結(jié)核診斷產(chǎn)品培訓(xùn)

1 FASTPlaque 結(jié)核診斷產(chǎn)品培訓(xùn) 2 全球結(jié)核病疫 世界衛(wèi)生組織報(bào)道： l目前全球有近1/3的人已感染結(jié)核桿菌 ，也就是20億人口感染了結(jié)核菌。 l全球有活動(dòng)性肺結(jié)核病人約2000萬(wàn)， l每年新發(fā)結(jié)核病人約800-1000萬(wàn)， l每年約有300萬(wàn)人死于結(jié)核病。 l結(jié)核病已成為全世界成人因傳染病而 死亡的主要疾病之一。 3 l結(jié)核病感染率高：目前全年齡組結(jié) 核菌感染率為44.5%，全國(guó)約 5.5億人受到了結(jié)核菌感染，結(jié)核菌感染率高于全球人口感染率 為1/3的水平。 l結(jié)核病患病率高：估算全國(guó)現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核病人數(shù)450萬(wàn)，其 中涂陽(yáng)肺結(jié)核病人150萬(wàn)，菌陽(yáng)肺結(jié)核病人200萬(wàn)。 l結(jié)核病耐藥率高：按照全國(guó)菌陽(yáng)肺結(jié)核病人200萬(wàn)計(jì)算，全國(guó)有 耐藥病人55.5萬(wàn)。 l結(jié)核病死亡率高：每年因結(jié)核病死亡13萬(wàn)人，為各種其他傳染病 和寄生蟲(chóng)病死亡總和的2倍。 我國(guó)結(jié)核病疫情 4 5 結(jié)核病實(shí)驗(yàn)診斷方法 概 況 6 主要實(shí)驗(yàn)診斷方法 涂片鏡檢法 LJ培養(yǎng)法 快速培養(yǎng)法 免疫法 分子生物法 噬菌體法 7 涂片鏡檢法 快速 檢出率：低，漏診率高 便宜 無(wú)法鑒別死活菌 需進(jìn)一步鑒定 8 LJ培養(yǎng)法 結(jié)核菌檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn) 檢測(cè)周期超長(zhǎng)：約8周 靈敏度：一般，有一定比率假陽(yáng)性 價(jià)格一般 各種分枝桿菌均能生長(zhǎng) 需進(jìn)一步鑒定 9 液體培養(yǎng) 檢測(cè)周期較長(zhǎng)，但比 LJ培養(yǎng)快 靈敏度：較LJ高，污染率較高 價(jià)格：專用儀器，專用試劑，價(jià)格高 各種分枝桿菌均能生長(zhǎng) 需進(jìn)一步鑒定 快速培養(yǎng)檢測(cè)法 BD BACTEC MGIT 960 培養(yǎng)系統(tǒng) BacT ALERT 3D培養(yǎng)系統(tǒng) 液體變色培養(yǎng)基 10 免疫學(xué)方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA） 免疫層析試驗(yàn)（DICA） 快速 靈敏度：低，有一定的假陽(yáng)性和假陰性 特異性差 費(fèi)用：一般 結(jié)核菌的抗原性較弱 結(jié)果判斷帶有主觀性 缺乏有效的質(zhì)控手段 11 分子法 核酸探針雜交 堿基序列測(cè)定 結(jié)核桿菌DNA擴(kuò)增法PCR 結(jié)核桿菌DNA鏈置換擴(kuò)增法-SDA 結(jié)核桿菌RNA擴(kuò)增法Gen-Probe 基因芯片檢測(cè) 12 需要昂貴的儀器設(shè)備，檢測(cè)成本較高， 芯片制備比較復(fù)雜，樣品的準(zhǔn)備與標(biāo)記又較為繁瑣 基因芯片上原位合成探針難免有錯(cuò)誤核苷酸摻入， 使整個(gè)雜交背景增高，降低特異性。 其信號(hào)檢測(cè)的靈敏度也有待于進(jìn)一步提高。 