第十章核酸的生物合成

1、第十章 核酸的生物合成,1944年，Avery等人的實驗證明DNA為遺傳物質 Watson&Crick的雙螺旋模型展示了一種可能的方式半保留復制 。,遺傳物質的基本特征是能進行復制,半保留復制（semiconservative replication） ：在DNA復制時，親代DNA的雙螺旋先行解旋和分開，然后以每條鏈為模板，按照堿基配對原則，在這兩條鏈上各形成一條互補鏈。這樣，從親代DNA的分子可以精確地復制成2個子代DNA分子。每個子代DNA分子中，有一條鏈是從親代DNA來的，另一條則是新形成的。,DNA的生物合成機制半保留復制,1957年Meselson及Stahl通過實驗證實了半保留復制

2、的模式。,半保留復制的實驗證據,1963年，Cairns用放射自顯影的方式觀察到大腸桿菌正在復制中的DNA，在用氚標記的胸苷復制近兩代，放射自顯影，未復制部分銀密度低，由一條放射鏈和一條非放射鏈組成；已復制部分有一條雙鏈是放射的，一條雙鏈有一半是放射的。這證明大腸桿菌DNA是環(huán)狀分子，以半保留方式復制。,半保留復制的實驗證據,1956年，ArthurKornberg首先從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶（DNA聚合酶） 。 7071年分離出和。 1999年發(fā)現(xiàn)、，涉及錯誤傾向修復,DNA聚合酶及其發(fā)現(xiàn),以四種dNTP為底物 需要模板指導 需要有引物3-羥基存在 DNA鏈的生長方向是53 產物DNA的

3、性質與模板相同,DNA聚合酶的反應特點,大腸桿菌DNA聚合酶,小片段/323aa,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段/ 604aa,53聚合/ 5 核酸外切,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段,真核生物DNA聚合酶,有、（線粒體）、五種 核DNA的復制主要由、完成；最初認為相當于聚合酶，現(xiàn)認為主要用于引發(fā)（因為無校正功能，僅其有引發(fā)功能）；能持續(xù)合成，且有校正功能。 相當于，主要起修復作用，位于線粒體，為修復酶。,DNA連接酶,DNA連接酶,使雙鏈DNA切口處的5-磷酸和3-羥基生成磷酸二酯鍵。 需供能，細菌用NAD，動物和噬菌體用ATP，形成焦磷酸鍵的活化形式，再

4、由3羥基發(fā)動親核攻擊，形成磷酸二酯鍵。 大腸桿菌的連接酶作用于粘末端，T4的還可作用于平末端。,DNA的合成是以四種三磷酸脫氧核糖核苷為底物的聚合反應，該過程除了需要酶的催化之外，還需要適量的DNA為模板，RNA（或DNA）為引物和鎂離子的參與。 催化這個反應的酶也有多種，除DNA聚合酶外，還有RNA引物合成酶（即引發(fā)酶），DNA連接酶、拓撲異構酶、解螺旋酶及單鏈結合蛋白多種蛋白質因子參與。,DNA復制有關的酶及相關蛋白因子,DNA的復制拓撲異構酶,拓撲異構酶:切斷DNA雙鏈中一股鏈，封閉切口，反應不需ATP。 拓撲異構酶:切斷DNA分子兩股鏈，利用ATP供能，連接斷端。,DNA的復制過程復制

5、的起始,復制的起始點：從DNA分子的特定部位開始，此特定部位稱為復制起始點（origin of replication），可以用ori表示。 原核生物常只有一個起始點，E.Coli的起點為Ori C，由245個bp組成（p421），非常保守。真核生物的染色體有多個復制起始點。）,DNA甲基化與DNA復制起始密切相關,DNA子鏈被合成后，起點處子鏈GATC（11個）較長時間保持未甲基化。 半甲基化的oriC與細胞原生質膜相結合。只有當oriC被從膜上釋放出來，子鏈被Dam甲基化后，才能有效地與DnaA蛋白結合，起始新一輪的DNA復制。,DNA拓撲異構酶在復制起始部位將DNA引入負超螺旋。 Dna

6、A蛋白辨認、結合于起始位點，并促使解鏈。 DnaB與DnaC復合物進入，生成引發(fā)前體，然后DnaB繼續(xù)發(fā)揮解鏈的作用。 SSB與解開的單鏈結合，穩(wěn)定和保護單鏈。 引物酶(DnaG)進入并與引發(fā)前體結合生成引發(fā)體（ DnaB、 DnaC 蛋白、引物酶和DNA起始區(qū)）。 引發(fā)體中的引物酶催化NTP聚合，生成引物。 DNA拓撲異構酶(型為主)在解鏈前方理順DNA鏈，松弛正超螺旋。,原核生物DNA復制的起始,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓撲異構酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,復制的引發(fā)形成引發(fā)體和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。,D

