體液蛋白質(zhì)檢驗PPT課件

第七章 體液蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)含氮化合物檢驗,1,一、血漿蛋白質(zhì)的分類及功能 血漿蛋白質(zhì)的分類組成 血漿蛋白質(zhì)是血漿固體成份中含量最多、組成復(fù)雜、功能廣泛的一類化合物。占血漿固體成份90左右，目前已經(jīng)研究的血漿蛋白質(zhì)有500多種，分離出的純品物200來種，除免疫球蛋白外，主要由肝細(xì)胞合成。,第一節(jié) 概 述,2,（一）血漿蛋白質(zhì)的功能 1. 維持血漿膠體滲透壓 清蛋白維持75%80%的血漿滲透壓。 2. 作為某些物質(zhì)的載體 如清蛋白能與多種物質(zhì)結(jié)合（FA、膽紅素），而某些球蛋白具特異地運輸某些物質(zhì)的功能，運鐵蛋白、運皮質(zhì)醇蛋白。 3. 維持體液pH恒定 血漿蛋白PI一般都小于7.4是弱酸，一部分的弱酸鹽形式存在，構(gòu)成緩沖對。,3,4.免疫功能 血漿中許多具有免疫功能的球蛋白，主要由漿細(xì)胞合成，電泳時位于r區(qū)帶，如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，此外，還有具有免疫作用的非特異球蛋白，如補體。 5.凝血與纖溶作用 凝血與纖溶是一對矛盾的統(tǒng)一、凝血因子與纖溶因子絕大部分是血漿蛋白質(zhì)，它們促進(jìn)血液凝固，防止血液流失和溶解血栓，防止重要臟器的動脈栓塞。,4,6.營養(yǎng)作用 血漿蛋白質(zhì)可分成AA，用于合成組織蛋白或氧化供能。 7.催化作用 血漿中有許多酶類，其中部分在血漿中發(fā)揮作用，稱血漿功能性酶，如凝血酶原、纖溶酶原、銅藍(lán)蛋白、LPL、LCAT、腎素等。,5,（二）血漿蛋白質(zhì)的分類,1、根據(jù)分離方法分類鹽析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半飽和的硫酸銨溶液）,電泳法：,醋酸纖維素薄膜電泳：6種,瓊脂糖凝膠電泳：13種,聚丙烯酰胺凝膠電泳：30種,SDS聚丙烯酰胺凝膠等電雙向電泳：300種,分辨率增高,+,-,醋酸纖維素薄膜,纖維蛋白原,6,2、根據(jù)生理功能分類,7,二、血漿中常見血漿蛋白質(zhì)特性 在炎癥、創(chuàng)傷、感染、心肌梗塞、腫瘤等情況下其血漿濃度會發(fā)生明顯改變的蛋白質(zhì)稱為急性時相反應(yīng)蛋白（acute phase reactants protein APRP）。主要包括AAG、AAT、Hp、CER、C3、C4、纖維蛋白原、CRP；PA、Alb、TRF。,8,（一）前清蛋白（pueallumun PA）電泳時移速比清蛋白快，位于其前方面得名。結(jié)構(gòu)：分子量5.4萬，四個相同亞基形成的四聚體理化性質(zhì)：PI=4.7，由肝細(xì)胞合成，半壽期短12h。測定方法：常用的方法是免疫化學(xué)方法功能:營養(yǎng)指標(biāo)，載體功能（甲狀腺素維生素）。 【參考范圍】0.20.4g/L, 【臨床意義】急性炎癥，惡性腫瘤，肝硬化或腎炎時下降。,9,（二）視黃醇結(jié)合蛋白,視黃醇結(jié)合蛋白(Retinol-Binding Protein,RBP)是血液中維生素的轉(zhuǎn)運蛋白，由肝臟合成、廣泛分布于血液、腦脊液、尿液及其他體液中。測定視黃醇結(jié)合蛋白能早期發(fā)現(xiàn)腎小管的功能損害，并能靈敏反映腎近曲小管的損害程度，還可作為肝功能早期損害和監(jiān)護治療的指標(biāo)。,10,降低維生素A缺乏癥、低蛋白血癥、吸收不良綜合征、肝疾病(除外營養(yǎng)過剩性脂肪肝)、阻塞性黃疸、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、感染癥、外傷等。升高腎功能不全、營養(yǎng)過剩性脂肪肝。尿液RBP：急慢性腎炎，糖尿病腎?。