13 WHO的目標(biāo)：70%檢出率 14 檢出率低的全球性問(wèn)題 診斷依靠“傳統(tǒng)的技術(shù)” 癥狀 - 經(jīng)常和其它病兆混淆 涂片鏡檢 靈敏度低 培養(yǎng)法 時(shí)間長(zhǎng) 免疫法靈敏度低，有交叉反應(yīng) 分子法：復(fù)雜，昂貴，難于推廣 X-ray 沒(méi)有特定的判讀標(biāo)準(zhǔn) 15 目前急需一種快速、準(zhǔn) 確、經(jīng)濟(jì)、易推廣的結(jié)核 分枝桿菌檢測(cè)方法 16 WHO新檢測(cè)法應(yīng)該有以下的展望： 特異性高 敏感度高 快速 易操作 節(jié)約成本 17 FASTPlaque TB TM 結(jié)核診斷的創(chuàng)新性突破 18 主要特點(diǎn) l 快速 痰標(biāo)本處理后，僅24小時(shí)就報(bào)告結(jié)果 l 靈敏 檢測(cè)下限可達(dá)100300 cfu/ml l 準(zhǔn)確 只檢出活的結(jié)核分枝桿菌 l 簡(jiǎn)單 常規(guī)操作，極易掌握 l 方便 肉眼直接判讀結(jié)果，無(wú)需顯微觀察 l 安全 不滋長(zhǎng)活體感染源 l 可檢出大量涂片漏診患者 l 可用于HIV高危人群的鑒別診斷 19 檢測(cè)原理 20 噬菌體 病毒 核酸 衣殼 只能在活的易感細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng) 溶原性感染和溶菌性感染 21 先以特異性噬菌體感染、裂解標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿 菌，再用殺病毒劑清除所有未感染MTB的噬菌體，而結(jié) 核分枝桿菌胞內(nèi)的噬菌體繼續(xù)擴(kuò)增，進(jìn)而裂解細(xì)胞，釋 放噬菌體。裂解釋放的噬菌體感染隨即添加的敏感細(xì)胞 ，在其胞內(nèi)擴(kuò)增并裂解敏感細(xì)胞，敏感細(xì)胞菌苔上肉眼 可見(jiàn)的噬菌斑。如待檢標(biāo)本不含結(jié)核分枝桿菌，噬菌體 被殺病毒劑完全清除，故無(wú)噬菌體感染敏感細(xì)胞，敏感 細(xì)胞菌苔上無(wú)噬菌斑出現(xiàn)。 結(jié)核分枝桿菌 敏感細(xì)胞敏感細(xì)胞 敏感細(xì)胞 敏感細(xì)胞 殺病毒劑殺滅未感 染MTB的噬菌體 MTB裂解, 釋放出來(lái)的 噬菌體感染敏感細(xì)胞 噬菌體感染結(jié) 核分枝桿菌 產(chǎn)生噬菌斑 22 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 質(zhì)控 陽(yáng)性對(duì)照 20個(gè)噬菌斑 陰性對(duì)照 10個(gè)噬菌斑 陰性： 無(wú)噬菌斑 陽(yáng)性： 可數(shù)噬菌斑 陽(yáng)性： 噬菌斑部分融合 陽(yáng)性： 噬菌斑完全融合 標(biāo)本 陽(yáng)性結(jié)果 50個(gè)噬菌斑 陰性結(jié)果 19個(gè)噬菌斑 可疑結(jié)果 20-50個(gè)噬菌斑 23 適用范圍 l可檢測(cè)痰液、胸水、腹水、腦脊液、尿、骨髓等多種 標(biāo)本 l用于結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)診斷 l抗癆治療效果的評(píng)價(jià) 尤其是初診病人的鑒別診斷 l用于結(jié)核菌耐藥性的快速檢測(cè) l用于HIV高危人群的鑒別診斷 24 試驗(yàn)方法 25 痰標(biāo)本處 理 準(zhǔn)備質(zhì)控 檢測(cè)標(biāo)本 判 讀 結(jié) 果 試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑配制、制備培養(yǎng)基等 痰標(biāo)本 胸水/腹水/腦脊液/尿等 檢測(cè)流程 26 超凈工作臺(tái)（最好使用生物安全柜） 旋渦振蕩器 冷藏箱（04） 離心機(jī) 可供高壓消毒的容器 水浴設(shè)備（60） 電爐或微波爐 高壓蒸汽滅菌設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱（37） 90mm無(wú)菌培養(yǎng)皿 移液槍及配套槍頭 生物安全罩衣、一次性手套、一次性容器等 一、基本試驗(yàn)條件 27 二、試驗(yàn)準(zhǔn)備 1、pH6.8磷酸緩沖液 2、配制4 NaOH（或NALC-NaOH） 3、準(zhǔn)備試劑盒 A液： C液： D液 E液 F液 G液 4、其它： 28 FPTB 培養(yǎng)液準(zhǔn)備 FASTPlaqueTB 培養(yǎng)基干粉 