培養(yǎng)基的滅菌

1、培養(yǎng)基的滅菌,滅菌的原理及方法 培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌工藝,滅菌：指用化學(xué)或物理的方法殺滅或去除物料及設(shè)備中所有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝過程。 消毒：消除病原微生物的措施。 在工業(yè)中一般都籠統(tǒng)地稱為殺菌或滅菌。,生產(chǎn)菌和雜菌同時在培養(yǎng)基中生長，結(jié)果喪失了生產(chǎn)能力。雜菌的生長速度有時比生產(chǎn)菌生長得快，結(jié)果使反應(yīng)器中以雜菌為主。雜菌會污染最終產(chǎn)品。雜菌所產(chǎn)生的物質(zhì)，使提取產(chǎn)物時發(fā)生困難。雜菌降解所需要的產(chǎn)物。發(fā)酵如污染了噬菌體，可使生產(chǎn)菌株發(fā)生溶菌現(xiàn)象。,如有雜菌，可引起以下的后果：,第一節(jié) 滅菌的原理及方法,一. 幾種常見的滅菌方法,1. 化學(xué)試劑滅菌法,原理：藥物與微生物細胞中的成分反應(yīng)，使蛋白質(zhì)

2、變性、酶失活。,使用范圍：,器皿、雙手和實驗室、無菌室的環(huán)境滅菌， 不能用于培養(yǎng)基滅菌。,常用的滅菌劑:,常用的滅菌劑,2.輻射滅菌,原理：利用高能量的電磁輻射與菌體核酸的光化學(xué)反應(yīng)造成菌體死亡。 常用：紫外線、X射線和射線。 使用范圍：用于室內(nèi)空氣及器皿表面滅菌。,3干熱滅菌法,原理：利用高溫對微生物有氧化、蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮作用而殺滅微生物。 常用方法：灼燒和電熱箱加熱，140-180 1-2小時。 使用范圍：玻璃及金屬用具及沙土管滅菌,4濕熱滅菌法,原理：蒸汽冷凝放出大量潛熱，具有穿透力，且在高溫有水分條件下，蛋白質(zhì)易變性。 常用方法： 水煮常壓滅菌：100 飽和蒸汽滅菌：一般121

3、，30分鐘 使用范圍：培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備滅菌,5過濾除菌法,原理：利用微生物不能透過濾膜除菌。 方法: 0.010.45 m孔徑濾膜。 使用范圍：用于壓縮空氣、酶溶液及其他不耐熱化合物溶液除菌。,6火焰滅菌法,原理：利用火焰直接殺死微生物。 使用范圍：接種針、玻璃棒、三角瓶口,1.微生物熱死動力學(xué)（對數(shù)殘存定律） - dN / dt =K N N：菌體個數(shù)（個） t : 滅菌時間（S） k：反應(yīng)速度常數(shù)（S-1） dN / dt: 菌體受熱死亡速率,Ln N/ N0 = - K t N= N0 e- K t 以菌體的殘留數(shù)Ln N/ N0的對數(shù)與時間t 作圖，得出一條直線，其斜率為- K 。,2

4、 .反應(yīng)速率常數(shù)K,如何通過實驗根據(jù)對數(shù)殘存定律確定某一溫度,某一微生物的K ？,1). K 與菌種的特性有關(guān),相同溫度下，微生物越耐熱， k值越小。 相同溫度下，微生物越不耐熱，k值越大。,2). K 與滅菌溫度有關(guān) K=A e E / RT （阿累尼烏斯方程） Ln K =Ln A- E/ RT A：比例常數(shù) R：氣體常數(shù)(J/ mol K) T：絕對溫度( K) E：殺死細菌所需的活化能（J/ mol）,第二節(jié) 培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌工藝,一培養(yǎng)基滅菌時間的選擇,t =1/ k * Ln( N0/ N),其中 K：一般耐熱的細菌芽孢的K值 N0 ：細菌及芽孢數(shù)之和 N：10 -3,二.

