除菌過濾驗證—細菌截留試驗

1、技術(shù)報告No. 26 (2008 修訂版),Celebrating over 65 Years of Connecting People, Science and RegulationSM,除菌過濾器的驗證 細菌的截留 第6.0部分,液體的除菌過濾,第 6.0部分 除菌過濾器的驗證 / 細菌的截留,6.1影響微生物截留的因素 6.2細菌截留驗證研究需要考慮的方面 6.3挑戰(zhàn)細菌的選擇 6.4培養(yǎng)的保持 6.5培養(yǎng)條件和標準 6.6有效挑戰(zhàn)濃度 6.7挑戰(zhàn)水平 6.8聚集 6.9培養(yǎng)物的生存能力 6.10挑戰(zhàn)試驗方法,6.11試驗用微生物的生存能力 6.12 試驗步驟和方案 6.13非殺菌過程和

2、液體 6.14替代液體 6.15殺菌液體 6.16過濾介質(zhì)vs.裝置 6.17壓力/流量 6.18持續(xù)時間 6.19下游取樣 6.20試驗用膜的選擇 6.21結(jié)果的解釋 6.22產(chǎn)品的生物負荷 6.23過濾器構(gòu)造的改變,目 錄,除菌級性能的基本解釋,除菌過濾是在對產(chǎn)品沒有不良影響的前提下從流動的液體中去除微生物的過程。 ASTMF 838-05 是一種標準的內(nèi)置TM，可以用于比較所有滅菌級的膜。 證明能去除一種標準試驗細菌(Brevundimonas diminuta) 最低濃度為107 cfu/cm2 這是一個很好的開始，但是還要考慮其他因素,重要參考 ASTM F 838-05,ASTM

3、標準 F838-05, “決定液體過濾器過濾膜細菌截留性能的標準測試方法”, 賓州Conshohocken美國測試和材料協(xié)會 ASTM 委員會 D19(2005) ,除菌級表現(xiàn)的基本定義,2008 版 TR 26 進一步描述了過濾器驗證需要考慮的方面除菌過濾器驗證要考慮的兩個重要因素: 通過適當?shù)臉藴试囼灮蛲鹊姆椒ㄟM行細菌挑戰(zhàn)實驗來決定過濾器膜的級別。 由過濾器的使用者或指定的測試機構(gòu)（例如：過濾器生產(chǎn)商或契約實驗室） 使用一種代表性的挑戰(zhàn)微生物證明能完全去除一種產(chǎn)品或一組產(chǎn)品上的細菌。 在進行驗證試驗前，具有每組產(chǎn)品是按照適當監(jiān)管機構(gòu)的規(guī)定生產(chǎn)和檢驗的科學依據(jù)。,挑

4、戰(zhàn)微生物的選擇,以前一直推薦用 Pseudomonas diminuta 作為驗證0.22 m 除菌級過濾器的細菌之選。 Pseudomonas diminuta 最近基于DNA的相同性被重新劃分為Brevundimonas diminuta FDA并沒有統(tǒng)一推薦某種細菌用于細菌截留試驗 細菌大小應(yīng)能通過 0.45 m 過濾器 其他符合要求的細菌也能被接受,時間,影響細菌截留的因素,微生物,大小,形狀,產(chǎn)品,pH,滲透壓,離子強度,表面活性劑,膜,孔徑分布,表面化學成分,微孔結(jié)構(gòu),P,流量,溫度,Section 6/6.1,產(chǎn)品,細菌截留驗證需要考慮的方面,對過濾過程進行詳盡的評估，包括： 溶

5、劑的性質(zhì) (如：水的，酸性的，堿性的, 有機的) 過濾時間 過程壓力 過程流量 過程溫度 過濾器設(shè)計說明 簽約細菌截留試驗，三大廠家會給一個POP文件 Satorious的所有試驗都在德國，millipore的析出物試驗在美國。,Section 6.2,細菌截留驗證需要考慮的方面,產(chǎn)品細菌截留驗證研究應(yīng)該包括多個過濾膜 (通常三個) 。最接近泡點的過濾膜做這個試驗。市場流通的過濾器基本泡點都會比較高 在產(chǎn)品可能對膜造成傷害的情況下，膜的確切數(shù)量和測試設(shè)計取決于過程。,Section 6.2,細菌截留驗證需要考慮的方面,用于細菌截留驗證試驗的三個膜中至少有一個膜應(yīng)該在試驗前或使用前物理完整性測試