FPTB 培養(yǎng)液 25C 可保存4周 270ml 凈化水 臨用前，將 FPTB 營(yíng)養(yǎng)添加劑倒入冷 培養(yǎng)液中 FPTB 增強(qiáng)培養(yǎng) 液， 2-8 C下 可保存4周 121C 高壓消毒器 121 C, 10min FPTB 營(yíng)養(yǎng)添加劑 29 FPTB 瓊脂準(zhǔn)備 FASTPlaqueTB 瓊脂干粉 高壓消毒器 121 C, 10min FPTB 瓊脂 60ml 凈化水 25C 下可保存4周 使用前 55 C保存 加熱融化 (微波爐, 水浴 或 直接加熱） 水浴 121C 30 C液 噬菌體凍干粉 （Actiphage） 敏感細(xì)胞凍干粉 （Sensor cells） 無(wú)菌凈化水 殺病毒劑 （Virusol） 5ml 11ml 1.1ml 2-8C下可保存7天 試劑準(zhǔn)備 31 質(zhì)控制備 每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)立陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照 陰性對(duì)照 陰性對(duì)照檢測(cè)殺病毒劑Virusol 的有效性 設(shè)置方法：C液 陽(yáng)性對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)噬菌體 Actiphage 和敏感細(xì)胞 Sensor cells 的有效性 設(shè)置方法：敏感細(xì)胞用C液稀釋106倍 32 E液 陽(yáng)性對(duì)照 各加10 ml C液 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 1 ml C液 陰性對(duì)照 1 ml 33 三、標(biāo)本要求及前處理(痰液) 標(biāo)本要求 標(biāo)本應(yīng)為未進(jìn)行抗結(jié)核治療的初診疑似患者標(biāo)本 痰處理的必要性 去污染：抑制某些污染細(xì)菌，以防止其在平板上過(guò)度生長(zhǎng) 痰液液化：使標(biāo)本更易于操作，釋放TB桿菌，并使TB桿菌 更易為特異性噬菌體感染 濃縮MTB細(xì)胞 去除痰液中某些抑制因子 34 痰液處理方法 (NALC-NaOH) l室溫下用NALC-NaOH 處理 痰液15 min l磷酸緩沖液加至45ml中和 l4000 rpm 離心 15 min l棄去上清液 l用C液15 ml 洗滌 l4000 rpm 離心 15 mins l棄去上清液 l用 C液 1 ml 重懸 35 NALC-NaOH 溶液 室溫靜置 15 min加等體積 NALC -NaOH 溶液 旋緊蓋子后漩渦 振蕩 15 s 將痰液從痰瓶中轉(zhuǎn)移至 離心管中 痰標(biāo)本消化方法 36 磷酸緩沖液 加磷酸緩沖液 至體積為 45ml 4000rpm 離心 15 分鐘 棄去上清液加 15ml C液 C液 請(qǐng)勿讓標(biāo)本在磷 酸緩沖液中停留 過(guò)長(zhǎng)時(shí)間 37 棄去上清液4000 rpm離心 15分鐘 C液 1ml 轉(zhuǎn)移至反應(yīng)管中 用 1ml C 液 懸浮 0.1ml D液 38 四、檢測(cè)過(guò)程 1、分別加0.1ml 試劑D溶液于陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及標(biāo) 本中，輕輕搖晃，確保試管內(nèi)容物位于試管底部，37 孵育60分鐘。 痰處理 0.1ml D液37孵育 60min 0.1ml D液 39 0.1ml F液 2、分別加0.1ml試劑F溶液于陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及標(biāo)本 中，充分混勻（確保殺病毒劑與反應(yīng)管內(nèi)壁完全接觸）， 置于室溫5-7分鐘（嚴(yán)格控制時(shí)間）。 室溫5分鐘 40 3、分別加5 ml C液于陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及標(biāo)本中 ，顛倒混勻一次。 