第二章 生物材料的預(yù)處理和細(xì)胞破碎及固液分離

1、第二章生物材料的預(yù)處理和細(xì)胞破碎及固液分離,概 述,微生物或動植物細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基，值，溫度和通氣攪拌（或厭氣）等發(fā)酵條件下進(jìn)行生長和合成生物活性物質(zhì)，因為在其培養(yǎng)（發(fā)酵）液中包含了菌（細(xì)胞）體，胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物，胞內(nèi)的細(xì)胞物質(zhì)及剩余的培養(yǎng)基殘分等。 不管人們所需要的產(chǎn)物是胞內(nèi)的還是胞外的或是菌體本身，都首先要進(jìn)行培養(yǎng)液的預(yù)處理和菌體回收，只有將固，液分離開，才能從澄清的濾液中采用物理、化學(xué)的方法提取代謝產(chǎn)物，或從細(xì)胞出發(fā)進(jìn)行破碎、碎片分離和提取胞內(nèi)產(chǎn)物。,發(fā)酵（培養(yǎng)）結(jié)束后，首先將菌體或細(xì)胞、固態(tài)培養(yǎng)基等固態(tài)懸浮顆粒與可溶性組分分離，即固液分離。 如固態(tài)懸浮顆粒較粗大，可直接進(jìn)行。 如固態(tài)懸

2、浮顆粒較細(xì)小，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)處理。 如產(chǎn)物在胞內(nèi)，還應(yīng)先進(jìn)行細(xì)胞破碎。,第一節(jié)確定預(yù)處理方法的基本條件,一、了解生物活性物質(zhì)存在的部位 胞外：細(xì)胞產(chǎn)生后，分泌到培養(yǎng)液中 胞內(nèi)：游離在胞漿中、結(jié)合在質(zhì)膜上等,二、穩(wěn)定性 分離提取時，生物活性物質(zhì)處于不斷變化之中，可被細(xì)胞本身的酶所破壞，或為微生物所分解，還可能在制備時受到pH值、酸、堿、溫度、金屬離子、鹽、機(jī)械攪拌等的作用。 如青霉素穩(wěn)定性較差，發(fā)酵液酸化pH需控制在4.85.2，并且低溫。 多粘菌素E穩(wěn)定性較好，可在pH2.0、95處理，可提高過濾速度。,三、提取工藝對濾液質(zhì)量的要求 不同工藝路線對濾液要求不同 離子交換法：無機(jī)離子、灰分要求低 溶

3、劑萃取法：要求蛋白質(zhì)含量較低，減輕乳化 直接沉淀法：對濾液質(zhì)量要求高，需反復(fù)過濾，結(jié)晶前還要脫色處理。如四環(huán)類抗生素。,第二節(jié)生物材料的預(yù)處理,預(yù)處理的目的 （1）改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，以利于固液分離。 主要方法：加熱、凝聚和絮凝。 （2）去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)（可溶性膠狀物質(zhì)和無機(jī)鹽等），以利于后續(xù)各步操作。 可溶性膠狀物質(zhì)：雜蛋白、核酸、不溶性多糖等，可使溶液黏度增加，影響固液分離速度及后續(xù)操作（如堵塞層析柱頭）。,一、菌絲體和蛋白質(zhì)的處理,（一）等電點沉淀 等電點時蛋白質(zhì)溶解度最?。ㄕ{(diào)pH） （二）變性沉淀 變性蛋白質(zhì)的溶解度較小，而產(chǎn)生沉淀 加熱：使蛋白質(zhì)變性、凝聚，同時降低液體黏度，加

4、快過濾速度 鏈霉素生產(chǎn)中，采用調(diào)pH至酸性（pH3.0），加熱至70，維持半個小時的方法來去除蛋白質(zhì)，能使過濾速度增大10-100倍，濾液粘度可降低1/6。 檸檬酸發(fā)酵液，采用加熱至80以上，使蛋白質(zhì)變性凝固和降低發(fā)酵液粘度，從而大大提高了過濾速度。,（三）加各種沉淀劑沉淀 某些化學(xué)試劑能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物沉淀，如三氯乙酸、水楊酸、苦味酸等,（四）加入凝聚劑（小分子） 可使細(xì)胞、細(xì)胞碎片及蛋白質(zhì)等膠體顆粒去除。 凝聚：在某些電解質(zhì)作用下，使膠體粒子的擴(kuò)散雙電層的排斥電位降低，破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒子聚集的過程。 膠體穩(wěn)定的因素：電荷、水化層 電解質(zhì)能中和電荷、破壞水化層 與蛋

5、白質(zhì)鹽析的機(jī)理相同。,發(fā)酵液的帶電現(xiàn)象,發(fā)酵液中的細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面，一般都帶有電荷，帶電的原因很多，主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。通常發(fā)酵液中細(xì)胞或菌體帶有負(fù)電荷，由于靜電引力的作用使溶液中帶相反電荷的粒于（即正離子）被吸附在其周圍，在界面上形成了雙電層。 但是這些正離子還受到使它們均勻分布開去的熱運(yùn)動的影響，具有離開膠粒表面的趨勢，在這兩種相反作用的影響下，雙電層就分裂成兩部分，在相距膠核表面約一個離子半徑的stern平面以內(nèi)，正離子被緊密束縛在膠核表面，稱為吸附層或stern層；在stern平面以外，剩余的正離子則在溶液中擴(kuò)散開去，距離越遠(yuǎn)，濃度越小，最后達(dá)到主

