藥物分析11第十一章抗生素類(lèi)藥物分析.ppt

第十一章 抗生素類(lèi)藥物的分析,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,在低微濃度下即可對(duì)某些生物（病原微生物）的生命活動(dòng)有特異抑制作用的化學(xué)物質(zhì)的總稱(chēng),內(nèi)酰胺類(lèi) 氨基糖苷類(lèi) 四環(huán)素類(lèi) 大環(huán)內(nèi)酯類(lèi) 多烯大環(huán)類(lèi) 多肽類(lèi),1. 抗生素（antibiotics）,2. 分 類(lèi),中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,一、概 述,化學(xué)純度較低 活性組分易發(fā)生變異 穩(wěn)定性差,3. 來(lái) 源,4. 抗生素的特點(diǎn),生產(chǎn)工藝復(fù)雜 發(fā)酵過(guò)程不易控制，易受污染,原因,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,一、概 述,采用生物學(xué)法與物理化學(xué)法 鑒別：理化方法、微生物法 檢查：水分、異常毒性、熱原、細(xì)菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)等 含量/效價(jià)測(cè)定： 微生物法 ： 與臨床療效吻合，靈敏度高，但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)； 理化方法： 準(zhǔn)確度與專(zhuān)屬性較高，且操作簡(jiǎn)便，但與臨床療效有偏差,5. 抗生素質(zhì)量分析,一、概 述,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,1. 化學(xué)結(jié)構(gòu),包括青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi),青霉素類(lèi)：6-APA為母核 頭孢菌素類(lèi)：7-ACA為母核,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,二、內(nèi)酰胺類(lèi),酸性較強(qiáng)（pKa 2.5-2.8） 臨床常用其堿金屬鹽 （水溶性好）,酸性(羧基),有多個(gè)手性碳,旋光性,青霉素類(lèi)：苯環(huán)取代基 頭孢菌素類(lèi)：母核有共軛結(jié)構(gòu),UV（共軛）,干燥條件較穩(wěn)定，溶液不穩(wěn)定,穩(wěn)定性(內(nèi)酰胺),2、主要 理化性質(zhì),降解 失效,氧化劑、酸、堿 酶、金屬離子、,青霉素,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,二、內(nèi)酰胺類(lèi),2、主要理化性質(zhì),中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,二、內(nèi)酰胺類(lèi),1）羥肟酸鐵反應(yīng)： 內(nèi)酰胺類(lèi) 羥肟酸 顯色 2）茚三酮反應(yīng) -氨基 藍(lán)紫色 3）雙縮脲反應(yīng) 內(nèi)酰胺類(lèi) 紫色 4）光譜法（UV、NMR） 5）色譜法（HPLC、TLC）,NH2OHHCl NaOH,茚三酮 ,堿性酒石酸銅,呈色反應(yīng),3、鑒 別,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,二、內(nèi)酰胺類(lèi),3、鑒 別-頭孢利定的NMR鑒別法 (JP14),NMR鑒別法,單峰信號(hào),取本品50mg溶于0.5ml重水中，測(cè)定NMR光譜時(shí)，應(yīng)顯示,多重峰信號(hào),多重峰信號(hào),= 3.8 附近,= 6.97.5,= 7.99.0,2,3,5,強(qiáng)度比,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,二、內(nèi)酰胺類(lèi),3、鑒 別-頭孢氨芐鑒別的TLC條件,CHP（2000）,5mg/ml 2l 硅膠G 0.1mol/L枸櫞酸液-0.2mol/LNa2HPO4-丙酮 (120:80:3) 0.1% 茚三酮溶液顯色,USP（24）,25mg/ml 5l 硅膠 醋酸乙酯-水-乙腈-冰HAc (48:18:14:14) 短波長(zhǎng)UV光檢出,BP（1999）,0.4%(W/V) 1l 硅烷化硅膠HF254 15.4% NH4Ac(pH6.2)-丙酮(85:15) 254nm 檢出,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,二、內(nèi)酰胺類(lèi),4、特殊雜質(zhì)檢查-聚合物、有關(guān)物質(zhì)、異構(gòu)體等,色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn),測(cè)定法,頭孢他啶中聚合物測(cè)定,頭孢呋辛酯中 有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查,色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn),異構(gòu)體和有關(guān)物質(zhì),舉 例：,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,二、內(nèi)酰胺類(lèi),頭孢他啶中聚合物測(cè)定-色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn),葡聚糖凝膠G-10,理論板數(shù)應(yīng)不低于900， 拖尾因子在0.751.5,254nm 檢 測(cè),流動(dòng)相A： 含3.5%硫酸銨 的0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液,藍(lán)色葡聚糖 2000,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,頭孢他啶中聚合物測(cè)定-色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn),葡聚糖凝膠G-10,峰面積的RSD應(yīng)小于5.0%,254nm 