4、分別加1 ml 試劑E溶液于陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及 標(biāo)本中。 5ml C 液 1 ml E 液 41 5、將標(biāo)本、陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照分別倒入相應(yīng)的培養(yǎng)皿。 6、立即將冷卻至552的試劑G 5ml 于培養(yǎng)皿中，快速混勻 。 置于室溫定型。 7、倒置于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1824小時(shí)判讀結(jié)果。 42 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 43 FASTplaqueTBTM檢測(cè)質(zhì)控（對(duì)照），噬菌斑數(shù)應(yīng)在如下范圍 陽(yáng)性對(duì)照 20 個(gè)噬菌斑 陰性對(duì)照 10個(gè)噬菌斑 FASTplaqueTBTM檢測(cè)臨床標(biāo)本，噬菌斑數(shù)應(yīng)在如下范圍： 陽(yáng)性結(jié)果 50個(gè)噬菌斑 陰性結(jié)果 19個(gè)噬菌斑 可疑結(jié)果 20-50個(gè)噬菌斑 44 陰性： 無(wú)噬菌斑 陽(yáng)性： 可數(shù)噬菌斑 陽(yáng)性： 噬菌斑部 分融合 陽(yáng)性： 噬菌斑完 全融合 45 評(píng) 價(jià) 一、技術(shù)評(píng)價(jià) 二、臨床評(píng)價(jià) 46 一、技術(shù)評(píng)價(jià) l靈敏性 - 可以檢出低濃度的 MTB 標(biāo)本MTB濃度100300cfu/ml即可檢出 l特異性 - 只檢測(cè)活的 MTB 噬菌體法僅對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，對(duì) 其它非結(jié)核分枝桿菌、非分枝桿菌均不敏感 。 l快速 - 48h內(nèi)出結(jié)果 l簡(jiǎn)便 - 不需任何特殊儀器 47 48 二、臨床評(píng)價(jià) 國(guó)內(nèi)臨床評(píng)價(jià) 1、中國(guó)CDC結(jié)核防治中心 2、解放軍三O九醫(yī)院 3、上海市肺科醫(yī)院 4、無(wú)錫市傳染病醫(yī)院 49 （資料來(lái)源：中國(guó)CDC結(jié)核病防治臨床中心） 各方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌結(jié)果比較 50 幾種方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌結(jié)果比較（檢測(cè)例數(shù)均為120例） （資料來(lái)源：解放軍三O九醫(yī)院結(jié)核中心） FASTPlque TB法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌結(jié)果 51 FASTPlaqueTB法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌結(jié)果 FPTB法與BACTEC-460法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌結(jié)果比較 （資料來(lái)源：上海市肺科醫(yī)院） 52 幾種方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果比較 （資料來(lái)源：無(wú)錫市傳染病醫(yī)院） 53 結(jié)論 l1、FASTPlaque法比涂片法和LJ培養(yǎng)法檢出率 更高； l2、FASTPlaque法與BACTEC-960、 BACTEC- 460法檢出率無(wú)明顯差別； l3、FASTPlaque法比LJ培養(yǎng)法和BACTEC-960快 速培養(yǎng)法檢測(cè)周期大大縮短，有助于真正實(shí)現(xiàn) 結(jié)核病的快速診斷，是結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)技術(shù) 的重大飛躍，值得廣泛推廣。 