6、體溶液的平均濃度，稱為擴(kuò)散層。這樣就形成了擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)模型。,（五）加入絮凝劑（高分子） 絮凝劑：天然或人工合成的有機(jī)高分子化合物，具長鏈線狀結(jié)構(gòu)，易溶于水，有大量的活性基團(tuán)。 吸附膠粒，產(chǎn)生架橋連接，形成粗大的絮凝團(tuán)，有助于過濾。 可與凝聚劑配合使用，提高絮凝效果。 影響因素：（1）分子量：鏈越長，吸附架橋效果越好，但自身在水中溶解度也降低。 （2）用量：增加用量，有助于架橋，但過多會引起吸附飽和，降低絮凝效果。 （3）PH值：影響電離度，從而影響鏈的伸展形態(tài)。 （4）攪拌速度和時間 ：適當(dāng)攪拌，可使絮凝劑迅速分散，但過快會打碎絮凝團(tuán)。,常用的絮凝劑,聚丙烯酰胺（po1yacry1ami

7、de）類和聚乙烯亞胺（polyethyleneimine）衍生物，根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分為非離子型、陰離子型（含有羧基）和陽離子型（含有胺基）三類。由于聚丙烯酰胺類絮凝劑具有用量少，一般以ppm計量，絮凝體粗大，分離效果好，絮凝速度快以及種類多等優(yōu)點，所以適用范圍廣。 聚丙烯酸類陰離子絮凝劑和聚苯乙烯類衍生物。 無機(jī)高分子聚合物也是較好的一類絮凝劑，如聚合鋁鹽和聚合鐵鹽等。 天然有機(jī)高分子絮凝劑，如殼聚糖和葡聚糖等聚糖類，還有明膠、骨膠、海藻酸鈉等。 微生物絮凝劑是近年來研究和開發(fā)的新型絮凝劑，它是一類由微生物產(chǎn)生的具有絮凝細(xì)胞功能的物質(zhì)。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纖維素及核酸等

8、高分子物質(zhì)。微生物絮凝劑和天然絮凝劑與化學(xué)合成的絮凝劑相比，最大的優(yōu)點是安全，無毒和不污染環(huán)境。,凝聚和絮凝：均是破壞發(fā)酵液中膠體的穩(wěn)定性， 增大顆粒尺寸，增大顆粒的沉降或浮選速率。 （六）吸附 加入反應(yīng)劑，相互反應(yīng)生成沉淀，能吸附蛋白質(zhì)和菌體等膠粒，同時起助濾劑作用。 如四環(huán)素發(fā)酵液中加入黃血鹽和硫酸鋅，生成亞鐵氰化鋅鉀K2Zn3Fe(CN)52的膠狀沉淀，能將雜蛋白和菌體黏附而除去。 在枯草桿菌發(fā)酵液中，常加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，這兩者本身生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而加快了過濾速度。,（七）酶解法去除不溶性多糖 不溶性多糖會增大溶液黏度，使固液

9、分離困難，可加入淀粉酶進(jìn)行水解，將發(fā)酵液中多余淀粉水解。,二、高價金屬離子的去除,對提取和成品質(zhì)量影響較大。 （一）離子交換法 通過陽離子樹脂 如四環(huán)素發(fā)酵液通過122型樹脂，除去Fe3+ ，同時也吸附色素，提高濾液質(zhì)量。 （二）沉淀法 形成不溶性沉淀 去除Ca2+，常用草酸鈉或草酸，形成草酸鈣沉淀 去除Mg2+，可用草酸、磷酸鹽、三聚磷酸鈉等 去除Fe3+，加入黃血鹽，形成普魯士藍(lán)沉淀,問題,1、改變發(fā)酵液過濾特性的主要方法有哪些？其簡要機(jī)理如何？ 2、除去發(fā)酵液中雜蛋白的常用方法有哪些？ 3、如何去除發(fā)酵液中的多糖、金屬離子？ 4、凝聚和絮凝有哪些不同之處？,第三節(jié) 細(xì)胞破碎,一些微生物在

10、代謝過程中將產(chǎn)物分泌到細(xì)胞之外的液相中（稱胞外酶），這些產(chǎn)品主要為醫(yī)藥和保健產(chǎn)品，如胰島素、某些細(xì)胞因子和疫苗亞單位成分等。 這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)時被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，提取過程只需直接采用過濾和離心進(jìn)行固液分離，然后將獲得的澄清濾液再進(jìn)一步純化即可。其后續(xù)分離和純化都相對簡單。,細(xì)胞破碎,胞內(nèi)產(chǎn)物：青毒素?；?、堿性磷脂酶等 但由于一些重組DNA（rDNA）產(chǎn)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜，必須在細(xì)胞內(nèi)組裝來獲得生物活性，如果在培養(yǎng)時被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，其生物活性往往有所改變，此類rDNA產(chǎn)品是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)品（非分泌型），需要應(yīng)用細(xì)胞破碎技術(shù)破碎細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放到液相中，然后再進(jìn)行提純，為后續(xù)的分離

