【精品論文】MDP 對(duì)煙曲霉孢子刺激 A549 細(xì)胞分泌.doc

精品論文mdp 對(duì)煙曲霉孢子刺激 a549 細(xì)胞分泌tnf-的影響張輝軍1，王葆青1，瞿介明25（1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海，200032；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院呼吸科，上海，200040）摘要：目的 研究胞壁酰二肽（mdp）對(duì)煙曲霉（af）孢子刺激 a549 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的 影響及其可能機(jī)制。方法 1 透射電鏡觀察 a549 細(xì)胞吞噬 af 孢子；2 realtime pcr 檢測(cè)10煙曲霉孢子刺激 a549 細(xì)胞后 nod2 mrna 表達(dá)；3 免疫熒光法檢測(cè)煙曲霉孢子刺激 a549細(xì)胞后 nod2 蛋白的表達(dá)；4 realtime pcr 檢測(cè) mdp 對(duì)煙曲霉孢子刺激 a549 細(xì)胞分泌細(xì) 胞因子的影響。 結(jié)果 1 a549 細(xì)胞能夠吞噬煙曲霉孢子；2 a549 細(xì)胞吞噬煙曲霉孢子后 24h細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白 2（nod2） mrna 表達(dá)顯著增加（p0.05）；3 a549細(xì)胞吞噬煙曲霉孢子后 24h 細(xì)胞內(nèi) nod2 蛋白表達(dá)增加；4 mdp 聯(lián)合 af 孢子刺激能顯著15增強(qiáng) a549 細(xì)胞 tnfmrna 的表達(dá)（p0.05）。結(jié)論 mdp 刺激可顯著增加吞噬 af 孢 子的 a549 細(xì)胞分泌 tnf，其作用可能是通過 nod2 對(duì) af 孢子的識(shí)別來實(shí)現(xiàn)的。關(guān)鍵詞： 免疫學(xué)； 胞壁酰二肽；煙曲霉；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白 2；中圖分類號(hào)：r392.120the effect of mdp on the secretion of tnf- by a549 cellsstimulated with heat-killed aspergillus fumigatus conidiazhang huijun1, wang baoqing1, qu jieming2(1. department of pulmonary medicine,zhongshan hospital,fudan university,shanghai,200032;2. department of pulmonary medicine,huadong hospital,fudan university,shanghai,200040)25abstract: objective to study the influence of mdp (specific ligand of nod2) on the cytokine secretion by a549 cells stimulated with heat-killed conidia and the possible mechanisms. methods(1) the cell lines a549 cells was incubated with aspergillus fumigatus conidia and then the phagocytosis were examined with a transmission electron microscope(tem) at different timepoints.（2）real time pcr was performed to study the expression of nod2 mrna in a54930cells after incubated with aspergillus fumigatus conidia at different time points. （ 3 ）immunofluorescence was also performed to examine the expressin of nod2 protein in a549 cells after exposed to conidia 24 h .（4）real time pcr was performed to quantify the expression of tnf mrna for evaluating the influence of mdp on the cytokine secretion by cellsstimulated with heat-killed conidia. results (1).the internalized heat-killed aspergillus fumigatus35conidia could be seen in a549 cells after10h of inculbation with conidia. (2). the expression ofnod2 mrna was upregulated significantly after incubated with aspergillus fumigatus conidia24h compared with unstimulated cells（p0.05）（3）the expression of nod2 protein wasupregulated after exposed to aspergillus fumigatus conidia 24h.（4）mdp combined with heat-killed conidia can significantly (p 0.05) increased the expression of tnf mrna.40conclusions mdp stimulation can significantly increased the secretion of tnf in a549 cellsincubated with aspergillus fumigatus conidia. and the relationship between nod2 proteins and the immune recognition of aspergillus fumigatus conidia may be involved in this process.key words:immunology;mdp;aspergillus fumigatus;nucleotide bindingoligomerization domain proteins 2基金項(xiàng)目：教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)-新教師基金資助（項(xiàng)目編號(hào)：20090071120029）作者簡介：張輝軍（1972-8），男，主治醫(yī)師，肺部感染通信聯(lián)系人：瞿介明（1964-9），男，教授，肺部感染. e-mail: - 7 -450引言侵襲性肺曲霉菌?。