硝酸纖維素膜質(zhì)地較脆.ppt

1、生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn) Comprehensive experiments of biotechnology,主要內(nèi)容 Contents： 一、課程簡(jiǎn)介 核酸的分離與純化 Isolation and Purification of Nucleic Acid 二、電泳技術(shù) Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS-PAGE 三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) Polymerase Chain Reaction 四、DNA序列測(cè)定 DNA Sequencing 五、分子雜交技術(shù) Molecular Hybridization Southern,Northern and Western

2、Blot 六、基因文庫和cDNA文庫的構(gòu)建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因的克隆與表達(dá) Heterogenic Gene Cloning and Expression 八、蛋白質(zhì)的分離、純化技術(shù) Isolation and Purification of Protein,核酸分子雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的基本技術(shù)方法之一。 雜交是指親源關(guān)系相近的不同來源的DNA單鏈或DNA單鏈與RNA單鏈之間通過堿基互補(bǔ)形成雜交分子的過程。 其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下(適宜的溫度及離子強(qiáng)度等)可按堿基

3、互補(bǔ)原則退火形成雙鏈。此雜交過程是高度特異性的。,Part 5 分子雜交 Molecular Hybridization (DNA,RNA 非特異性地吸附蛋白質(zhì)的作用較弱，因此特別適合于那些涉及蛋白質(zhì)作用(如抗體和酶等)的非放射性標(biāo)記探針的雜交體系。,因?yàn)橄跛崂w維素膜是依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA的，這種結(jié)合并不十分牢固，隨著雜交及洗膜的進(jìn)程，DNA會(huì)慢慢脫離硝酸纖維素膜，特別是高溫情況下，從而使雜交效率下降。因此不太適宜于在同一膜上重復(fù)進(jìn)行雜交。再者，硝酸纖維素膜質(zhì)地較脆，特別是經(jīng)烘烤后，操作不方便，須特別小心。,缺點(diǎn)：,(2)尼龍膜(nylonmembrane)： 尼龍膜是目前較理想的一種

4、核酸固相支持物，它有多種類型，除網(wǎng)眼大小不一樣外，有的尼龍膜未經(jīng)特殊處理，有些則是經(jīng)過了正電荷基團(tuán)的修飾。這種修飾的尼龍膜結(jié)合核酸的能力更強(qiáng)。,結(jié)合核酸的能力強(qiáng)，對(duì)于小分子量DNA片段(特別是200bp的DNA片段)現(xiàn)在更多的人傾向于使用尼龍膜。 尼龍膜可重復(fù)用于雜交，一次雜交后，探針分子可經(jīng)堿變性而被洗脫下來，從而可用于與第二探針進(jìn)行雜交。 缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底較高，可以用加大預(yù)雜交液中的非特異性封閉試劑的方法克服。,優(yōu)點(diǎn)：,(3)化學(xué)活化膜(chemical activated paper)：將濾紙用一定的化學(xué)物質(zhì)處理后即形成化學(xué)活化膜(如ABM和APT纖維素膜)。,優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價(jià)結(jié)合

5、，因此反復(fù)多次使用不會(huì)有太多的損耗；對(duì)不同大小的核酸片段都具有同等的結(jié)合能力，這是硝酸纖維素膜及尼龍膜都不具備的。 但其結(jié)合能力一般較硝酸纖維素膜要低，活化過程較復(fù)雜，因此較少為人們所使用。,1.2 印跡方法,印跡的方法有多種： 可直接將核酸樣品點(diǎn)樣于固相支持物上，稱為斑點(diǎn)或狹縫印跡法； 利用毛細(xì)管虹吸作用由轉(zhuǎn)移緩沖液帶動(dòng)核酸分子轉(zhuǎn)移到固相支持物上； 利用電場(chǎng)作用的電轉(zhuǎn)法； 利用真空抽濾作用的真空轉(zhuǎn)移法。,Southern印跡法是指將電泳分離的DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。 Northern印跡法則是指將電泳分離的RNA 從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。,根據(jù)待檢測(cè)的核酸類型不同，

6、分為Southern印跡法和Northern印跡法。,1.3 固-液相雜交技術(shù),在固相雜交中，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測(cè)和能防止靶DNA自我復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，所以比較常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。,1.3 固-液相雜交技術(shù),（2）雜交體系的建立,（1）基本原理,雙鏈DNA在一定的條件下(適宜的溫度及離子強(qiáng)度等)變性，具有一定同源性的兩條核酸單鏈可按堿基互補(bǔ)原則退火復(fù)性形成雙鏈的過程。,（1）離子強(qiáng)度：一般雜交體系中離子強(qiáng)度為5或6SSC(1xSSC為0.15mol/L NaCI和0.0