11、純化做好準(zhǔn)備工作。,幾種由大腸桿菌表達(dá)的胞內(nèi)重組藥物,細(xì)胞破碎（cell rupture）技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。 胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性差,條件不適極易失活。特別是微生物細(xì)胞十分微小,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較緊密,一般方法不易將細(xì)胞打破,有些技術(shù)雖然可以,但條件嚴(yán)苛,胞內(nèi)生物活性物質(zhì)在此條件下很易失活,限制了一些技術(shù)的應(yīng)用。 在一定程度上細(xì)胞破碎仍是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)。,細(xì)胞破碎,細(xì)胞破碎,通常細(xì)胞壁較堅韌，細(xì)胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細(xì)胞破碎的阻力主要來自于細(xì)胞壁。 基于遺傳和環(huán)境等因素，不同類型生化物質(zhì)其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不

12、完全相同，故細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度不同，細(xì)胞破碎的難易程度也就不同。 此外，不同的生化物質(zhì)其穩(wěn)定性有較大差別，在破碎過程中應(yīng)防止變性和被胞內(nèi)的酶水解，因此，破碎方法的選擇和操作條件的優(yōu)化是十分必要的。,細(xì)胞壁的成分,細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分是肽聚糖 革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖層組成（2080nm)，較難破碎。 革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁的肽聚糖層較薄（23nm)，還有兩層外壁層。,肽聚糖（peptidoglycan）,肽聚糖是難溶性的聚糖鏈（glycan chain），借助短肽交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細(xì)胞周圍，使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。 短肽一般由四或五個氨基酸組成，如L-丙氨酰-D-谷氨酰-L-賴氨

13、酰-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-氨基酸與二氨基庚二酸存在。,破碎細(xì)菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，如果交聯(lián)程度大，則網(wǎng)結(jié)構(gòu)就致密。,細(xì)胞壁的成分,霉菌細(xì)胞壁較厚，100205nm，多數(shù)由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成。 酵母細(xì)胞壁主要成分是葡聚糖，還含有甘露糖、蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)。幼時較薄，以后逐漸變硬。較革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁更厚，更難破碎。 藻類的細(xì)胞壁非常復(fù)雜，主要結(jié)構(gòu)是纖維狀的多糖物質(zhì)。其強(qiáng)度取決于聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的交聯(lián)程度。,細(xì)胞破碎方法,液體裁切：超聲波、攪拌、壓力 機(jī)械法 固體裁切：研磨、壓力 細(xì)胞破碎 干燥：空氣、真空

14、、冷凍、噴霧 非機(jī)械法 溶胞：物理法、化學(xué)法、酶法,高壓勻漿器,操作原理,它由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出閥（discharge valve）組成，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調(diào)節(jié)。 細(xì)胞漿液通過止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速沖出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速沖擊，使細(xì)胞受到高的液相剪切力而破碎。 在操作方式上，可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式，也可連續(xù)操作。 為了控制溫度的升高，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20左右。 在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止

15、期的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。,高壓勻漿法,影響細(xì)胞破碎的主要因素：壓力、循環(huán)次數(shù)、溫度。 操作壓力：5070MPa，一般為55MPa 一次破碎率：12%67%，達(dá)到90%要多次 提高操作壓力，有利于破碎，減少循環(huán)次數(shù) 溫度由5提高到30，酵母破碎率提高1.5倍 適用于酵母和大多數(shù)細(xì)菌的破碎。 不適用于高度分枝的微生物，因為會堵塞閥。,高壓勻漿法,細(xì)胞種類、生長環(huán)境、生長速率和產(chǎn)物位置對操作條件的影響 大腸桿菌較酵母易破碎 生長在復(fù)雜培養(yǎng)基的大腸桿菌比生長在合成培養(yǎng)基中的大腸桿菌難破碎 非結(jié)合酶處理一次即可（壓力54.5MPa，菌體濃度10%20%），膜結(jié)合酶則需3次破碎。 大腸桿菌的破

16、碎效果隨生長速率的減少而降低。,高壓勻漿器的操作溫度上升約/10MPa 為了保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性，需要對料液作冷卻處理。 多組破碎操作中需要在級間設(shè)置冷卻裝置可有效防止溫度上升，保護(hù)產(chǎn)物活性。,高壓勻漿法使用時注意事項,高速珠磨法,利用細(xì)胞與玻璃小珠在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間以及珠子和細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，促使細(xì)胞壁破裂。,高速珠磨機(jī)工作原理,水平位置的磨室內(nèi)放置玻離小珠，裝在同心軸上的園盤攪拌器高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻離小珠相互攪動，細(xì)胞的破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動而引起。 在料液出口處，旋轉(zhuǎn)園盤和出口平板之間的狹縫很小，可阻擋玻離小珠，使不被料液帶出。 由于操作過