54 國(guó)外臨床評(píng)價(jià) FASTPlaqueTB總特異性99.0%，對(duì)涂陰及涂陽(yáng)標(biāo)本的檢測(cè)特異性分別 達(dá)99.5和83.3。該方法可從涂片陰性標(biāo)本中檢出48.7%的陽(yáng)性病例，表 明該方法可用于涂片陰性TB患者的快速檢測(cè)。 國(guó)際結(jié)核與肺疾病雜志2002年第6卷6期） 55 FPTB法檢測(cè)痰標(biāo)本的結(jié)果 FPTB法檢測(cè)其它類型標(biāo)本的結(jié)果 *堪薩斯分枝桿菌；*MOTT：非結(jié)核分枝桿菌 ； （肯尼亞奈洛比地區(qū)Aga Khan醫(yī)院對(duì)FASTPlaqueTBTM試劑盒的臨床評(píng)估） 56 特異性臨床數(shù)據(jù)（國(guó)外） 足夠的信心 結(jié)果是真正的陽(yáng)性顯示 57 即使NTMs存在時(shí)，特異性仍非常高 大數(shù)量的NTMs提供了 一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性的環(huán)境 在巴塞羅那，30%的分支桿 菌為NTMs 噬菌體空斑法只檢測(cè)出13% 的NTMs 總特異性非常高，保持在 99.1% 58 敏感度數(shù)據(jù)（國(guó)外） 比培養(yǎng)更具優(yōu)勢(shì) 兩天出結(jié)果 檢測(cè)活的菌 比涂片更高的靈敏度 59 對(duì)涂片陰性標(biāo)本的檢出情況 培養(yǎng)靈敏度 （%） 特異性 （%）陽(yáng)性陰性 開(kāi)普墩 （n=1447） 噬菌體陽(yáng)性38748 .799 .5 噬菌體陰性401362 卡拉奇 （n=332） 噬菌體陽(yáng)性47467 .198 .4 噬菌體陰性23248 檢測(cè)出約1/2到2/3涂片漏檢的陽(yáng)性標(biāo)本 高特異性保證了結(jié)果的更可信 60 其它類型標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 * 資料來(lái)源肯尼亞、印度和埃及 61 應(yīng) 用 1、臨床初診結(jié)核疑似病人的鑒別診斷 肺結(jié)核、腸結(jié)核、腎結(jié)核、腦結(jié)核、脊髓結(jié)核、 骨結(jié)核等 由于本方法能快速、準(zhǔn)確地檢出活的結(jié)核分枝桿 菌，且適用于包括痰液、胸水、腹水、尿、腦脊液、 骨髓在內(nèi)的多種類型標(biāo)本，因此通過(guò)本方法檢測(cè)結(jié)果 可直接判定患者是否為活動(dòng)性結(jié)核患者，無(wú)需進(jìn)一步 鑒定。 如聯(lián)合涂片法，檢測(cè)效果更佳。 62 檢測(cè)肺部以外的標(biāo)本 l一些權(quán)威的刊物資料提出噬菌體空斑法在肺部 以外結(jié)核診斷中的時(shí)效作用 高特異性 高靈敏度 痰標(biāo)本、淋巴組織切片和抽出物 少數(shù)資料用某些類型標(biāo)本如：腦脊液等 63 2、用于抗癆效果觀察 由于檢測(cè)結(jié)果噬菌斑數(shù)量與標(biāo)本中所含 MTB數(shù)量成正性相關(guān)，因此可通過(guò)噬菌斑數(shù) 量變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)陽(yáng)性弱陽(yáng)性陰性的 轉(zhuǎn)變來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控抗癆藥物是否對(duì)癥。 64 3、從“結(jié)核病并發(fā)艾滋病”中檢出結(jié)核病患者 很多結(jié)核病高發(fā)國(guó)家，結(jié)核病并發(fā)艾滋病比例相當(dāng)高 肯尼亞有55%的結(jié)核病人并發(fā)艾滋病 FASTPlaqueTB法檢出活的結(jié)核分枝桿菌 檢測(cè)結(jié)果不受被艾滋病削弱的免疫反應(yīng)影響 65 4、用于涂片陰性疑