7、15mol/L 檸檬酸鈉)。 （2）DNA濃度：DNA濃度愈高，復(fù)性速度愈快。為保證足夠的DNA濃度，除應(yīng)加入足夠的DNA量外，還應(yīng)盡量減少雜交體積，一般以每平方厘米濾膜面積加50-100l雜交液為宜。,建立雜交體系應(yīng)考慮到以下幾個(gè)因素：,（3）DNA探針的長度：探針片段越大，其擴(kuò)散的速度越慢，因此復(fù)性的速度越慢。 （4）溫度：選擇適當(dāng)?shù)碾s交和洗膜溫度是核酸分子雜交成敗最關(guān)鍵的因素之一。通常雜交反應(yīng)在低于Tm值15-25溫度下進(jìn)行。Tm值除受(G+C)含量影響外，還與雜交體系中離子的強(qiáng)度，探針的復(fù)雜性(長度)、是否含甲酰胺及錯(cuò)配率等多種因素影響。準(zhǔn)確確定Tm值是比較困難的，也無必要。,Tm=8

8、1.5+16.6lgM+0.4l(G+C)-500/n-0.61(甲酰胺) 其中M為Na+摩爾濃度，n為探針的復(fù)雜性（沒有重復(fù)序列時(shí)，復(fù)雜性即為探針的長度，單位為bp）。,以下經(jīng)驗(yàn)公式對(duì)于幫助判斷Tm值很有用處：,預(yù)雜交 雜交 洗膜 雜交信號(hào)檢測(cè),（3）操作步驟,放射自顯影：利用放射線在X線片上的成影作用來檢測(cè)雜交信號(hào)，稱為放射自顯影。,1.4 液相雜交技術(shù) 液相雜交是一種研究最早且操作簡(jiǎn)便的雜交類型，由于液相雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高，所以不如固相雜交那樣普遍。,1.5 原位雜交技術(shù),（一）固相膜核酸分子雜交方法。,固相核酸雜交多是在膜上進(jìn)行，因此，以下主要介紹固相

9、膜的核酸分子雜交方法。 1DNA的變性解鏈?zhǔn)请s交成功的關(guān)鍵,Southern印跡雜交時(shí)DNA在凝膠中變性,變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/LNaCl和0.5mol/L NaOH中1小時(shí)，然后用數(shù)倍體積的1mol/L Tris-HCl（pH8.0）和1.5mol/L NaCl溶液中和1小時(shí)。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強(qiáng)酸會(huì)使核酸降解。堿變性可避免DNA的降解.,2.變性DNA的轉(zhuǎn)膜,變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定。硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45um）先在蒸餾水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min2h，涼干，DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后再在

10、80真空干燥2h。,3預(yù)雜交。濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米膜加0.2ml預(yù)熱至60的預(yù)雜交液（6SSC，0.5%SDS，5Denhardt液，100g/ml鮭魚精DNA）。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調(diào)濃度至10g/ml，用前放100水溶液中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，用封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68水浴中保溫3-12h，當(dāng)預(yù)雜交液溫度升至68時(shí)，在濾膜表面常會(huì)形成水氣泡，輕輕晃動(dòng)袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點(diǎn)對(duì)于保證濾膜表面充分浸潤預(yù)雜交液很重要。,4雜交。 從水浴中取出塑料袋，用剪刀剪開一角，盡可能擠凈預(yù)雜

11、交液，用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好足量的液體保持濾膜濕潤（50l/cm2）。溶液的組成是6SSC，0.01mol/L EDTA，變性的標(biāo)記核酸探針，5Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴(yán)密封口。雜交反應(yīng)在68水浴中進(jìn)行，所需時(shí)間視探針和檢測(cè)靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定，一般為4-20 h。,5洗膜。取出塑料袋，用剪刀剪開，小心取出濾膜，立即浸入盛有2SSC和0.5% SDS溶液的盤中,室溫下漂洗5min,再將濾膜移入2SSC和0.1% SDS中,室溫下洗滌15分鐘(輕輕搖動(dòng)),然后將濾膜移入0.1%SSC和0.

12、5%SDS溶液中,68輕輕搖動(dòng)保溫2h，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。 洗脫的溫度一般應(yīng)控制在Tm值12以下，Tm=69.3+0.41(G+C)%，雙鏈DNA的Tm值隨錯(cuò)配堿基對(duì)數(shù)每增加1%而遞減1。,6結(jié)果顯示。放射性測(cè)定方法，固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式，一是放射自顯影法、另一是液閃計(jì)數(shù)法，放射自顯影法比較簡(jiǎn)單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中暴光數(shù)小時(shí)至數(shù)天，再顯影，定影即可。對(duì)于雜交信號(hào)較強(qiáng)的固相膜，用一塊增敏屏可顯著增強(qiáng)暴光強(qiáng)度。此外，為了減弱32P的放射，暴光通常在-20或- 80下進(jìn)行。,(二)固相核酸分子雜交類型,1菌落原位雜交（colony in situ hybrid