檢 測(cè),流動(dòng)相B： 0.01%十二烷基 硫酸鈉溶液,頭孢他啶 對(duì)照品溶液,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,頭孢他啶中聚合物測(cè)定-測(cè)定法,葡聚糖凝膠G-10,254nm 檢 測(cè),流動(dòng)相A： 含3.5%硫酸銨 的0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液,頭孢他啶樣品 （20mg/ml）,外標(biāo)法計(jì)算，本品含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計(jì)不得超過(guò)0.3%,AS,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,頭孢他啶中聚合物測(cè)定-測(cè)定法,葡聚糖凝膠G-10,254nm 檢 測(cè),流動(dòng)相B： 0.01%十二烷基 硫酸鈉溶液,頭孢他啶 對(duì)照品溶液,AR,外標(biāo)法計(jì)算，本品含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計(jì)不得超過(guò)0.3%,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查,頭孢呋辛酯A，B異構(gòu)體之間、頭孢呋辛酯A異構(gòu)體與頭孢呋辛酯2-異構(gòu)體之間的分離度應(yīng)大于1.5；,色譜條件：,ODS分析柱； 0.2mol/L磷酸二氫銨-甲醇（62:38）為流動(dòng)相； 流速1ml/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。,系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：,理論板數(shù)按頭孢呋辛酯A異構(gòu)體峰計(jì)算，應(yīng)不低于1500。,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,B異構(gòu)體峰的相對(duì)保留時(shí)間約為0.85， A異構(gòu)體峰的相對(duì)保留時(shí)間為1.0。 供試品色譜圖中, A異構(gòu)體峰的面積與A、B異構(gòu)體峰的面積和之比應(yīng)為0.480.55。,頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,異構(gòu)體,供試品溶液：0.2mg/ml(流動(dòng)相溶） 對(duì)照溶液:供試品溶液，加流動(dòng)相稀釋成6g/ml 對(duì)照溶液進(jìn)樣20l ，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿(mǎn)量程的10% 取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的2.5倍 供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，不得大于對(duì)照溶液主峰的面積,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查,有關(guān)物質(zhì),5、含量測(cè)定 -碘量法（ChP2000）,二、 內(nèi)酰胺類(lèi),中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,原理：青霉素與頭孢菌素本身不與碘反應(yīng)，但其堿性降解產(chǎn)物可消耗碘,青霉素族 頭孢菌素族,NaOH 水解,4I2H +,8I-,I2+2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6,定量過(guò)量,剩 余,5、含量測(cè)定,-碘量法（ChP2000）,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,反應(yīng)分兩步進(jìn)行：,水解反應(yīng) (按化學(xué)計(jì)算量進(jìn)行),氧化-還原反應(yīng) (無(wú)定量關(guān)系，受溫度、pH值和時(shí)間等因素影響， 應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)條件并采用標(biāo)準(zhǔn)品平行對(duì)照測(cè)定),5、含量測(cè)定,-碘量法（ChP2000）,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,因樣品中雜質(zhì)會(huì)消耗碘，故應(yīng)作空白試驗(yàn)。,加入樣品，不加堿； 其余試劑（醋酸鹽緩沖液，碘液，硫代硫酸鈉）都要加堿。,空白試驗(yàn):,空白試驗(yàn)與經(jīng)典空白試驗(yàn)不同：,5、含量測(cè)定,-碘量法（ChP2000）,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,試驗(yàn)條件:（I2氧化）,弱酸性（pH4.5）,20分鐘后，耗碘量隨時(shí)間的變化較小,堿 I2 IO3- + I- 酸 某些藥物與碘生成復(fù)鹽沉淀,溫度（2426）,溫度38 時(shí)未水解的供試品亦消耗碘,反應(yīng)時(shí)間：（ 20分鐘）,5、含量測(cè)定,-碘量法（ChP2000）,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,含量 對(duì)照品,V樣空 - V樣 W對(duì) V對(duì)空 - V對(duì) W樣,靈敏度高：樣品 : 碘 = 1 : 8 反應(yīng)條件、實(shí)驗(yàn)操作要求高,1份含量,V對(duì)、V對(duì)空 V樣、V樣空,加試劑次序、反應(yīng)時(shí)間、滴定速度相同,特 點(diǎn)：,5、含量測(cè)定,-電位配位滴定法（汞量法）,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,原理：青霉素不與汞鹽反應(yīng)，其堿性降解產(chǎn)物可與Hg2+絡(luò)和。