17、程中會產(chǎn)生熱量，易造成某些生化物質(zhì)破壞，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細(xì)胞懸浮液和玻離小珠。,高速珠磨法,影響因素有：攪拌速度、料液循環(huán)速度、細(xì)胞濃度、珠粒大小和數(shù)量、溫度等。 提高攪拌速度、降低細(xì)胞濃度、增加小珠裝量。 過大攪拌速度和過多的小珠會增大能耗，產(chǎn)熱增加 磨珠越小、破碎速度越快，但磨珠太小易于漂浮。 對真菌菌絲和藻類的細(xì)胞破碎效果較好。,超聲波法（Ultrasonication),超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。 超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振

18、動。 超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。,超聲波法（Ultrasonication),超聲波在流體中傳播時，出現(xiàn)細(xì)小的空穴，又迅速閉合，產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊波壓力，在懸浮細(xì)胞上造成剪切力，使細(xì)胞破碎。 超聲波破碎是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。 超聲波破碎的有效能量利用率極低，操作過程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進(jìn)行。由于對冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，主要用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎。,化學(xué)法,化學(xué)試劑溶解細(xì)胞或抽提某些細(xì)胞組分。 堿處理：溶解除細(xì)胞壁外的大部分組分。 脂溶性有機(jī)溶劑：溶解細(xì)胞膜上脂類化合物。如丁醇、丙酮、

19、氯仿等。 表面活性劑（兩性化合物）：細(xì)胞溶解或使某些組分從細(xì)胞中滲透出來。如SDS等。,化學(xué)法對產(chǎn)物的釋出選擇性好，細(xì)胞外形較完整，碎片少，核酸等胞內(nèi)雜質(zhì)釋放少，便于后步分離等優(yōu)點，故使用較多。 但該法容易引起活性物質(zhì)失活破壞，因此，根據(jù)生化物質(zhì)的穩(wěn)定性來選擇合適的化學(xué)試劑和操作條件是非常重要的。 另外，化學(xué)試劑的加入，常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難，并影響最終產(chǎn)物純度。如表面活性劑存在常會影響鹽析中蛋白質(zhì)的沉淀和疏水層析，因此必須注意除去。,化學(xué)法,酶解法,酶促反應(yīng)破壞細(xì)胞壁上的特殊化學(xué)鍵，以達(dá)到破壁的目的。 加入酶或自溶。 優(yōu)點：（1）產(chǎn)品釋放的選擇性高 （2）抽提的速率和收率高 （3）產(chǎn)品

20、的破壞最少 （4）反應(yīng)條件溫和 （5）不殘留細(xì)胞碎片,細(xì)胞外形較完整 缺點：成本高，可用固定化酶反應(yīng)使用。,酶解法,選擇適宜的酶和酶系統(tǒng)，控制特定的反應(yīng)條件，特定的生長階段。 微生物細(xì)胞，常用溶菌酶。專一分解細(xì)胞壁上的1,4糖苷鍵。 自溶：利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去。可是，改變其生長環(huán)境，可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。可采用加熱法或干燥法。 采用抑制細(xì)胞壁合成的方法。(如生物素的營養(yǎng)缺陷型),物理法（滲透壓沖擊法）,先把細(xì)胞放在高滲溶解中，使水分外滲，再

21、轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，使水分迅速滲入，細(xì)胞快速膨脹而破裂。 蛋白質(zhì)釋放量僅為菌體蛋白總量的4%7%。 是較溫和的一種破碎方法，此法對革蘭氏陽性菌不適用。,物理法（凍結(jié)融化法）,將細(xì)胞放在低溫下冷凍（-15），在室溫中融化，反復(fù)多次，使細(xì)胞壁破裂。 一方面，冷凍過程會促使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂。 另一方面，冷凍時胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。 蛋白質(zhì)釋放率僅10%左右。,干燥法,菌體干燥后，細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變化，部分菌體自溶，再用丙酮、丁醇或緩沖液等抽提。 空氣干燥：2530熱空氣吹干。常用于酵母菌。 真空干燥：常用于細(xì)菌。 冷凍干燥：不穩(wěn)定的活性物質(zhì)。,細(xì)胞破碎率的評價,細(xì)胞破碎率

22、：被破碎細(xì)胞占原始細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)。 （N0N） Y（%） 100% N0 Y：破碎率 N0:原始細(xì)胞數(shù)量 N：經(jīng)t時間操作后保留下來的未損害完整細(xì)胞數(shù)量。,直接計數(shù)法,直接對稀釋后的樣品計數(shù)。 采用平板計數(shù)或血球計數(shù)板，通過顯微鏡觀察染色細(xì)胞的數(shù)量。 平板計數(shù)所需時間長，只有活細(xì)胞才能計數(shù)。死亡的完整細(xì)胞雖量大但未能計數(shù)。 顯微鏡計數(shù)：快速而簡單，但難區(qū)分未損害細(xì)胞和稍有損害細(xì)胞。 可用涂片法染色。革蘭氏試劑染色后，完整細(xì)胞呈紅色或無色，細(xì)胞碎片呈綠色。,間接計數(shù)法,細(xì)胞破碎后，測定懸浮液中細(xì)胞釋放出來的化合物的量（如可溶性蛋白、酶等）。 將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心分離，去掉固體（完整細(xì)胞和碎