6、數(shù)值達到或接近過濾器生產(chǎn)商的測試要求。 可能無法獲得達到或接近過濾器生產(chǎn)商要求的膜 在這種情況下，應(yīng)該從一批使用前完整性測試數(shù)值盡量低的膜產(chǎn)品中選取測試膜。 然后根據(jù)（驗證研究中）使用前物理完整性測試數(shù)值最接近生產(chǎn)商要求的膜來確定一個特定過濾過程的完整性測試要求,Section 6.2,細菌截留驗證需要考慮的方面,測試報告中應(yīng)該包括細菌截留驗證研究中得到的膜物理完整性測試值。 應(yīng)在挑戰(zhàn)測試前使用水、產(chǎn)品或其他有說明的液體來確定物理完整性,Section 6.2,細菌截留驗證需要考慮的方面,應(yīng)該在產(chǎn)品細菌挑戰(zhàn)后調(diào)查測試微生物是否在過濾器的下游重現(xiàn)。 如果調(diào)查確認測試微生物穿過了過濾器，并且過濾器

7、達到了完整性測試要求 那么應(yīng)重新考慮該過濾器是否適合于這樣的過程條件。,Section 6.2,細菌截留驗證需要考慮的方面,成分相同、只有濃度不同的系列產(chǎn)品可以通過挑戰(zhàn)極限濃度和接受中間一組濃度來驗證。 如果某個單個產(chǎn)品被認為是最差情況代表，則應(yīng)伴有依據(jù)和數(shù)據(jù)。,Section 6.2,細菌截留驗證需要考慮的方面,一般來說重復使用過濾器是不實際的，或者說不建議用于制藥生產(chǎn) 但是如果重復使用除菌級過濾器 應(yīng)該給出理由，并且重復使用參數(shù)應(yīng)該經(jīng)過驗證。,測試設(shè)計的兩種方法,1. 直接接種法 2. 修改法 有時被稱為: 間接法 兩步法 再循環(huán)法,1. 直接注入細菌法,直接接種測試,藥品,可存活 微生物

8、?,B. Diminuta / 挑戰(zhàn)微生物,測試過濾器,泵,化驗濾出液 的微生物,2. 間接法,藥品,可存活 微生物?,化驗濾出液 的微生物,否,改變 產(chǎn)品/過程,預(yù)處理過濾器,B. Diminuta / 挑戰(zhàn)微生物,泵,測試過濾器,抗生素 防腐劑 溫度 pH,1,2,預(yù)處理,時間 溫度 化學性質(zhì),壓力 流量,使過濾器暴露于實際的產(chǎn)品和過程條件中,抑制配方 預(yù)處理注入物,1,2,沖洗緩沖器: 去除過濾器的毒殺活動,維持全部 過程條件,驗證此步驟 確保細菌活性,修改產(chǎn)品、過程的兩個例子,8 小時過程時間 殺菌產(chǎn)品,預(yù)處理8 小時,修改過的產(chǎn)品 8小時,預(yù)處理,截留測試,預(yù)處理4小時,實際的產(chǎn)品

9、4小時,沖洗,細菌截留研究的一般圖示,細菌截留研究的一般圖示,接種挑戰(zhàn)溶液的再循環(huán),研究設(shè)計決策樹,Validation Strategy Study Design,Validation Strategy Study Design,Ideal Method / Approach,Validation Strategy Study Design,Alternative Approach,Validation Strategy Study Design,挑戰(zhàn)微生物的選擇 - 1.,推薦選擇Brevundimonas diminuta 作為用于除菌級過濾器驗證的微生物。 但是: 請明白FDA或其他法

