150mM 動態(tài)范圍大：其中白蛋白50%.IgG15%.,HD病CSF分析技術(shù)路線,穩(wěn)定同位素標記-質(zhì)譜分析定量分析,當前結(jié)果,蛋白定量結(jié)果： A組定量 331個蛋白（323個8個 ISOFORMs） B組定量 330個蛋白（325個5個 ISOFORMs） C組定量 406個蛋白 (398個 8 個ISOFORMs） ABC三組共同定量的蛋白 183個（180個 3個

9、 ISOFORMs） ABC三組合并有定量信息的蛋白599個(p0.05). * ISOFORM是指在不相鄰的slice鑒定到的同一個蛋白，可能是修飾，降解片斷或者ISOFORM 等。,每組中定量蛋白的Slice分布,定量蛋白質(zhì)組學所面臨的一些問題,看一個例子,來源：Elliott M,Hardie,D,Ohlund L,et.al. Comparative study of five methods for quantitative proteomics,cICAT,iTRAQ,ICPL,O18,and Acetylation,suing Tandem Mass spectrometry.A

10、SMS Poster,2007,cICAT,iTRAQ,Acetylation,1:1,3:1,10:1,樣本：E.coli 全蛋白,0.5,1.5,100,1000,10,4,2,另一個例子-ABRF 2007 PRG Research StudyAdvanced Quantitative Proteomics,針對已有的定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)，43個實驗室進行了合作研究 主要技術(shù)： LF：Label Free DIGE：Differential In-Gel Electrophoresis ICPL：Isotope Coded Protein Label iTRAQisobaric Tags

11、for Relative and AbsoluteQuantitation ICAT：Isotope Coded Affinity Tag 18O：Stable Oxygen Isotope Label SRM：Selected Reaction Monitoring,/index.cfm/group.show/Proteomics.34.htm,采用的樣本-PRG2007 Sample Design,Sample A,Sample B,Sample C,100 g E. coli lysate背景 12 Total Protein Spikes - 10

12、Non-E. coli proteins - 2 E. coli proteins,100 g E. coli lysate 12 Total Protein Spikes - 10 Non-E. coli proteins - 2 E. coli proteins,100 g E. coli lysate 12 Total Protein Spikes - 10 Non-E. coli proteins - 2 E. coli proteins,Proteins in PRG2007 Sample,*,*,*E. coli Proteins,B組與C組相同,Proteins in PRG20

13、07 Sample,Demographics of the Participants,Total Participants = 43,Quantitative DataReturned = 35,87 Labs Requested Samples: 49% Return Rate,35 Participants Returned Methods Used,Techniques Applied,ABRF PRG 2007,24,Results: True Positives vs False Positives,ABRF PRG 2007,25,Results: True Positives v

14、s False Positives,Conclusions,Quantitative proteomics experiments are complex and require many factors for success A handful of participants reported excellent results indicating that quantitative results are achievable Participants using similar techniques did not obtain similar performance and suggests that expertise is a key factor