13、ization）。 是將細(xì)菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出DNA，將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)、并與主平板上的菌落對(duì)位。,實(shí)驗(yàn)步驟如下： 將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。 培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1-2mm大小的菌落。 在一塊平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體，將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙上，菌落面在上，注意防止濾膜底面存有氣泡。 5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNa

14、Cl）浸濕的濾紙上，放置10min。 將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L Tris-HCl pH8.0)浸濕的濾紙上，放置10min，重復(fù)中和一次。 將濾膜移至用2SSPE溶液浸過的濾紙上，放置10min，SSPE配成20貯備液：3.6mol/L NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。 將濾膜用濾紙吸干，80真空烘干2h。,2斑點(diǎn)雜交（Dot blot）,是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析。一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（Manif

15、old），如Minifold和、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。,（1）DNA斑點(diǎn)雜交： 先將膜在水中浸濕，再放到15SSC中。 將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點(diǎn)樣于膜上,每 個(gè)樣品一般點(diǎn)5l(210g DNA)。 將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?（2）RNA斑點(diǎn)雜交：與上法類似，每個(gè)樣品至多加10g總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶于5lDEPC水，加5l甲醛

16、/SSC緩沖液（10SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然后取5-8l點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。 （3）完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交：應(yīng)用類似檢測(cè)細(xì)菌菌落的方法，可以對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測(cè)，將整個(gè)細(xì)胞點(diǎn)到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與檢測(cè)。,3. Southern印跡雜交（Southern blot）,Southern印跡雜交的基本方法是將DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和和高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上、烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對(duì)位

17、置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著，附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確立探針互補(bǔ)的每一條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多消化產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。,（1）瓊脂糖凝膠電泳。利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消解片段（0.325kb）分離開，分離大分子DNA片段（800-12000bp）用低濃度瓊脂糖（0.7%），分離小分子片段（5001000bp）用高濃度瓊脂糖（1.0%），300-5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠。 電泳時(shí)，同時(shí)將分子量標(biāo)記物加到旁邊孔中，便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過夜，電泳完畢，

18、將膠浸到含0.5g/mlEB的TBE緩沖液中染色30min，也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在灌膠前加入膠片中，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5，曝光20-40s。,（2）硝酸纖維素膜吸印。 1將膠片切成合適大小，切去右上角作為記號(hào)。 2將膠片放進(jìn)盛有變性緩沖液（1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH）的盤中輕晃15min。 3換到中和緩沖液（1mol/L Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH）的盤中輕晃30min。 4裁一張硝酸纖維素膜、2-4張3mm濾紙和一些吸印紙（可用衛(wèi)生紙），都與膠的大小相同（硝酸纖

19、維素膜和吸印紙不能比膠大，否則易形成旁路）。先將硝酸纖維素膜浸到水中，再放入10SSC緩沖液,接觸膠和硝酸纖維素膜時(shí)都要戴手套操作。,5平盤上放一塊比膠大的平板上面鋪一張3mm濾紙,起燈蕊作用,盤中加入少量10SSC緩沖液（2.5cm厚），不能沒過平板，使3mm濾紙充分飽和。 6將膠倒扣在3mm濾紙上。 7浸濕的硝酸纖維素膜在膠上，對(duì)齊。鋪膜時(shí)從一邊逐漸放下，防止產(chǎn)生氣泡，有氣泡時(shí)，可用吸管趕出，不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。 8膜上放一張3mm濾紙，不能與膠接觸。 9上面加吸印紙及重物（500g左右）。,10通過濾紙的燈芯作用，平盤中的緩沖液就會(huì)通過膠上移，從而將DNA吸印到膜上，及時(shí)更換浸

20、濕的吸印紙，在室溫下轉(zhuǎn)印過夜。 11清除上面的東西。用鑷子將膜取出，在6SSC中洗一下。 12自然干燥，80烤2h。 13這是的膜就可進(jìn)行雜交，或室溫密封保存。,Southern Blotting,1 DNA isolation and purification,2 DNA digested by Restriction enzyme,3 Gel electrophoresis of fragments,4 Transfer to membrane,5 prehybridization,6 Hybridization with radioactive probe,7 DNA fragments

21、 are visible after autoradiography or chemiluminescence,4Northern印跡雜交（Northern blot）,這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)，RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對(duì)應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Western blot。Northern 印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是只是在進(jìn)樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因