10、規(guī)機構(gòu)并沒有推薦某一種微生物作為用于驗證的唯一微生物。 微生物的尺寸應(yīng)小到能通過 0.45 m 的過濾器 其他符合要求的微生物也可以接受。 必須建立挑戰(zhàn)細菌符合要求的模型 必須清楚過程中的生物負荷對所選擇細菌的影響,挑戰(zhàn)微生物的選擇 - 2.,推薦選擇Brevundimonas diminuta 作為用于除菌級過濾器驗證的微生物。 目前應(yīng)用的培養(yǎng)方法有兩種: 肉湯法 (Leahy and Sullivan, 1978) 凍膏法 (Fennington Jr. and Howard Jr., 1997) 兩者都符合現(xiàn)行工業(yè)標準,有效挑戰(zhàn)濃度,過濾后應(yīng)該 過濾器測試膜每平方厘米表面達到至少107

11、個微生物 均勻分布于膜的表面是最理想的 挑戰(zhàn)濃度 (cfu/mL) 和挑戰(zhàn)水平 (cfu/cm2).是不同的，不可混淆,有效的挑戰(zhàn)水平,最低挑戰(zhàn)水平應(yīng)為每平方厘米膜表面至少 107 cfu B. diminuta (或生物負荷) 基于Bowman對0.45 m過濾器的觀察 Bowman et al., J. Pharm. Sci., 56: 222 (1967) 0.45 m 過濾器截留數(shù)量 104-106 cfu/cm2 檢查過大的孔 “除菌級”的定義,聚集,單分散性的細胞最適用于挑戰(zhàn) 用光學顯微鏡甄選菌株 使用超聲波/振動使其散開 通過光學顯微鏡和存活計數(shù)予以確定 使用 0.45 m過濾器

12、作為過濾器挑戰(zhàn)測試中的陽性對照措施。,測試微生物的活性,確認挑戰(zhàn)液體中微生物的活性 藥物產(chǎn)品或替代物 微生物必須在整個挑戰(zhàn)測試的過程中是存活的 如果損失了10倍的微生物，可能就不適合采用直接接種法來進行挑戰(zhàn)測試。 挑戰(zhàn)前后確定活性 使用可接受的微生物學方法，如 標準平板計數(shù)，用于上游分析 方法必須經(jīng)過驗證 (暗示) 使用相同的培養(yǎng)基分析濾出液中細菌存在的情況。 Section 6.9/6.11,抑菌/殺菌/非分散溶液,由于直接接種法是理想的 由于測試微生物活性的一些問題，一個成功的測試計劃可能需要改變 挑戰(zhàn)液體 挑戰(zhàn)條件 或兩者兼有 可能需要預(yù)處理過濾器 文件給出了定義毒性水平的指南,2. 直

13、接法,可存活的 微生物?,否,改變 產(chǎn)品/過程,預(yù)處理過濾器,B. Diminuta / 挑戰(zhàn)微生物,泵,測試過濾器,抗生素 防腐劑 溫度 pH,1,2,藥品,化驗濾出液 中的微生物,產(chǎn)品或過程的改變:抑菌/殺菌溶液,概述 決策過程一般不能被很好地理解。 圖2 給出了大概的指南 首選始終是直接接種法。 第二個選擇是改變產(chǎn)品/過程。 預(yù)處理過濾器需要與改變產(chǎn)品/過程結(jié)合起來進行。 文件提供了關(guān)于定義毒性水平的指南 (毒性大于 1 log) 文件沒有試圖把改變產(chǎn)品或程序的方法區(qū)分優(yōu)先次序 必須科學地使決策合理化。,Section 6.15,壓差和流量,應(yīng)包括最大過程條件 達到或超過已知壓差 達到或