宦阅I衰1 血清RBP：急慢性肝炎；肝硬化；,11,（三）清蛋白（allumim, ALb）分子量66458，由肝實質(zhì)細(xì)胞合成，半壽期1519天，是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，占4060，主要功能，維持血漿膠體滲透性，緩沖作用，運輸作用，營養(yǎng)作用，調(diào)節(jié)某些激素或藥物活性。 清蛋白可微量地通過腎小球，約0.04，但大部分被腎小管重吸收。清蛋白的測定方法目前主要是溴甲酚綠（BCG）法。,12,【參考范圍】3555g/L 【臨床意義】血漿白蛋白增高臨床少見，主要見于嚴(yán)重失水引起血液濃縮。血漿白蛋白降低臨床常見。合成障礙急、慢性肝炎。丟失過多，腎病綜合癥、慢性腎小球、腎炎、糖尿病、系統(tǒng)性斑狼瘡等。分解過多，營養(yǎng)不良，慢性胃腸道疾病。,13,（四）1-抗胰蛋白酶（1AT或AAT），分子量5.5萬，pI4.8，含糖1012，電泳時位于1區(qū)帶，占90左右，由肝細(xì)胞合成，能抑制多種酶活性，尤其是蛋白酶，占血清中抑制蛋白酶活力的90左右，抑制作用有明顯的pH依賴性，在中性和弱堿性中活力最大。 AAT也是一種急性時相反應(yīng)蛋白，主要功能是對抗多形核蛋白細(xì)胞吞噬作用時釋放的溶酶體蛋白水解酶。,14,AAT測定方法 目前主要采用免疫化學(xué)法。 【參考范圍】成人0.832.0g/L， 【臨床意義】AAT下降見于胎兒呼吸窘迫癥，AAT缺陷所致的肺氣腫、肝硬化等。AAT上升見于急性炎癥、外科手術(shù)后，長期服用可的松藥物，妊娠及服用避孕藥物。,15,（五）1-酸性糖蛋白（-AG或AAG）分子量約4萬，含糖約45，pI2.73.5，主要由肝細(xì)胞合成，某些腫瘤組織也可合成。AAG是主要的急性相反應(yīng)蛋白，急性炎癥時上升，與免疫防御功能有關(guān)。 AAG測定方法 使用AAG抗體，進(jìn)行免疫散法或免疫比濁法檢測， 【參考范圍】0.252.0g/L 【臨床意義】主要作為急性時相反應(yīng)的指標(biāo)，風(fēng)濕病、惡性腫瘤、心肌梗塞患者上升，營養(yǎng)不良、嚴(yán)重肝病下降。,16,17,【參考范圍】1030g/L 【臨床意義】AFP作為腫瘤標(biāo)志物，對原發(fā)性肝癌的診斷很有價值，80以上原發(fā)性肝癌患者血清AFP上升，但無特異性，肺癌、胰腺癌，肝硬化患者血清AFP亦升高，此外，羊水AFP含量測定可用于胎兒產(chǎn)前監(jiān)測，AFP增高，提示胎兒畸形（神經(jīng)管缺損、脊柱裂、無腦兒）死胎。,18,（七）癌胚抗原,癌胚抗原是大腸癌組織產(chǎn)生的一種糖蛋白，作為抗原可引起患者的免疫反應(yīng)。此種抗原稱為癌胚抗原（carcino-embryonic antigen CEA），可廣泛存在于內(nèi)胚葉起源的消化系統(tǒng)癌，也存在于正常胚胎的消化管組織中，在正常人血清中也可有微量存在。 癌胚抗原是一個廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測和預(yù)后估計是一個較好的腫瘤標(biāo)志物，但其特異性不強，靈敏度不高，對腫瘤早期診斷作用不明顯。,19,CEA最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌和胎兒腸組織中，故名癌胚抗原。CEA升高常見于大腸癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲狀腺髓樣癌等。但吸煙、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特異性結(jié)腸炎等疾病，15%53%的病人血清CEA也會升高，所以CEA不是惡性腫瘤的特異性標(biāo)志，在診斷上只有輔助價值。此外，血清CEA水平與大腸癌的分期有明確關(guān)系，越晚期的病變，CEA濃度越高。,20,97%的健康成人血清CEA濃度在25g/L以下。