23、片），對清液進(jìn)行含量或活性分析。 最常用是蛋白質(zhì)含量，或某種酶的活性等。,常用細(xì)胞破碎方法比較表,細(xì)胞破碎方法比較,機(jī)械法：大規(guī)模處理，產(chǎn)熱大 化學(xué)法：所用溶劑不得對活性物質(zhì)產(chǎn)生損害 酶法：條件溫和，成本高 滲透壓沖擊和凍融法：破碎作用較弱 干燥法：較劇烈，易變性失活,選擇破碎方法原則,破碎細(xì)胞的目的、提取產(chǎn)物的類型、產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置、細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞壁的強(qiáng)度、產(chǎn)物對破碎條件（溫度、化學(xué)試劑、酶等）的敏感性、要達(dá)到的破碎率、破碎的速度、規(guī)模應(yīng)用、后期提取。 細(xì)胞碎片的大小 產(chǎn)物釋放率、低的能耗、便于后步提取,問題,（1）常用細(xì)胞破碎方法的原理、特點及適用性。 （2）簡述破碎方法的選擇依據(jù)。,

24、第四節(jié)發(fā)酵液的固液分離,固液分離：指將發(fā)酵液（培養(yǎng)液）中的懸浮固體，如細(xì)胞、菌體、細(xì)胞碎片以及蛋白質(zhì)等的沉淀物或它們的絮凝體分離除去。 過濾 沉降 離心,過濾,利用多孔性介質(zhì)（如濾布）截留固液懸浮液中的固體粒子。 常規(guī)過濾 錯流過濾,常規(guī)過濾,料液流動方向與過濾介質(zhì)垂直。,常規(guī)過濾,阻力：過濾介質(zhì)和濾餅，后者為主要因素。 提高速度過濾和過濾質(zhì)量。 預(yù)處理：絮凝、凝聚等 使用助濾劑,助濾劑,（1）無毒，惰性物質(zhì) （2）顆粒均勻、質(zhì)地堅硬、不可壓縮的固體顆粒。 可使濾餅具格子結(jié)構(gòu)，不可壓縮，濾孔不會被全部堵塞，保持良好滲透性。既能使發(fā)酵液中的細(xì)小顆粒截留在格子骨架上，又能使清液有流暢的溝道。 （3

25、）來源方便，成本低廉。 常用的有硅藻土、珍珠巖、纖維素、石棉等。,錯流過濾,料流流動的方向與過濾介質(zhì)平行，能清除過濾介質(zhì)表面的滯留物，使濾餅不易形成，保持較高的濾速。 過濾介質(zhì)通常為微孔膜或超濾膜。 優(yōu)點：（1）收率高（97-98%） （2）濾液質(zhì)量好 （3）減少處理步驟 （4）容易進(jìn)行擴(kuò)大生產(chǎn),板框壓濾機(jī),板框壓濾機(jī),優(yōu)點：過濾面積大，能耐受較高壓力差，適應(yīng)性強(qiáng)（對不同性質(zhì)的料液），結(jié)構(gòu)簡單，造價較低，動力消耗少 缺點：不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，占地面積大，非生產(chǎn)的輔助時間長（解框、卸餅、洗濾布、重新壓緊板框等）、勞動強(qiáng)度大，生產(chǎn)能力低。 自動板框壓濾機(jī)：能自動清除濾餅，縮短非生產(chǎn)時間，減輕了

26、勞動強(qiáng)度,真空鼓式過濾機(jī),真空鼓式過濾機(jī),優(yōu)點：連續(xù)操作，可自動控制 基本原理：真空吸濾 分四個階段：吸濾、洗滌、吸干、卸渣 壓力差較小，主要適用于菌絲較粗的真菌，對菌絲較細(xì)或黏稠的發(fā)酵液，需預(yù)鋪助濾劑。,centrigugal separation,離心分離,在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中，微生物發(fā)酵液、動植物細(xì)胞培養(yǎng)液、酶反應(yīng)液或各種提取液，常常是由固相(固形物)與液相組成的懸浮液，這種懸浮液的液-固分離是生化產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的重要操作之一，其分離方法除了前面介紹的過濾分離外，還有一種非常有效的分離方法-離心分離。 它是利用慣性離心力和物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的不同而進(jìn)行的一項分離、濃縮或提煉操作。,離心