,Hg+ + 2R-SH (RS)2Hg + 2H+,方法說(shuō)明： a、空白試驗(yàn)與碘量法類(lèi)似，加樣品，不加NaOH b、與碘量法相比，汞量法不需對(duì)照試驗(yàn),5、含量測(cè)定,-其他常用方法,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,酸堿滴定法：應(yīng)用廣泛,硫醇汞鹽法,羥肟酸比色法,HPLC法：應(yīng)用廣泛,5、含量測(cè)定,（例）-阿莫西林克拉維酸鉀片,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,阿莫西林峰與克拉維酸峰的分離度應(yīng)大于3.5,色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn),十八烷基硅烷鍵合硅膠,磷酸鹽緩沖液-甲醇(95:5) 流速為0.7ml/min；,檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm,5、含量測(cè)定,（例）-阿莫西林克拉維酸鉀片,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,取本品10片，置1000ml量瓶中，加水適量，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖； 另取阿莫西林對(duì)照品與克拉維酸對(duì)照品各適量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉維酸0.25mg的混合溶液，同法測(cè)定。 按外標(biāo)法以峰面積分別計(jì)算供試品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。,測(cè) 定 法 ：,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,1. 化學(xué)結(jié)構(gòu),三、氨基糖苷類(lèi),都是以氨基環(huán)醇與氨基糖縮合而成的苷； 分子結(jié)構(gòu)中都含有多羥基； 均為堿性抗生素；,鏈霉素,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,臨床應(yīng)用其硫酸鹽,堿性(氨基),（糖）：有多個(gè)手性碳,旋光性(糖),水 溶 性,溶解度(氨基、羥基),強(qiáng)酸、堿條件均可水解,穩(wěn)定性(苷),2、主要 理化性質(zhì),三、氨基糖苷類(lèi),中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,3、鑒 別,三、氨基糖苷類(lèi),茚三酮反應(yīng)：具羥基胺類(lèi)，-氨基酸性質(zhì),鏈霉素 + 水和茚三酮 藍(lán)紫色,鏈霉素 N-甲基葡萄糖胺,N-甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan）反應(yīng)：,紅 色,水解,對(duì)二甲氨基苯甲醛,乙酰丙酮 OH-,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,8-羥基喹啉 NaOBr,坂口（Sakaguchi）反應(yīng)：(鏈霉胍特有）,麥芽酚（Maltol)反應(yīng)：(鏈霉糖特有）,三、氨基糖苷類(lèi) -鑒別,鏈霉素 麥芽酚 紫紅色,鏈霉素 鏈霉胍 橙紅,硫酸鹽反應(yīng),或-萘酚,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,4、檢 查-,來(lái) 源：,發(fā)酵中產(chǎn)生,BP:,薄層色譜法（雜質(zhì)對(duì)照品法）,要求：NC2 2000，C2a峰和C2峰的分離度應(yīng)符合要求，重復(fù)進(jìn)樣RSD2.0%,三、氨基糖苷類(lèi),鏈霉素中鏈霉素B的檢查,慶大霉素C 組分測(cè)定（系統(tǒng)適用性試驗(yàn)）,色譜柱：ODS,流動(dòng)相： H2O-HAc-MeOH配制的庚烷磺酸鈉溶液(0.2M)，必要時(shí)調(diào)節(jié)甲醇的含量。,檢測(cè)波長(zhǎng)： 330nm（鄰苯二甲醛柱前衍生）,4、含 量 檢 測(cè),三、氨基糖苷類(lèi),氨基糖苷類(lèi) 含量檢測(cè),微生物法、HPLC法等,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,四、四環(huán)素類(lèi),1. 化學(xué)結(jié)構(gòu),中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,四、四環(huán)素類(lèi),-OH：酸性 N(CH3)2：堿性 與酸、堿均可成鹽 臨床多用鹽酸鹽,兩 性,旋光性,易發(fā)生異構(gòu)化，降解等反應(yīng)，性質(zhì)不穩(wěn)定,穩(wěn)定性,酚羥基、烯醇基與Ca2+、Mg2+絡(luò)合顯色,與金屬離子絡(luò)合,2、主要 理化性質(zhì),UV和熒光,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,四、四環(huán)素類(lèi),2. 主要理化性質(zhì),堿 性 C環(huán)開(kāi)環(huán)，形成內(nèi)酯 異四環(huán)素,弱酸性（pH2-6） A環(huán)C-4異構(gòu)化 差向四環(huán)素,酸性（pH 2） C環(huán)脫水 脫水四環(huán)素,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,四、四環(huán)素類(lèi),差向異構(gòu)體,異四環(huán)素,OH-,四、四環(huán)素類(lèi),中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,中 國(guó) 藥 科 大 學(xué) 藥 學(xué) 院 藥 分 教 研 室,四、四環(huán)素類(lèi),3. 鑒 別,1）濃硫酸反應(yīng) 2）F