原發(fā)性小腸癌CEA分布原發(fā)性小腸癌CEA分布原發(fā)性結(jié)腸癌患者CEA增高占4580%。除原發(fā)性結(jié)腸癌以外，胰腺癌、膽管癌、胃癌、食管癌、腺癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系統(tǒng)的腫瘤陽性率也很高，一般在5070%。良性腫瘤、炎癥和退行性疾病，如結(jié)腸息肉、潰瘍性結(jié)腸炎、胰腺炎和酒精性肝硬化變病人CEA也有部分升高，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于惡性腫瘤，一般小于20g/L，CEA超過20g/L時往往提示有消化道腫瘤。所以測定CEA可以作為良性與惡性腫瘤的鑒別診斷依據(jù)。為消化道腫瘤的輔助診斷指標(biāo)。參考值5.9g/L,21,（八）結(jié)合珠蛋白（ Hp）又名觸珠蛋白，是一種糖蛋白，主要由肝合成，電泳時位于2區(qū)帶，是一種急性時相反應(yīng)蛋白，為兩對肽鏈組成的四聚體（22）。鏈有1和2兩種，其中1有兩種遺傳變異體。 Hp的主要功能與血漿中游離血紅蛋白結(jié)合，（不可逆結(jié)合），并送至肝細(xì)胞內(nèi)降解，因此Hp在溶血后含量急劇下降。,22,血漿Hp測定方法 測定Hp-Hb復(fù)合物中過氧化物酶活性。在血漿中加入過量Hb，生成Hp-Hb復(fù)合物，凝膠層折法收復(fù)合物分離，測定結(jié)合的Hb。電泳法。免疫化學(xué)法。 【參考范圍】0.52.2g/L 【臨床意義】急性時相反應(yīng)中血漿Hp上升，燒傷、腎病綜合征引起Alb丟失時Hp上升，血管內(nèi)溶血Hp下降。,23,（九）2-巨球蛋白（2MG或AMG）是血漿中分子量最大的蛋白質(zhì)，分子量為62.580萬，含糖量8。 AMG由肝細(xì)胞與單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)合成，半壽期5天。 AMG最突出的特性能與多種分子和離子結(jié)合，特別是它能與多種蛋白水解酶結(jié)合而影響這些酶的活性，是血漿中主要的蛋白酶抑制劑。能選擇地保護某些蛋白酶活性的作用。 AMG測定方法 免疫化學(xué)法， 【參考范圍】1.254.10g/L 【臨床意義】在低蛋白血癥，AMG上升，妊娠、服用避孕藥時AMG上升。,24,（十）銅藍(lán)蛋白（CER）含銅的糖蛋白，分子量約1216萬，含糖量約10，因含銅而呈藍(lán)色，故名銅藍(lán)蛋白。主要由肝臟合成。 CER具有氧化酶活性，使血液中Fe2+氧化成Fe3+，故又稱亞鐵氧化酶。CER還起著抗氧化劑的作用。防止組織中脂質(zhì)過氧化物和自由基的生成。 CER測定方法 免疫化學(xué)法或酶活性測定。 【參考范圍】0.20.5g/L。 【臨床意義】CER屬于急性時相反應(yīng)蛋白。在感染、創(chuàng)傷和腫瘤時上升，Wilson?。ǜ味?fàn)詈俗冃裕〤ER下降。,25,（十一）轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF） 血漿中主要含鐵蛋白質(zhì)，分子量7.7萬，含糖約6，由肝及網(wǎng)狀皮系統(tǒng)合成，半壽期7天。 主要運載由消化道吸收的鐵和RBC降解釋放的鐵，此外還可逆地結(jié)合多價金屬離子，如Ca、Zn、Cu等。 TRF測定方法 放免法、散射比濁法。 【參考范圍】2.54.3g/L。 【臨床意義】TRF在急性時反應(yīng)中下降，如炎癥、惡性病變時、TRF、Alb、PA同時下降，慢性肝病及營養(yǎng)不良亦下降，妊娠、口服避孕藥，注射雌激素TRF上升。,26,（十二）2-微球蛋白（BMG） 由淋巴細(xì)胞合成，分子量11800，pI5.7，存在于所有有核細(xì)胞的表面，特別是淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞并由此釋放入血，半壽期107min。 BMG測定方法 常用放免法，ELISA法。 