27、分離對那些固體顆粒很小或液體粘度很大，過濾速度很慢，甚至難以過濾的懸浮液十分有效，對那些忌用助濾劑或助濾劑使用無效的懸浮液的分離，也能得到滿意的結(jié)果。 但是離心分離結(jié)果得到的是漿狀物而不是干的濾餅，而且存在離心設(shè)備復(fù)雜、價格昂貴的缺點。,離心分離不但可用于懸浮液中液體或固體的直接回收,而且可用于兩種互不相溶液體的分離,如液-液萃取，和不同密度固體或乳濁液的分離，如制備超離心技術(shù)等。,離心分離可分為以下三種形式： 離心沉降，利用固液兩相的相對密度差，在離心機(jī)無孔轉(zhuǎn)鼓或管子中進(jìn)行懸浮液的分離操作； 離心過濾，利用離心力并通過過濾介質(zhì)，在有孔轉(zhuǎn)鼓離心機(jī)中分離懸浮液的操作； 離心分離和超離心，利用不同

28、溶質(zhì)顆粒在液體中各部分分布的差異，分離不同相對密度液體的操作。,1 離心沉降1.1 離心沉降的原理,最終沉降速率與粒子直徑的平方成正比，與粒子和流體的密度差成正比，而與流體的粘度成反比；也就是說粒子的沉降速度僅僅是液體性質(zhì)及粒子本身特性的函數(shù)。,固體的沉降 離心沉降的基礎(chǔ)是固體的沉降。當(dāng)固體粒子在連續(xù)流體中沉降時，受到兩種力的作用，一種是連續(xù)流體對它的浮力，另一種是流體對運(yùn)動粒子的粘滯力。當(dāng)這兩種力達(dá)到平衡時，固體粒子將保持勻速運(yùn)動。,1.2 離心沉降設(shè)備,沉降式離心機(jī)，包括實驗室用瓶式離心機(jī)和工業(yè)用無孔轉(zhuǎn)鼓離心機(jī)，其中無孔轉(zhuǎn)鼓離心機(jī)又有管式、多室式、碟片式以及臥螺式(decanter)等幾種

29、型式，見下圖。,瓶式離心機(jī)：這是一類結(jié)構(gòu)最簡單的實驗室常用的低、中速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速一般在30006000rpm，其轉(zhuǎn)子常為外擺式或角式，操作一般在室溫下進(jìn)行，也有配備冷卻裝置的冷凍離心機(jī)。,圖 離心沉降設(shè)備類型,管式離心機(jī)：分為液-液分離的連續(xù)式管式離心機(jī)和液-固分離的間歇式管式離心機(jī)，它結(jié)構(gòu)簡單，僅是一根直管形的轉(zhuǎn)筒,其直徑較小，長度較大，轉(zhuǎn)速很高，可達(dá)到50000rpm，從而產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，除此之外它還可以冷卻，這有利于蛋白質(zhì)的分離。 操作時，懸浮液或乳濁液從管底加入，被轉(zhuǎn)筒的縱向肋板帶動與轉(zhuǎn)筒同速旋轉(zhuǎn)，上清液在頂部排出，固體粒子沉降到筒壁上形成沉渣和粘稠的漿狀物。運(yùn)轉(zhuǎn)一段時間后，當(dāng)出口液

30、體中固體含量達(dá)到規(guī)定的最高水平，澄清度不符合要求時，需停機(jī)清除沉渣后才能重新使用，因此操作是間歇式的。 管式離心機(jī)轉(zhuǎn)筒一般直徑為40150mm，長徑比為48，離心力強(qiáng)度可達(dá)1500065000，處理能力為0.10.4m3/h ，適合的固體粒子粒徑為0.01100m，固液密度差大于0.01g/cm3 ，體積濃度小于1%的難分離懸浮液，常用于微生物菌體和蛋白質(zhì)的分離等。,教材P51頁,多室式離心機(jī)：多室式離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓內(nèi)有若干同心圓筒組成若干同心環(huán)狀分離室(見圖），這樣可加長分離液體的流程，使液層減薄，以增加沉降的面積，減少沉降的距離，這同時還具有粒度篩分的作用，懸浮液中的粗顆粒沉降到靠近內(nèi)部的分離

31、室壁上，細(xì)顆粒,則沉降到靠近外部的室壁上,澄清的分離液經(jīng)溢流口或由向心泵排出。 多室離心機(jī)的出渣比較困難，一般在運(yùn)轉(zhuǎn)一段時間后，待分離液澄清度不符合要求時，停機(jī)清理。 這種離心機(jī)有3-7個分離室,離心力強(qiáng)度為20008000，處理能力為2.510m3/h 。適于處理直徑大于0.1m的顆粒，固相濃度小于5的懸浮液，常用于抗菌素液-液萃取分離，果汁和酒類飲料的澄清等。,圖 多室式離心機(jī)的構(gòu)造,碟片式離心機(jī)：這是一種應(yīng)用最為廣泛的離心機(jī)，它有一密封的轉(zhuǎn)鼓，內(nèi)裝十至上百個錐頂角為60100o 錐形碟片，懸浮液由中心進(jìn)料管進(jìn)入轉(zhuǎn)鼓，從碟片外緣進(jìn)入碟片間隙向碟片內(nèi)緣流動，由于碟片間隙很小，形成薄層分離固體