7、NA的復制起始過程說明,復制的方向：一般為雙向復制。 合成的開始與甲基化有關，由甲基化酶Dnm完成 起始相關蛋白，Dna A、Dna B、Dna C、Dna G等 復制時需要解螺旋酶和拓撲異構酶來解鏈的。 單鏈結合蛋白(SSB)可與解開的單鏈結合，防止復性和水解 復制有一些特殊方式。,復制叉、滯后鏈、岡崎片段與不連續(xù)復制,復制叉由5向3方向連續(xù)復制，稱為前導鏈；另一條鏈復制叉由3向5移動，稱為滯后鏈。 滯后鏈的復制中，形成許多不連續(xù)片段，稱為岡崎(Okazaki ) 片段。 岡崎片段連接成完整的DNA 引物合成酶由5向3方向合成RNA引物 聚合酶在引物3-羥基上合成DNA 聚合酶切除引物，填補

8、空白 DNA連接酶將岡崎片段連接起來,DNA的復制過程：半保留的半不連續(xù)復制,其他DNA復制模式,滾環(huán)復制 D環(huán)復制（線粒體DNA),端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn),30年代，Muller等發(fā)現(xiàn)對保持染色體穩(wěn)定十分重要的染色體末端結構端粒。 1972年James Watson提出復制末端問題。 1984年，Blackburn發(fā)現(xiàn)草履蟲（無限增殖）具有重建端粒的酶端粒酶。,端粒,端粒 是真核生物線性染色體的兩個末端所具有的特殊結構, 其由許多成串的短的重復序列組成。 功能：維持染色體的穩(wěn)定性； 保證染色體末端DNA復制的完整性,端粒酶(telomerase),端粒酶由RNA和蛋白質組成。兼有模板和逆轉錄酶兩

9、方面的作用 多莉與細胞的死亡,爬行模型動畫演示,PCR多聚酶鏈式反應,聚合鏈式反應（Polymerase Chain Reaction），K. Mullis 1985年發(fā)明。 是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，又稱為基因的體外擴增法。 PCR技術的原理與細胞內發(fā)生的DNA復制過程十分類似。 1993年獲得諾貝爾獎,PCR主要包括三個階段,變性 DNA在高溫94變性，形成兩條單鏈。 退火 反應體系降溫至50-60，模板DNA與引物結合。 延伸 反應體系升溫至72，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的指導下，復制出互補的DNA。,一種PCR反應體系,10擴增緩沖液 10ul

10、4種dNTP混合物 各200mol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100l,94 ，預變性5分鐘 94 ，變性1分鐘 55 ，退火1分鐘 72 ，延伸1分鐘 最后一次72 ，延伸5分鐘 30個循環(huán),一種PCR反應程序設計,生物因素、物化因素均可導致DNA的損傷,1.物理因素 紫外線、電離輻射、X-射線等 2.化學因素 烷化劑、堿基或核苷類似物、亞硝酸鹽及亞硝 胺、代謝活化化合物（苯并笓、黃曲霉毒素等） 以上物理及化學因素統(tǒng)稱誘變劑。 3.生物因素 DNA、RNA腫瘤病毒可插入基因組，引起突變

11、。 復制時的堿基錯配，互變異構、堿基脫氨、堿基丟失。,DNA的損傷修復,主要有五種修復系統(tǒng)： 錯配復活（mismatch repair) 直接修復（direct repair) 切除修復（excision repair） 重組修復（recombination repair） 易錯修復（error-prone repair）,錯配復活 (Mismatch Repair),原核細胞內存在Dam甲基化酶，能使5GATC中A的N6位甲基化。 復制后DNA在短期內（數(shù)分鐘）為半甲基化的GATC序列。 細胞錯配系統(tǒng)能區(qū)別新鏈與舊鏈。 MutS二聚體與其識別結合，兩向移動形成突環(huán)至GATC。 核酸內切酶（M

12、utH）從未甲基化的GATC5端開切，重新合成（DNA聚合酶）,直接修復（Direct Repair),光復活酶可被可見光激活，分解UV照射形成的嘧啶二聚體。 O6-甲基鳥嘌呤甲基轉移酶能去除O6上的甲基，恢復正常的鳥嘌呤。,O6-甲基鳥嘌呤甲基轉移酶去除O6上的甲基,切除修復（Excision Repair）,是細胞內最重要和有效的修復機制，主要由DNA-pol和連接酶完成。 多種特異的核酸內切酶，識別DNA損傷部位，在其附近將DNA單鏈切開，再由外切酶將損傷鏈切除，由聚合酶以完整鏈為模板進行修復合成，最后有連接酶封口。,重組修復稀釋錯誤,此過程也叫復制后修復。 重組修復中原損傷沒有除去，若

13、干代后可逐漸稀釋。 所需要的酶包括與重組及修復合成有關的酶。,易錯修復（Error-Prone Repair）,SOS反應：是細胞DNA受到損傷或復制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現(xiàn)的應急效應。 紫外線照射過的E.Coli較未照射過的E.Coli，接受紫外線照射過的噬菌體感染時存活率高。 SOS反應誘導的修復系統(tǒng)包括避免差錯修復(error free repair)和易產生差錯修復.,逆轉錄（Reverse Transcription),以RNA為模板, 指導DNA合成的過程稱為逆轉錄，由逆轉錄酶催化進行。 1964年Temin提出前病毒假設。 1970年Temin和Baltimor

