藥物分析11第十一章抗生素類藥物分析.ppt

第十一章 抗生素類藥物的分析,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,在低微濃度下即可對某些生物（病原微生物）的生命活動有特異抑制作用的化學物質的總稱,內酰胺類 氨基糖苷類 四環(huán)素類 大環(huán)內酯類 多烯大環(huán)類 多肽類,1. 抗生素（antibiotics）,2. 分 類,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,一、概 述,化學純度較低 活性組分易發(fā)生變異 穩(wěn)定性差,3. 來 源,4. 抗生素的特點,生產工藝復雜 發(fā)酵過程不易控制，易受污染,原因,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,一、概 述,采用生物學法與物理化學法 鑒別：理化方法、微生物法 檢查：水分、異常毒性、熱原、細菌內毒素、降壓物質等 含量/效價測定： 微生物法 ： 與臨床療效吻合，靈敏度高，但操作復雜費時； 理化方法： 準確度與專屬性較高，且操作簡便，但與臨床療效有偏差,5. 抗生素質量分析,一、概 述,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,1. 化學結構,包括青霉素類和頭孢菌素類,青霉素類：6-APA為母核 頭孢菌素類：7-ACA為母核,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,二、內酰胺類,酸性較強（pKa 2.5-2.8） 臨床常用其堿金屬鹽 （水溶性好）,酸性(羧基),有多個手性碳,旋光性,青霉素類：苯環(huán)取代基 頭孢菌素類：母核有共軛結構,UV（共軛）,干燥條件較穩(wěn)定，溶液不穩(wěn)定,穩(wěn)定性(內酰胺),2、主要 理化性質,降解 失效,氧化劑、酸、堿 酶、金屬離子、,青霉素,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,二、內酰胺類,2、主要理化性質,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,二、內酰胺類,1）羥肟酸鐵反應： 內酰胺類 羥肟酸 顯色 2）茚三酮反應 -氨基 藍紫色 3）雙縮脲反應 內酰胺類 紫色 4）光譜法（UV、NMR） 5）色譜法（HPLC、TLC）,NH2OHHCl NaOH,茚三酮 ,堿性酒石酸銅,呈色反應,3、鑒 別,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,二、內酰胺類,3、鑒 別-頭孢利定的NMR鑒別法 (JP14),NMR鑒別法,單峰信號,取本品50mg溶于0.5ml重水中，測定NMR光譜時，應顯示,多重峰信號,多重峰信號,= 3.8 附近,= 6.97.5,= 7.99.0,2,3,5,強度比,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,二、內酰胺類,3、鑒 別-頭孢氨芐鑒別的TLC條件,CHP（2000）,5mg/ml 2l 硅膠G 0.1mol/L枸櫞酸液-0.2mol/LNa2HPO4-丙酮 (120:80:3) 0.1% 茚三酮溶液顯色,USP（24）,25mg/ml 5l 硅膠 醋酸乙酯-水-乙腈-冰HAc (48:18:14:14) 短波長UV光檢出,BP（1999）,0.4%(W/V) 1l 硅烷化硅膠HF254 15.4% NH4Ac(pH6.2)-丙酮(85:15) 254nm 檢出,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,二、內酰胺類,4、特殊雜質檢查-聚合物、有關物質、異構體等,色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗,測定法,頭孢他啶中聚合物測定,頭孢呋辛酯中 有關物質和異構體的檢查,色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗,異構體和有關物質,舉 例：,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,二、內酰胺類,頭孢他啶中聚合物測定-色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗,葡聚糖凝膠G-10,理論板數(shù)應不低于900， 拖尾因子在0.751.5,254nm 檢 測,流動相A： 含3.5%硫酸銨 的0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液,藍色葡聚糖 2000,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,頭孢他啶中聚合物測定-色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗,葡聚糖凝膠G-10,峰面積的RSD應小于5.0%,254nm 檢 測,流動相B： 0.01%十二烷基 硫酸鈉溶液,頭孢他啶 對照品溶液,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,頭孢他啶中聚合物測定-測定法,葡聚糖凝膠G-10,254nm 檢 測,流動相A： 含3.5%硫酸銨 的0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液,頭孢他啶樣品 （20mg/ml）,外標法計算，本品含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計不得超過0.3%,AS,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,頭孢他啶中聚合物測定-測定法,葡聚糖凝膠G-10,254nm 檢 測,流動相B： 0.01%十二烷基 硫酸鈉溶液,頭孢他啶 對照品溶液,AR,外標法計算，本品含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計不得超過0.3%,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,頭孢呋辛酯中有關物質和異構體的檢查,頭孢呋辛酯A，B異構體之間、頭孢呋辛酯A異構體與頭孢呋辛酯2-異構體之間的分離度應大于1.5；,色譜條件：,ODS分析柱； 0.2mol/L磷酸二氫銨-甲醇（62:38）為流動相； 流速1ml/min； 檢測波長278 nm。,系統(tǒng)適用性試驗：,理論板數(shù)按頭孢呋辛酯A異構體峰計算，應不低于1500。,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,B異構體峰的相對保留時間約為0.85， A異構體峰的相對保留時間為1.0。 供試品色譜圖中, A異構體峰的面積與A、B異構體峰的面積和之比應為0.480.55。