【參考范圍】1.02.5mg/L。 【臨床意義】主要用于監(jiān)測腎小管功能，特別是腎移植后，如有排異反應(yīng)，BMG在尿中排出量上升，腎功能衰竭，炎癥、腫瘤血漿BMG上升。,27,（十三）C-反應(yīng)蛋白（CRP） 是一種能結(jié)合肺炎雙球菌細(xì)胞壁C-多糖的蛋白質(zhì)，分子量11.514萬，五條肽鏈組成，肝細(xì)胞合成。CRP能激活補體，促進(jìn)粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的運動和吞噬，具有調(diào)理素樣作用。 CRP測定方法 免疫擴散法，火箭免疫電泳法，ELISA法，放免法， 【參考范圍】8.0mg/L。 【臨床意義】作為急性時相反應(yīng)的一個極靈敏指標(biāo) ，急性心肌梗死，創(chuàng)傷、感染、炎癥、外科手術(shù)、腫瘤浸潤迅速上升。,28,上述蛋白質(zhì)除PA、Alb、BMG外都屬于糖蛋白，含糖量最高的是AAG、45，除BMG外都主要由肝細(xì)胞合成。,29,三、疾病時的血漿蛋白質(zhì)變化 （一）炎癥、創(chuàng)傷 在炎癥、創(chuàng)傷、感染、心肌梗塞、腫瘤等情況下其血漿濃度會發(fā)生明顯改變的蛋白質(zhì)稱為急性時相反應(yīng)蛋白（acute phase reactants protein APRP）。主要包括AAG、AAT、Hp、CER、C3、C4、纖維蛋白原、CRP；PA、Alb、TRF。,30,（二）肝臟疾病 血漿蛋白質(zhì)大多數(shù)由肝臟合成，因此肝臟疾病可導(dǎo)致多種血漿蛋白質(zhì)發(fā)生變化。 如乙肝活動期AAT，Hp、PA、Alb，特別是血漿PA的含量是肝功能損傷的敏感指標(biāo)。 肝硬化時AAT、IgA、AMG，CER、CRP，而AAG、Hp、C3，PA、Alb、TRF。,31,（三）腎臟疾病 腎臟疾病可出現(xiàn)蛋白尿而導(dǎo)致血漿蛋白質(zhì)丟失，丟失的蛋白質(zhì)與其分子量有關(guān)。小分子量蛋白質(zhì)丟失最明顯，而大分子量的蛋白質(zhì)因肝細(xì)胞代償性地合成增加，絕對含量升高。所以血漿Alb、PA、AAG、AAT、TRF，而AMG、-LP（血清脂蛋白 ）、Hp，這稱為選擇性蛋白質(zhì)丟失。 當(dāng)嚴(yán)重腎病是腎小球失去分子篩作用，可導(dǎo)致非選擇性蛋白質(zhì)丟失，表現(xiàn)為廣泛地低血漿蛋白質(zhì)血癥。,32,生化檢驗中測定蛋白質(zhì)的方法很多，主要利用蛋白質(zhì)的分子組成，結(jié)構(gòu)或性質(zhì)進(jìn)行。一、蛋白質(zhì)分析技術(shù) （一）測定蛋白質(zhì)特征元素氮 如凱氏定氮法，是測定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法，1883年Kjeldahl首創(chuàng)，精密度準(zhǔn)確度高，但操作復(fù)雜、費時、技術(shù)性強，不適合臨床常規(guī)檢測，一般用于標(biāo)準(zhǔn)血清的標(biāo)定和校正。,第二節(jié) 體液蛋白質(zhì)檢驗,33,（二）利用重復(fù)的肽鏈結(jié)構(gòu) 如雙縮脲法，1914年首創(chuàng)，操作簡便，重復(fù)性好，各種蛋白產(chǎn)生的顏色反應(yīng)相近，但靈敏度較低，是目前臨床上測定總蛋白的常規(guī)方法。,34,（三）利用酪氨酸、色氨酸殘基與試劑的反應(yīng)或紫外吸收特性 1. 酚試劑法 1921年，F(xiàn)olin首創(chuàng)，1951年改良成廣泛使用的Lowry法，靈敏度高（較雙縮脲法高100倍），主要用于微量蛋白質(zhì)檢測，但各種蛋白質(zhì)中酪氨酸含量不一，故準(zhǔn)確性較差，試劑配制復(fù)雜且不穩(wěn)定，化學(xué)干擾大，目前臨床上僅用于粘蛋白測定。 2. 紫外吸收法 在280nm處有一吸收峰，快速、簡單，不需加任何試劑，保留蛋白質(zhì)活性，化學(xué)干擾大。