14、超過已知流量 也許不能在小范圍內(nèi)同時模擬兩者。 使用者決定哪個與特定的過程更相關(guān) 建立支持決策的理由,Section 6.17,化驗和結(jié)果解釋,可以用0.45 或 0.22 m過濾器從濾出液中回收微生物。 所有的濾出液必須經(jīng)過化驗 要認為一個過濾器對于某個過程來說是滅菌級別: 測試過濾器不能允許任何微生物通過 所有的陽性和陰性對照措施必須是有效的。 為確定微生物穿過了過濾器而進行重復測試是允許的,產(chǎn)品的生物負荷,產(chǎn)品的生物負荷必須經(jīng) 辨認 確定特征 確定數(shù)量 過濾器生物負荷(即挑戰(zhàn)水平)的計算 過濾器生物負荷=BV/A，那么 B = 微生物計數(shù) (cfu/mL) V = 總體積 (ml) A

15、= 過濾器總表面積 (cm2) 過濾器生物負荷單位是cfu/cm2 允許使用者拿生產(chǎn)過濾器生物負荷與標準挑戰(zhàn)測試生物負荷（107 cfu/cm2)相比較。 Section 6.22,設(shè)備測試的原理： 評估過濾器裝置的完整性,要考慮到生產(chǎn)出來的裝置可能沒有截留作用 膜未封閉好 膜遭到了破壞 構(gòu)件相交之處膜有缺陷 要考慮到不能依賴完整性測試檢查出設(shè)備在生產(chǎn)過程中形成的缺陷。,濾介體 vs. 裝置,選擇膜盤還是裝置取決于驗證操作的目的 如果目的是驗證膜的截留性能，那么使用膜盤進行縮小比例試驗 完整性測試的方法必須有意義: 如: 建立泡點和擴散流之間的關(guān)系 膜的完整性在安放膜的時候得以建立，在裝置測試

16、中得以確認。,擴大試驗:濾介體 vs. 裝置,膜盤是適用于驗證過程過濾裝置某些特征的一種模型。 過濾裝置必須經(jīng)過驗證才能應(yīng)用于生產(chǎn)過程中。,Section 6.16,盤測試的原因: 確保過濾裝置完整性,過濾器最初的和過程中的完整性通過以下手段得以充分保證 證明過濾器與過程相匹配的充分研究 過濾器生產(chǎn)商質(zhì)量系統(tǒng)審查 經(jīng)驗證的完整性測試 于過濾器使用前后恰當?shù)貓?zhí)行,壓差和流量,應(yīng)包括最大過程條件 達到或超過已知壓差 達到或超過已知流量 也許不能在小范圍內(nèi)同時模擬兩者。 使用者決定哪個與特定的過程更相關(guān) 建立支持決策的理由,化驗?zāi)さ倪x擇,通常兩者均可 0.45 m 或 0.22 m 用額定的分析過濾

17、器回收測試微生物 一篇發(fā)表的論文支持使用0.45 m過濾器(J. Carter, PDA-JPST, Volume 50, No.3, 1996) 化驗過濾器的選擇應(yīng)該經(jīng)過驗證,產(chǎn)品生物負荷,驗證設(shè)計必須考慮最初的生物負荷 辨認 確定特征 確定數(shù)量 過濾器生物負荷的計算 B = BV/A 在這里 B = 微生物計數(shù) (cfu/mL) V = 總體積 (mL) A = 過濾器總表面積 (cm2) 使用B. diminuta假定用過濾的方法去除自然生物負荷微生物更難。,area,生物負荷,Brevundimonas diminuta 對比自然生物負荷試驗,標準培養(yǎng)法 (ASTM) 小細胞 單分散性的細胞 歷史上,需要培養(yǎng)方法 培養(yǎng)的效果? 需要大小分析法 沒有工業(yè)標準 安全事宜 生物負荷何時變化?,B. diminuta,將 B. diminuta 與自然生物負荷微生物相比較?,培養(yǎng)方法的建立 微生物大小的確定 光學顯微鏡 掃描電子顯微鏡 同時測量生物負荷微生物和B. diminuta 過濾性研究 使用0.45 m 膜盤 同時測量生物負荷微生物和B. diminuta的截留情況,自然生物負荷微生物,知道生物負荷情況 質(zhì)量上 數(shù)量上 考慮對B. diminuta有殺菌/抑菌作用的產(chǎn)品。 所選的微生物必須能在實際測試產(chǎn)品中生存。 必須能繁殖到足以提供107cf