14、e同時分別從(雞)勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致癌RNA病毒中分離出反轉錄酶 1975年，二人獲得諾貝爾獎,逆轉錄病毒的復制,逆轉錄酶的酶學性質,逆轉錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性： RNA指導的DNA聚合酶活性 DNA指導的DNA聚合酶活性 核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA。,轉錄（ transcription ）,生物體以DNA為模板合成RNA的過程,不對稱轉錄：DNA片段轉錄時，雙鏈DNA中只有一條鏈作為轉錄的模板。 原料：四種NTP 合成過程:無需引物，連續(xù)，方向：53從頭合成,不對稱轉錄,指導RNA合成的DNA鏈為模板鏈（負鏈，反意鏈），另一條DNA

15、鏈為編碼鏈（正鏈，有意義鏈） DNA鏈上只有部分的區(qū)段作為轉錄模板，且模板鏈并非自始至終位于同一股DNA單鏈上,1960年發(fā)現(xiàn)。 全酶：2，其中2為核心酶，因子識別轉錄起始位點。 5 3聚合活性，無外切酶活性 合成起始不需引物,RNA聚合酶（E.coli）,原核生物的轉錄起始,起始包括對雙鏈DNA特定部位的識別、局部（17bp）解鏈以及在最初兩個核苷酸間形成磷酸二酯鍵。 第一個核苷酸摻入的位置稱為轉錄起點。 識別起始位點，RNApol全酶解開雙鏈DNA1020bp形成轉錄空泡。 在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應，形成轉錄起始復合物。,E.coli的啟動子(promoter),啟動子：RN

16、A聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列。 足跡法和DNA測序確定啟動子序列結構。,原核生物啟動子結構,35序列，提供RNA聚合酶識別的信號，pribnow box，有助于局部解鏈,原核生物轉錄的延伸過程,因子脫落，核心酶變構，與模板鏈結合變松，沿 DNA滑動。 轉錄泡隨核心酶滑動而移動，生成的RNA與DNA模板形成約12bp雜化雙鏈，過長的RNA脫離模板鏈，伸出轉錄泡外,原核生物轉錄的終止,提供終止信號的 DNA序列，稱為終止子 核心酶識別終止信號，停止轉錄。 兩類終止子：依賴和不依賴因子的終止子,順式作用元件（cis-acting element ）,是指那些與結構基因表達調控相關、能

17、夠被基因調控蛋白特異性識別和結合的特異DNA序列。 包括啟動子、上游啟動子元件、增強子（又稱遠上游信號）、加尾信號和一些反應元件等。 存在于基因旁側序列中能影響基因表達的序列，順式作用元件本身不編碼任何蛋白質。,反式作用因子（trans-acting factor ）,參與基因表達調控的因子, 通過與特異的靶基因的順式元件結合起作用。 轉錄因子:與轉錄有關的反式作用因子 反式作用因子對基因表達的調控可正(激話)可負(阻遏) 。,真核生物RNA聚合酶,真核生物轉錄啟動,啟動子有3類，分別由、三種酶進行轉錄。 啟動子由轉錄因子而非RNA聚合酶識別。、的啟動子種類有限，識別所需輔助因子也較少。 酶復

18、雜：基本上由各種順式作用元件組合而成，其分布在轉錄起點上游約200bp的范圍內。,類別啟動子,涉及眾多編碼蛋白質的基因的表達。 包括：基本啟動子、起始子、上游元件、應答元件。 基本啟動子：TATA（Goldberg-Hogness)Box 基本啟動子是RNA聚合酶和通用因子形成前起始復合物的主要裝配點。,起始子,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增強子,轉錄起始前的上游區(qū)段,AATAAA,切離加尾,修飾點,外顯子,翻譯起始點,內含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚體,轉錄起始點,TFF,RNA聚合酶的轉錄前起始復合物 （PIC）,H,E,TFD-A-B-DNA復合物,A,B,TBP

19、,TAF,TATA,H,E,PIC組裝完成，TFH使CTD磷酸化,真核生物轉錄終止,mRNA3端轉錄出AAUAAA及富GU序列后，被切斷，游離的mRNA戴帽、加尾。,在轉錄中新合成的RNA往往是較大的前體分子，需要經過進一步的加工修飾，才轉變?yōu)榫哂猩飳W活性的、成熟的RNA分子，這一過程稱為轉錄后加工。主要包括剪接、剪切和化學修飾。,轉錄后加工,真核mRNA生物轉錄后加工,5端加帽子 3端加尾 內部甲基化 RNA的拼接（splicing）,hnRNA（ 核內不均一RNA）: mRNA前體經加工修飾后成為成熟的mRNA。,5端加帽子結構,（核內） 5末端加帽生成m7GpppG,3端加polyA尾,為mRNA的一個特怔，A的數(shù)量為20200 b Poly A 不是由DNA編碼，而是mRNA合成后由RNA末端腺苷酸轉移酶催化下加上去。,甲基化修飾,甲基化發(fā)生