22、為它會(huì)水解RNA的2-羥基基團(tuán)。,RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進(jìn)行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后用低鹽緩沖液洗脫，否則RNA會(huì)被洗脫。在膠中不能加EB，因?yàn)樗鼤?huì)影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合。為測(cè)定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物切下、上色、照像，樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印。標(biāo)記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5g/ml EB的0.1mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脫色，在紫外光下用一次成像相機(jī)拍照時(shí)，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過久，會(huì)使RNA信號(hào)降低。瓊脂

23、糖凝膠中分離功能完整的mRNA時(shí)，甲基氫氧化銀是一種強(qiáng)力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應(yīng)避免RNase的污染。,RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法。,試劑： 10MSE緩沖液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/LEDTA pH8.0。 5載樣緩沖液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚藍(lán)。 甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L），應(yīng)在通風(fēng)柜中操作，pH高于4.0。 20SSC； 去離子甲酰胺； 50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)； 0.1mol/L Tris，pH

24、7.5。,步驟： 140ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60，加7ml 10MSE緩沖液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。 2等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1MSE緩沖液的電泳槽。 3使RNA變性（最多20g），RNA4.5l,10MSE緩沖液2l ，甲醛3.5 l ，去離子甲酰胺10 l 。 455加熱15min，冰浴冷卻。 5加2ml5載樣緩沖液。 6上樣、同時(shí)加RNA標(biāo)記物。 760伏電泳過夜。,8取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。 9室溫下將膠浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)

25、印。 10室溫下將膠浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使膠中和。 1120SSC洗膠1h。 1220SSC中過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。 13取出硝酸纖維素膜，80真空烘烤2h。,RNA extraction and isolation,5 10g isolated RNA 260/280nm 2.0(c.f. DNA 1.8),Northern Blotting,Denaturing agarose gel electrophoresis甲醛 Formaldehyde 0.66M/2.2mM乙二醛 Glyoxal /氫氧化甲基汞Methyl Mercuric

26、Hydroxide,Heat in formamide to denature,Blot/transfer the RNA onto a membrane using salt solution,RNA transferred to nylon or nitrocellulose membrane/filter,Probe can be radiolabelled or chemiluminescent. Random priming is the usual method for generating a labelled probe,Hybridization buffer is impo

27、rtant as is stringency of washing (Rapid Hyb 1hr),Northern Blotting,Northern Blotting,Probe can be washed off the membrane which can be reprobed or multi-probed.Use a housekeeping type to probe to analyse changes Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDH三磷酸甘油醛脫氫酶), -actin, 2-microglobulin,5組織原

28、位雜交（in situ hybridization）,簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交，而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，因此原位雜交可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。例如，對(duì)致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示按規(guī)定序列的位置，對(duì)分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；與細(xì)胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。用來檢測(cè)組織、細(xì)胞或染色體上的特殊DNA序列或mRNA的表達(dá)水平。,用來檢測(cè)組織、

29、細(xì)胞或染色體上的特殊DNA序列或mRNA的表達(dá)水平。最初是使用帶放射性的DNA或RNA探針，通過放射自顯影來顯示位置。后來又發(fā)明了免疫探針法，將探針核苷酸的側(cè)鏈加以改造，探針雜交后，其側(cè)鏈可被帶有熒光標(biāo)記的抗體所識(shí)別，從而顯示出位置,用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針操作的長度以100-400nt為宜，過長則雜交率減低。最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（16-30 nt）能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長探針，因此，寡核苷酸探針和不對(duì)稱PCR標(biāo)記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交優(yōu)選探針。 探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素，也可以

30、是非放射性生物素和半抗原等，放射性同位素中，3H和35S最為常用，3H標(biāo)記的探針半衰期長，成像分辨率高，便于定位，缺點(diǎn)是能量低， 35S標(biāo)記探針活性較高，影像分辨率也較好，而32P能量過高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點(diǎn)。,原位雜交中，標(biāo)本的固定條件是影響雜交效率的重要因素。標(biāo)本組織蛋白質(zhì)的消化程度對(duì)探針進(jìn)入細(xì)胞極為重要，去除蛋白質(zhì)的方法是，用0.2mol/L HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水。原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性、穩(wěn)定性上還需進(jìn)一步完善和提高。,6 Western Blot,1 原理： 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到

31、硝酸纖維素（NC)或聚偏氟乙烯膜（PVDF)膜上，然后與能特異性識(shí)別待檢蛋白的抗體（一抗）進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識(shí)別特異性抗體的種屬特異性抗體（二抗），反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量。,2 操作過程,SDS-PAGE電泳 轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖維素膜） 封閉 一抗 洗滌 酶標(biāo)二抗反應(yīng) 洗滌 顯色或化學(xué)發(fā)光顯影,Hours 0 4 8 16,Western blot analysis of the cleavage of Ca

32、spase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control,0h 4h 8h 16h,Western Blot analysis of cytochrome C release.,Cytochrome c release from mito