,35,（四）利用與染料的結(jié)合能力 1. 考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合蛋白法（CBB法）1976年Bradford應(yīng)用于蛋白質(zhì)測定，操作簡便、快速、重復(fù)性好，靈敏度高，干擾因素少，但特異性不高，大分子肽（分子量300以上），也參與反應(yīng)，線性范圍窄，臨床上主要用于尿、腦脊液蛋白質(zhì)測定。 2. 溴甲酚綠結(jié)合清蛋白法（BCG法） 靈敏度高，血清用量少，操作簡便，但特異性不高，部分球蛋白也能與之結(jié)合（1-球蛋白、運鐵蛋白、觸珠蛋白等），是目前臨床上測定清蛋白的常規(guī)方法。,36,（五）利用沉淀后借濁度或光折射測定 如比濁法、折光測定法，方法簡便，試劑易得，但濁度的強弱受反應(yīng)的條件影響大（加試劑的方法、溫度等），結(jié)果準(zhǔn)確性差，一般用于尿、腦脊液蛋白測定。 （六）電泳法 CAE、PAGE目前臨床上常用電泳技術(shù)，但只能測定各種蛋白質(zhì)的百分含量。 （七）利用免疫學(xué)特性 免疫化學(xué)法，特異性、靈敏度高，只能用于某種特異蛋白的測定。,37,（一）血清總蛋白的測定（雙縮脲法） 【原理】蛋白質(zhì)分子中的肽鏈在堿性條件下能與二價銅離子作用生成紫紅色的絡(luò)合物，產(chǎn)生的顏色強度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的含量成正比，但雙縮脲反應(yīng)并非蛋白質(zhì)特有的顏色反應(yīng)，分子中含二個以上肽鍵者均有此反應(yīng)。,38,【試劑】雙縮脲試劑 未失結(jié)晶水的硫酸銅（CuSO45H2O）3.0g溶于500ml新鮮制備的蒸餾水或剛煮沸冷卻的去離子水中，加酒石酸鉀鈉（NaKC4O4H64H2O）9.0g，碘化鉀5.0g，待完全溶解后加入6mol/L NaOH溶液100ml，最后加蒸餾水至1L，置聚乙烯瓶內(nèi)蓋緊保存。 酒石酸鉀鈉的作用是絡(luò)合銅離子，維持銅離子在堿性溶液中的溶解度，碘化鉀防止兩價銅離子還原。 【參考范圍】6080g/L,39,【臨床意義】 （一）血清總蛋白增高 1. 血液濃縮 嚴(yán)重腹瀉 、嘔吐、高燒 2. 合成增加 主要見于球蛋白合成增加，多發(fā)性骨髓瘤。 （二）血清總蛋白降低 1.血液稀釋 靜脈滴注過多低滲溶液，各種原因所引起的水鈉潴留。 2. 攝入不足和消耗增加 營養(yǎng)不良，慢性胃腸道疾病引起的消化吸收不良，消耗性疾病，結(jié)核病、甲亢、惡性腫瘤。 3. 合成障礙 主要見于肝臟疾患。 4. 蛋白質(zhì)丟失 嚴(yán)重?zé)齻罅垦獫{滲出，腎病綜合癥。,40,（二)血清清蛋白測定（溴甲酚綠法） 【原理】溴甲酚綠（BCG）在pH4.2的環(huán)境中，在有非離子去垢劑（Brij-35）存在時，可與清蛋白結(jié)合形成藍(lán)綠色復(fù)合物，顏色的深淺在一不定范圍內(nèi)與清蛋白含量成正比。 BCG與清蛋白結(jié)合的特異性較低，它不僅與Alb結(jié)合呈色，還可與其他蛋白質(zhì)呈色，其中1-球蛋白，TRF、Hp最明顯，但反應(yīng)速度不同，Alb可立即反應(yīng)（快反應(yīng)），其他蛋白質(zhì)反應(yīng)慢（慢反應(yīng)）。,41,【試劑】 1. 10mmol/L BCG貯存液 BCG1.75g，溶于5ml 1 mol/L NaoH溶液中，加蒸餾水至250ml。 2. 0.5mol/L琥珀酸緩沖貯存液（pH 4.0）NaoH10g，琥珀酸56g，溶解于800ml蒸餾水中，用1mol/L NaoH溶液調(diào)pH至4.100.05加蒸餾水至1L。 3. 疊氮鈉貯存液 疊氮鈉40g溶于1000ml蒸餾水中。 4. Brij-35溶液 Brij-35 29g，加蒸餾水80ml，置80ml左右水溶使其溶解，然后加水至100ml。,42,5. BC