5、培養(yǎng)基滅菌溫度的選擇,選擇即能達到滅菌要求，又保證營養(yǎng)成分不被破壞的溫度。,三 影響滅菌效果的因素,微生物種類：不同的微生物k值不同。 初始菌量：在保持N值不變的前提下，t 與初始菌量N0的對數(shù)成正比。 培養(yǎng)基成份：油脂、蛋白質(zhì)增加微生物的耐熱性。 傳熱與混合狀況：影響受熱均勻度。 培養(yǎng)基中固體顆粒的存在影響熱穿透。 蒸汽中空氣的存在降低蒸汽分壓和滅菌溫度。 pH：酸性pH下可加快微生物熱死速率 。,四. 培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌方法,（一）實驗室種子培養(yǎng)基滅菌方法,手提式滅菌鍋。 容量小。,使用高壓蒸汽滅菌鍋,立式或臥式滅菌鍋。 容量較大， 一般能裝幾十瓶或幾百瓶。,滅菌柜。 要和蒸汽鍋爐配套

6、，用于大量種瓶培養(yǎng)基的滅菌，一次能裝幾百至幾千瓶(袋)。,（二）分批滅菌(batch sterilization）,1定義： 將配制好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐中，用蒸汽加熱，使培養(yǎng)基和設(shè)備同時滅菌的一種滅菌方式。,2操作過程：,空罐準備：清洗、檢修和檢測。 升溫：把培養(yǎng)基加熱到滅菌所需的溫度。 保溫維持：在滅菌溫度下保持滅菌所需時間。 冷卻保壓：把培養(yǎng)基的溫度降低到接種的溫度。,溫度隨滅菌時間的變化,四路出汽：直接蒸汽從排氣、接種、進料和消沫劑管排氣,分批滅菌設(shè)備示意圖,三路進汽：直接蒸汽從通風(fēng)、取樣和出料口進入罐內(nèi)直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持一定的時間。這就是所謂的“三路進氣”。,（三）連續(xù)

7、滅菌（continuous sterilization）,1定義：將培養(yǎng)基通過專門設(shè)計的滅菌器，進行連續(xù)流動滅菌后，進入預(yù)先滅過菌的發(fā)酵罐中的滅菌方式。,2流程：,1)由熱交換器組成的滅菌系統(tǒng) 2)蒸汽直接噴射型的連續(xù)滅菌系統(tǒng) 3)由連消塔、維持罐和噴淋冷卻組成的滅菌系統(tǒng),1)由熱交換器組成的滅菌系統(tǒng)工藝流程圖,溫度隨時間的變化,2)蒸汽直接噴射型的連續(xù)滅菌系統(tǒng),溫度隨滅菌時間的變化,3)由連消塔、維持罐和噴淋冷卻組成的滅菌系統(tǒng),（四）連續(xù)滅菌與分批滅菌的比較與選擇,分批滅菌 優(yōu)點： 1. 不需附加設(shè)備 2. 蒸汽利用率高 3. 節(jié)約勞動力 缺點 1.培養(yǎng)基質(zhì)量比較差 2.罐的利用率低 3.冷

8、卻水用量大,連續(xù)滅菌 優(yōu)點: 1.采用高溫快速滅菌法 2.可以把培養(yǎng)基按性質(zhì)分開滅菌 3.有利于自動控制 4.節(jié)省冷卻水 缺點 1.投資費用高 2.對物料要求高,選擇原則：,1培養(yǎng)基成份（易降解成分、液化情況等 ) 2設(shè)備狀況（冷卻面積、傳動裝置等） 3. 動力條件,(五)、發(fā)酵罐的滅菌,培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法。則發(fā)酵罐應(yīng)在加入滅菌的培養(yǎng)基前先行單獨滅菌。通常是用蒸汽加熱發(fā)酵罐的夾套或設(shè)管并從空氣分布管中通入蒸汽，充滿整個容器后，再從排氣管中緩緩排出。容器內(nèi)的蒸汽壓力保持1公斤，20分鐘。在保溫結(jié)束后，關(guān)鍵是隨即通入無菌空氣，使容器保持正壓，防止形成真空而吸入帶菌的空氣。,(六)、補料液的滅菌,在發(fā)酵過程中，往往要向發(fā)酵罐中補入各種不同的料液。這些料液都必需經(jīng)過滅菌。 滅菌的方法則視料液的性質(zhì)、體積和補料速率而定。 如果補料量較大，而具有連續(xù)性時，則采用連續(xù)滅菌較為合適。 也有利用過濾法對另補料液進行除菌。 補料液的分批滅菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。 所有的附屬設(shè)備和管道都要經(jīng)過滅菌。,四、高溫對培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止,消除高溫有害影響的措施,(1）采用特殊加熱