《血紅蛋白的提取和分離》課件91405

1、課題3 血紅蛋白的提取和分離,血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。,一、基礎(chǔ)知識(shí):,學(xué)生活動(dòng)1:,1 、分離生物大分子的基本思路是什么？,2 、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異？,3 、本課題我們將利用血紅蛋白與雜質(zhì)蛋白哪方面的差異進(jìn)行提純？,4 、為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用人的血紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料？,5 、用什么方法分離相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì) ？,一、基礎(chǔ)知識(shí)-蛋白質(zhì)提取和分離原理,蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)：,形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬(wàn)別。,（1）原理

2、： （2）材料,大分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快； 小分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。,多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。,(一)凝膠色譜法,（3）分離過(guò)程,洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。,(一)凝膠色譜法,1、什么是凝膠？,2、什么是凝膠色譜法？,學(xué)生活動(dòng)2:,3、凝膠色譜法的原理是什么？,4、請(qǐng)用自己的話總結(jié)出凝膠色譜法分離相對(duì)分子質(zhì)量不同蛋白質(zhì)的具體過(guò)程。,1 、什么是緩沖液？,2、 緩沖液的作用是什么？,學(xué)生活動(dòng)3:,3、 緩沖液是如何配制的？你所學(xué)過(guò)的人體 血液的緩沖物質(zhì)有哪些？,4、 本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液

3、？,（二）、緩沖溶液,由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。 如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸鈉，NaH2PO4/Na2HPO4等,緩沖溶液洗脫劑 組成： 配制： 作用：,調(diào)節(jié)緩沖劑的比例，可配制不同pH的緩沖液。,抵制外界酸堿對(duì)溶液pH的干擾而保持 pH穩(wěn)定。,（二）、緩沖溶液,1 、什么是電泳？,2、 影響電泳遷移速度的因素有哪些？,學(xué)生活動(dòng)4:,4、電泳分離各種分子的原理是什么？,（三）、電泳,3、 如何消除電荷對(duì)電泳遷移速度的影響？,5 、請(qǐng)描述電泳的過(guò)程？,2凝膠電泳法：,（1）原理：,不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)

4、在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。,影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素,(三)電泳,1.電泳的概念,指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程.,影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素,在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。,（2）分離方法： （3）分離過(guò)程：,瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。,(三)電泳,二、實(shí)驗(yàn)操作,蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： （1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白釋放；離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液。 （2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。 （3）純化：通過(guò)凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)

5、蛋白質(zhì)除去。 （4）純度鑒定：通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。,（一）樣品處理,1、紅細(xì)胞的洗滌： 目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。 2、血紅蛋白的釋放： 在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放 3、分離血紅蛋白溶液： 離心分層；濾紙過(guò)濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。 4、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。,二、實(shí)驗(yàn)操作,跳轉(zhuǎn),血液組成成分,閱讀思考： 血液由_和_兩部分組成。 血細(xì)胞中_細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含量最高的有機(jī)化合物是_。,返回,1.洗 滌 紅 細(xì) 胞,閱讀思考：洗滌的目的是什么？

6、 洗滌過(guò)程：,血液 100mL,重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒(méi)有黃色,2.釋放血紅蛋白,閱讀思考： 釋放血紅蛋白過(guò)程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？ 為了加速釋放過(guò)程，采取了什么措施？,目的分析： 蒸餾水的作用是_。 加入甲苯的作用是_。 充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀。,使紅細(xì)胞大量吸水脹裂,溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜,加速紅細(xì)胞的破裂,(2)血紅蛋白的釋放：,加蒸餾水到原血液體積，再加40體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。,磁力攪拌器,返回,3.分離血紅蛋白,分離過(guò)程,紅細(xì)胞 混合液,燒杯,(3)分離血紅蛋白溶液：,過(guò)程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min。 試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）