32、顆粒的沉降距離極短，分離效果較好。顆粒沉降到碟片內(nèi)表面上后向碟片外緣滑動，最后沉積到鼓壁上。已澄清的液體經(jīng)溢流口或由向心泵排出。 碟片式離心機(jī)的離心力強(qiáng)度可達(dá)300010000，由于碟片較多并且間隙小，從而增大了沉降面積，縮短了沉降距離，所以分離效果較好。碟片間距離一般為0.52.5mm，與被處理物料的性質(zhì)有關(guān)。錐頂角的大小應(yīng)大于固體顆粒與碟片表面的錐頂角。 根據(jù)卸渣方式，碟片離心機(jī)又可分為下面幾種類型。a人工排渣的碟片離心機(jī)；b噴嘴排渣碟片式離心機(jī)；c.活門(活塞）排渣碟片式離心機(jī)；d.活門排渣的噴嘴碟片式離心機(jī)。,見教材P51頁,圖3 碟式分離機(jī)轉(zhuǎn)鼓及物料流動示意圖,圖4 噴嘴排渣碟式離心

33、機(jī),圖5 環(huán)閥(活塞)排渣碟式分離機(jī)示意因,SGZ型三足式刮刀卸料自動離心機(jī),螺旋卸料沉降離心機(jī)：螺旋卸料沉降離心機(jī)有立式和臥式兩種，后者又稱臥螺機(jī)，是用得較多的形式，如圖6,圖6 臥式和立式螺旋卸料沉降離心機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖：(a)臥式；(b)立式 1進(jìn)料管；2三角皮帶輪；3右軸承；4螺旋輸送器；5進(jìn)料空；6機(jī)殼；7轉(zhuǎn)鼓；8左軸承；9行星差速器；10過載保護(hù)裝置；11溢流孔；12排渣孔,臥式螺旋離心機(jī),并流離心機(jī),逆流離心機(jī),臥式螺旋卸料沉降離心機(jī),2 離心過濾,2.1 離心過濾的原理,離心過濾是將料液送入有孔的轉(zhuǎn)鼓并利用離心力場進(jìn)行過濾的過程，以離心力為推動力完成過濾作業(yè)，兼有離心和過濾的雙重作

34、用，其工作原理如圖所示。從圖可知，過濾面積和離心力隨半徑的增大而增大。,離心過濾工作原理圖,利用離心力代替壓力差作為過濾推動力。 轉(zhuǎn)鼓壁上有均勻密集的小孔，覆蓋過濾介質(zhì)（濾布）。,以間歇離心過濾為例，料液首先進(jìn)人裝有過濾介質(zhì)(濾網(wǎng)或有孔套筒)的轉(zhuǎn)鼓中，然后被加速到轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)速度，形成附著在鼓壁上的液環(huán)，與沉降式離心機(jī)一樣，粒子受離心力而沉積，過濾介質(zhì)則阻止粒子的通過，形成濾餅。 當(dāng)懸浮液的固體粒子沉積時，濾餅表面生成了澄清液，該澄清液透過濾餅層和過濾介質(zhì)向外排出，在過濾后期，由于施加在濾餅上的部分載荷的作用，相互接觸的固體粒子經(jīng)接觸面?zhèn)鬟f粒子應(yīng)力，濾餅開始壓縮。 所以離心過濾一般分濾餅形成、濾餅

35、的壓緊和濾餅壓干三個階段，但是根據(jù)物料性質(zhì)的不同，有時可能只需進(jìn)行一個或兩個階段。,2.2 離心過濾的設(shè)備,離心過濾機(jī)設(shè)有一個開孔轉(zhuǎn)鼓，可以分離固體密度大于或小于液體密度的懸浮液。它可分連續(xù)式和間歇式。 間歇式離心機(jī)通常在減速的情況下由刮刀卸料，或停機(jī)抽出轉(zhuǎn)鼓套筒或濾布進(jìn)行卸料。連續(xù)式離心機(jī)則用活塞推料和振動卸料兩種方法： 活塞推料離心機(jī)借助活塞的往復(fù)運(yùn)動帶動推料盤而進(jìn)行脈動卸料，另有多級活塞推料離心機(jī)，它是活塞推料離心機(jī)的改進(jìn)型式，其網(wǎng)孔轉(zhuǎn)鼓為多級階梯結(jié)構(gòu)， 振動卸料離心機(jī)為立式結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)孔轉(zhuǎn)鼓為錐形，物料由小端進(jìn)入，轉(zhuǎn)鼓的軸向振動和固體粒子的重力產(chǎn)生指向大端方向的總推動力，該推動力克服了輪

36、子與轉(zhuǎn)鼓間的摩擦力，使粒子從轉(zhuǎn)鼓小端穆向大端，達(dá)到卸料的目的。,還有一種連續(xù)沉降過濾式螺旋卸料離心機(jī)，它集連續(xù)沉降離心機(jī)和連續(xù)過濾式離心機(jī)于一體，在連續(xù)沉降式離心機(jī)的錐部小端至卸渣口設(shè)置一個柱形網(wǎng)孔轉(zhuǎn)鼓段，液體借助于粒子的沉降而澄清，粒子則借助于壓縮和錐部排沉而脫水，但最終脫水和洗滌在網(wǎng)鼓段進(jìn)行。,臥式螺旋卸料過濾離心機(jī),LWL型離心機(jī)內(nèi)部結(jié)構(gòu)及工作原理圖,臥式螺旋沉降離心機(jī)(臥式螺旋卸料沉降離心過濾),3 超離心法,根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量和形狀不同，應(yīng)用強(qiáng)大的離心力，將混合物中各組分分離、濃縮、提純的方法稱為超離心法。 它在生物化學(xué)、分子生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展中起著非常重要的作用。應(yīng)用

