ERCC1mRNA表達(dá)水平基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、1. 目的：規(guī)范ERCC1mRNA表達(dá)水平檢測(cè)（熒光定量PCR）操作流程，保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。2. 項(xiàng)目名稱： ERCC1mRNA表達(dá)水平檢測(cè)。檢測(cè)方法：熒光PCR。3. 方法原理：PCR方法結(jié)合熒光探針的體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)。4. 儀器：博日熒光定量PCR擴(kuò)增儀。5. 操作步驟：5.1 樣本RNA提取(樣本室)5.1.1 根據(jù)臨床標(biāo)本采集、驗(yàn)收、拒收標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程接收合格的臨床檢測(cè)樣本（同一患者的正常組織樣本和腫瘤組織樣本各一份）。5.1.2 從試劑盒中取出組織RNA提取需要用到的試劑, 室溫融化后，2000rpm離心10sec；5.1.3 參照組織樣本RNA提取標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程提取正常組織樣本和腫

2、瘤組織樣本的RNA。5.1.4 提取的RNA樣本需要在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，否則需置于-80保存。5.1.5 RNA提取后剩余的組織樣本置于-80保存，備查。5.2 樣本RNA的逆轉(zhuǎn)錄5.2.1 取出ERCC1-RT-PCR反應(yīng)液和引物，按要求稀釋溶解引物，室溫融化并振蕩混勻后，2000rpm離心10sec。5.2.2 參考根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程設(shè)計(jì)針對(duì)ERCC1基因的RT-PCR擴(kuò)增。5.2.3 根據(jù)RNA樣本數(shù)，確定RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)管數(shù)，按5.2.4表計(jì)算反應(yīng)混合液的用量，分裝入每個(gè)PCR反應(yīng)管中，振蕩混勻，2000rpm離心10sec后，49l/管；注意避免產(chǎn)生氣泡，蓋好管

3、蓋后經(jīng)傳遞倉(cāng)轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。（試劑準(zhǔn)備室）5.2.4 單管RT-PCR反應(yīng)液配制（50ul體系）： 2mRNA Selective PCR Buffer 25ul MgCl2 10ul dNTPs/analog Mixture 5ul RNA酶抑制劑 1ul 逆轉(zhuǎn)錄酶 1ul DNA聚合酶 1ul 上游引物F 1ul 下游引物R 1ul ddH2O 4ul 樣本 1ul5.2.5 加樣（樣本處理室）5.2.5.1 PCR反應(yīng)管中分別加入不同樣本提取的DNA模板各1l（在生物安全柜中進(jìn)行操作）； 5.2.5.2 應(yīng)將樣本直接加入反應(yīng)液內(nèi)，避免樣本粘附在管壁上，蓋緊管蓋充分混勻后低速離心10se

4、c，轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。5.2.6 RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)(擴(kuò)增室)5.2.6.1 將反應(yīng)管排好放入PCR擴(kuò)增儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序；5.2.6.2 反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置（參照博日PCR儀使用、維護(hù)、校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）： 50 15min 1cycle 85 1min 45 1min 25cycle 72 1min 反應(yīng)體系為50l。5.2.7 反應(yīng)結(jié)束后，取RT-PCR反應(yīng)液（510ul）進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為目標(biāo)DNA片段，-20保存。5.3 熒光定量實(shí)驗(yàn)5.3.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備室）5.3.1.1 從試劑盒中取出ERCC1熒光定量PCR反應(yīng)液、Taq酶、引物、探針，室溫融化

5、并振蕩混勻后，2000rpm離心10sec；5.3.1.2 確定檢測(cè)反應(yīng)管數(shù)為n（n樣本數(shù)4管不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品陰性對(duì)照）按5.3.1.3表計(jì)算反應(yīng)體系(40ul)各試劑的用量，加入一適當(dāng)體積離心管，充分混勻，2000rpm離心10sec后分裝入每個(gè)PCR反應(yīng)管中，38l/管；注意避免產(chǎn)生氣泡，蓋好管蓋后轉(zhuǎn)移至樣本處理室。5.3.1.3 單個(gè)檢測(cè)反應(yīng)體系配制表：ddH2O 27.2ulPCR buffer 4ul dNTPs 4ul Primer F 0.8ulPrimer R 0.8ul特異性探針 0.8ulTaq酶 0.4ul模板 2ul5.3.2 加樣（樣本處理室）5.3.2.1 將樣

6、本RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從-20取出，置室溫解凍，2000rpm離心10sec；5.3.2.2 在PCR反應(yīng)管中分別加入正常樣本RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、病變樣本RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及試劑盒中不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品2l；陰性對(duì)照管中加入2ul滅菌超純水。5.3.2.3 應(yīng)將樣本直接加入反應(yīng)液內(nèi)，避免樣本粘附在管壁上，蓋緊管蓋充分混勻后低速離心10sec，轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。5.3.3 PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增室）5.3.3.1 將PCR反應(yīng)管排好放入博日熒光定量PCR儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。5.3.3.2 設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)（參照博日熒光定量PCR儀）：循環(huán)條件設(shè)置：95：10min；95：10sec；60：40sec； （4

7、0個(gè)循環(huán)）。反應(yīng)體系為40l。儀器檢測(cè)通道選擇：熒光信號(hào)收集：Fam熒光素；收集溫度：60。（應(yīng)確嚴(yán)格保同一患者的正常樣本與病變樣本的擴(kuò)增條件一致）5.3.3.3 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果保存在設(shè)定的結(jié)果保存盤(pán)中。5.3.3.4 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，立即取出反應(yīng)管，密封在專用塑料袋中，丟棄到廢物處理室，統(tǒng)一按照醫(yī)療廢物處理?xiàng)l例處理。6. 結(jié)果分析條件設(shè)定：6.1 打開(kāi)博日熒光定量PCR儀的結(jié)果分析軟件，導(dǎo)入保存的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。6.2 使用樣點(diǎn)擬合法，進(jìn)行結(jié)果分析，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。6.3 進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)基線的確定：取310或315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)。閾值可根據(jù)儀器噪音容限來(lái)調(diào)整。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰

8、性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)；6.4 避免漏檢強(qiáng)陽(yáng)性樣本，應(yīng)首先將基線定為310個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)觀察分析Ct值，如果沒(méi)有Ct值16.0的樣本，則將基線改定為315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)進(jìn)行結(jié)果分析。熒光曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：7.1 陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性；7.2 空白對(duì)照的Ct值應(yīng)等于40.0；否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。7.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.99；否則，此次試驗(yàn)視為無(wú)效。8. 結(jié)果判斷：8.1 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)樣本的Ct值計(jì)算出樣本的底物濃度。8.2 比較標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出正常樣本與病變樣本的底物濃度，可以判斷患者病變組織樣本中的mRNA表達(dá)水平。比較結(jié)果ERCC1mRNA表達(dá)水平正常樣本濃度低于病變樣本濃度病變組織mRNA為高水平表達(dá)正常樣本濃度高于病變樣本濃度病變組織mRNA為