,頭孢呋辛酯中有關物質和異構體的檢查,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,異構體,供試品溶液：0.2mg/ml(流動相溶） 對照溶液:供試品溶液，加流動相稀釋成6g/ml 對照溶液進樣20l ，調節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10% 取供試品溶液和對照品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的2.5倍 供試品溶液如顯雜質峰，量取各雜質峰面積的和，不得大于對照溶液主峰的面積,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,頭孢呋辛酯中有關物質和異構體的檢查,有關物質,5、含量測定 -碘量法（ChP2000）,二、 內酰胺類,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,原理：青霉素與頭孢菌素本身不與碘反應，但其堿性降解產物可消耗碘,青霉素族 頭孢菌素族,NaOH 水解,4I2H +,8I-,I2+2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6,定量過量,剩 余,5、含量測定,-碘量法（ChP2000）,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,反應分兩步進行：,水解反應 (按化學計算量進行),氧化-還原反應 (無定量關系，受溫度、pH值和時間等因素影響， 應嚴格控制反應條件并采用標準品平行對照測定),5、含量測定,-碘量法（ChP2000）,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,因樣品中雜質會消耗碘，故應作空白試驗。,加入樣品，不加堿； 其余試劑（醋酸鹽緩沖液，碘液，硫代硫酸鈉）都要加堿。,空白試驗:,空白試驗與經典空白試驗不同：,5、含量測定,-碘量法（ChP2000）,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,試驗條件:（I2氧化）,弱酸性（pH4.5）,20分鐘后，耗碘量隨時間的變化較小,堿 I2 IO3- + I- 酸 某些藥物與碘生成復鹽沉淀,溫度（2426）,溫度38 時未水解的供試品亦消耗碘,反應時間：（ 20分鐘）,5、含量測定,-碘量法（ChP2000）,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,含量 對照品,V樣空 - V樣 W對 V對空 - V對 W樣,靈敏度高：樣品 : 碘 = 1 : 8 反應條件、實驗操作要求高,1份含量,V對、V對空 V樣、V樣空,加試劑次序、反應時間、滴定速度相同,特 點：,5、含量測定,-電位配位滴定法（汞量法）,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,原理：青霉素不與汞鹽反應，其堿性降解產物可與Hg2+絡和。,Hg+ + 2R-SH (RS)2Hg + 2H+,方法說明： a、空白試驗與碘量法類似，加樣品，不加NaOH b、與碘量法相比，汞量法不需對照試驗,5、含量測定,-其他常用方法,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,酸堿滴定法：應用廣泛,硫醇汞鹽法,羥肟酸比色法,HPLC法：應用廣泛,5、含量測定,（例）-阿莫西林克拉維酸鉀片,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,阿莫西林峰與克拉維酸峰的分離度應大于3.5,色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗,十八烷基硅烷鍵合硅膠,磷酸鹽緩沖液-甲醇(95:5) 流速為0.7ml/min；,檢測波長為220nm,5、含量測定,（例）-阿莫西林克拉維酸鉀片,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,取本品10片，置1000ml量瓶中，加水適量，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖； 另取阿莫西林對照品與克拉維酸對照品各適量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉維酸0.25mg的混合溶液，同法測定。 按外標法以峰面積分別計算供試品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。,測 定 法 ：,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,1. 化學結構,三、氨基糖苷類,都是以氨基環(huán)醇與氨基糖縮合而成的苷； 分子結構中都含有多羥基； 均為堿性抗生素；,鏈霉素,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,臨床應用其硫酸鹽,堿性(氨基),（糖）：有多個手性碳,旋光性(糖),水 溶 性,溶解度(氨基、羥基),強酸、堿條件均可水解,穩(wěn)定性(苷),2、主要 理化性質,三、氨基糖苷類,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,3、鑒 別,三、氨基糖苷類,茚三酮反應：具羥基胺類，-氨基酸性質,鏈霉素 + 水和茚三酮 藍紫色,鏈霉素 N-甲基葡萄糖胺,N-甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan）反應：,紅 色,水解,對二甲氨基苯甲醛,乙酰丙酮 OH-,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,8-羥基喹啉 NaOBr,坂口（Sakaguchi）反應：(鏈霉胍特有）,麥芽酚（Maltol)反應：(鏈霉糖特有）,三、氨基糖苷類 -鑒別,鏈霉素 麥芽酚 紫紅色,鏈霉素 鏈霉胍 橙紅,硫酸鹽反應,或-萘酚,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,4、檢 查-,來 源：,發(fā)酵中產生,BP:,薄層色譜法（雜質對照品法）,要求：NC2 2000，C2a峰和C2峰的分離度應符合要求，重復進樣RSD2.0%,三、氨基糖苷類,鏈霉素中鏈霉素B的檢查,慶大霉素C 組分測定（系統(tǒng)適用性試驗）,色譜柱：ODS,流動相： H2O-HAc-MeOH配制的庚烷磺酸鈉溶液(0.2M)，必要時調節(jié)甲醇的含量。,檢測波長： 330nm（鄰苯二甲醛柱前衍生）,4、含 量 檢 測,三、氨基糖苷類,氨基糖苷類 含量檢測,微生物法、HPLC法等,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,四、四環(huán)素類,1. 化學結構,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,四、四環(huán)素類,-OH：酸性 N(CH3)2：堿性 與酸、堿均可成鹽 臨床多用鹽酸鹽,兩 性,旋光性,易發(fā)生異構化，降解等反應，性質不穩(wěn)定,穩(wěn)定性,酚羥基、烯醇基與Ca2+、Mg2+絡合顯色,與金屬離子絡合,2、主要 理化性質,UV和熒光,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,四、四環(huán)素類,2. 主要理化性質,堿 性 C環(huán)開環(huán)，形成內酯 異四環(huán)素,弱酸性（pH2-6） A環(huán)C-4異構化 差向四環(huán)素,酸性（pH 2） C環(huán)脫水 脫水四環(huán)素,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,四、四環(huán)素類,差向異構體,異四環(huán)素,OH-,四、四環(huán)素類,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,中 國 藥 科 大 學 藥 學 院 藥 分 教 研 室,四、四環(huán)素類,3. 鑒 別,1）濃硫酸反應 2）F