37、超離心技術(shù)中的差速離心、等密度梯度離心等方法，已經(jīng)成功的分離制取各種亞細(xì)胞物質(zhì)、如線粒體、微粒體、溶酶體、腫瘤病毒等。用5105g以上的強(qiáng)大離心力，長時間的離心(如17h以上)，可獲得具有生物活性的脫氧核糖核酸(DNA)、各種與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的酶系、各種信使核糖核酸(mRNA)和轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)等，這為遺傳工程、酶工程的發(fā)展提供了必需基礎(chǔ)。 超離心法是現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域研究中不可缺少的實驗室分析和制備手段。,超離心,根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量和形狀的不同，應(yīng)用強(qiáng)大的離心力，將混合物中的各組分分離、濃縮、提純的方法。 各種細(xì)胞器的分離提取，如線粒體、溶酶體等，各種蛋白質(zhì)、核酸的提取等。 沉降

38、速度的不同，而將各組分分離。 制備性超離心 分析性超離心,3.2 超離心技術(shù)的分類,3.2.1 制備性超離心,制備性超離心的主要目的是最大限度地從樣品中分離高純度目標(biāo)組分，進(jìn)行深入的生物化學(xué)研究。 它可以分離量非常大的物質(zhì)，例如從成批的或連續(xù)的培養(yǎng)液中收集微生物細(xì)胞，從組織培養(yǎng)液中得到動植物細(xì)胞以及從血液中分離血漿；也可以從已通過某些預(yù)純化的制劑中分離像蛋白質(zhì)那樣的大分子。 制備性超離心分離和純化生物樣品一船用四種方法：差速離心法、一般密度梯度離心法、等密度梯度離心法及平衡等密度梯度離心法。,差速離心法,粒子差速離心(Differential Pelleting) 粒子差速離心法，簡稱差速離心

39、法逐漸增加離心速度或交替使用低速和高速進(jìn)行離心，用不同的離心力使具有不同質(zhì)量的物質(zhì)分級分離的方法。 如取均勻懸浮液，控制離心力及時間進(jìn)行離心，使最大的粒子先沉降，而上清液中不再含有這種粒子，取出上清液，增加離心力再分離較小的粒子，如此逐級分離。,該法的缺點是每次沉降的沉淀粒子不是均一的，在等離心力下除了大粒子都沉淀以外，部分中粒子及少部分小粒子也可能沉淀下來，且數(shù)目隨著離心時間的延長而增加，故不容易得到粒度均勻的粒子需要將沉淀重新懸浮、洗滌、再次離心，反復(fù)數(shù)次，才有較好的效果。 差速離心一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的粒子，如常用于細(xì)胞勻漿中細(xì)胞器的分離,一般密度梯度離心法,一般密度梯度離心法(

40、Density gradient centrifugation 或稱Rate-Zonal centrifugation) 也稱分級區(qū)帶離心,它是把樣品鋪放在一個連續(xù)的液體密度梯度上（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等）， 然后進(jìn)行離心，并控制離心分離的時間，使得粒子完全沉降之前，在液體梯度中移動而形成不連續(xù)分離區(qū)帶。 該法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的粒子，與粒子密度無關(guān)。因此大小相同，密度不同的粒子(如線粒體、溶酶體和過氧化物酶體)不能用此法分離。這種方法已用于RNADNA混合物、核蛋白體亞單位和其他細(xì)胞成分的分離。,等密度離心法(Isopycnic Centrifugation ) 當(dāng)不同粒子

41、存在密度差時，在離心力場作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移動到與它們密度恰好相等的位置上(即等密度點)并形成區(qū)帶，此即等密度離心法。 位于等密度點上的粒子沒有運(yùn)動，區(qū)帶的形狀和位置都不受離心時間的影內(nèi)，體系處于動態(tài)平衡。等密度離心的有效分離僅取決于粒子的密度差。密度差越大，分離效果越好，與粒子的大小和形狀無關(guān)，但是此二者決定著達(dá)到平衡的速度、時間和區(qū)帶寬度。 根據(jù)梯度產(chǎn)生的方式，可分為預(yù)形成梯度（Preformed gradient）和自形成梯度（Self-formed gradient）的等密度離心，后者又稱平衡等密度梯度離心。,等密度離心法,預(yù)形成梯度等密度離心：本法需要事先制備密度梯度，常用的梯度介質(zhì)主要是非離子型的化合物(如蔗糖、甘油等)。離心時把樣品鋪放在梯度介質(zhì)的液面上，這個密度包括了所需要研究的密度范圍，直到粒子的漂浮