╥nvasive pulmonary aspergillosis ，ipa）是嚴(yán)重威脅免疫受損宿主生命的感染性疾病，目前缺乏敏感和特異的診斷方法，抗真菌治療成功率低，其死亡率在中 性粒細(xì)胞減少患者超過 50%，在骨髓移植患者中達(dá) 90% 1。胞壁酰二肽（mdp）作為免疫 調(diào)節(jié)劑早已為人們所了解，已經(jīng)有大量的研究證實(shí)其對(duì)病原體感染和腫瘤的治療能夠產(chǎn)生有50益的免疫調(diào)節(jié)作用。本研究觀察 mdp 對(duì)煙曲霉孢子刺激 a549 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響， 以探索治療 ipa 的新途徑。0.1資料與方法11 材料 煙曲霉菌株由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科真菌研究室惠贈(zèng)。人肺腺癌細(xì)胞株a549細(xì)55胞由中山醫(yī)院肝癌研究所孫瑞霞老師惠贈(zèng)。trizoltm 及real-pcr相關(guān)試劑購自invitrogen公 司。elisa試劑盒購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。12 方法121af孢子收獲 將af菌株接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)基，37培養(yǎng)4d，超凈工作臺(tái)內(nèi)生理 鹽水沖洗培養(yǎng)基表面，收集分生孢子懸液，8層紗布過濾以去除菌絲。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子60數(shù)量。孢子懸液轉(zhuǎn)入離心管中，3000rpm離心15min。去除上清，孢子重懸于生理鹽水（ns） 中，調(diào)整孢子懸液濃度為6.7109ml。煮沸1小時(shí)滅活，將收獲的孢子懸液稀釋100倍接種 沙氏瓊脂培養(yǎng)基以檢測(cè)孢子活性。122細(xì)胞培養(yǎng)：a549細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)基用dmem完全培養(yǎng)液。細(xì)胞密度在7595 時(shí)傳代，傳代細(xì)胞密度不超過24104/ml。所有細(xì)胞傳代工作均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。細(xì)65胞置于co2培養(yǎng)箱（37，5co2）培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至所需密度時(shí)待用。123透射電鏡檢查：試驗(yàn)前一天a549細(xì)胞傳代接種于25cm2培養(yǎng)瓶，使得實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞密度7090。將滅活的煙曲霉孢子混勻，以細(xì)胞：孢子1：10的比例加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，于10h后收取細(xì)胞送透射電鏡觀察并攝片。124 real-time pcr70nod2基因引物合成：文獻(xiàn)檢索獲得引物序列（表1），應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件primer primer5.0和pubmed blast 驗(yàn)證引物，rtpcr產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)目的條帶大小符合， 無明顯雜帶。將 a549 細(xì)胞調(diào)整濃度為 24105/ml，接種于 24 孔培養(yǎng)板，每孔 1ml，24h 后細(xì)胞密 度達(dá) 80左右。實(shí)驗(yàn)前 2h 更換等量新鮮培養(yǎng)液，孢子以 1：10 的比例將滅活的 af 孢子加75入細(xì)胞培養(yǎng)液中，晃動(dòng)培養(yǎng)板使孢子混勻。分別于 0h、24h、48h 收取細(xì)胞檢測(cè) nod2mrna表達(dá)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè) 6 孔。表 1 定量 pcr 引物序列80tab.1 primer sequencegeneprimer sense(5一 3)primer antisense(5一 3)lengthnod2gaagtacatccgcaccgaggacaccatccatgagaagac ag174bptnf-ggtttcgaagtggtggtcttgcctgccccaatccctttatt131bpgapdhggtatcgtggaaggactcatgacatgccagtgagcttcccgttcagc188bp125 免疫熒光觀察煙曲霉孢子刺激后 nod2 蛋白的表達(dá)（1）細(xì)胞培養(yǎng)。（2）將多聚賴氨酸處理過的波片超凈工作臺(tái)內(nèi)紫外燈照射 30min。放入 12 孔板中。a549細(xì)胞調(diào)整密度為 2105/ml,將細(xì)胞懸液滴在波片上，每孔 500 l 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)85培養(yǎng) 24h。（3）24h 后分別處理 3 組細(xì)胞，a 不處理 b 加入 1：10 的煙曲霉孢子 c 加入終濃度為 25ng/ml的 lps。刺激 24h 后收取細(xì)胞做免疫熒光檢測(cè)。126real-time pcr 檢測(cè) a549 細(xì)胞 tnf mrna 表達(dá)（1）tnf-基因引物合成：文獻(xiàn)檢索獲得引物序列（表1），應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件primer primer905.0和pubmed blast 驗(yàn)證引物，rtpcr產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)目的條帶大小符合， 無明顯雜帶。（2）a549 細(xì)胞培養(yǎng)。（3）細(xì)胞分組(表2)：細(xì)胞分4組，每組6孔，接種于24孔板，每孔加培養(yǎng)液500 l，每孔細(xì) 胞數(shù)2.5105，24h后更換新鮮完全培養(yǎng)液，總量50 l的 optimem中按表1分別加入mdp和95/或滅活af孢子，室溫靜置20min，加入培養(yǎng)液中，搖勻。24h后收取細(xì)胞，realtime pcr檢測(cè)tnf mrna表達(dá)。100表2 細(xì)胞分組105tab.2 cell groupscon 組mdp 組af 組mdpaf 組lipofectaminetm2000/孔0.5 l0.5 l0.5 l0.5 lmdp1.25 l1.25 l滅活 af 孢子（cell：af）1：51：5optimem/孔補(bǔ)足 50 l補(bǔ)足 50 l補(bǔ)足 50 l補(bǔ)足 50 l1.3 統(tǒng)計(jì)分析采用spss 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析， p0.05為有顯著差異。2 結(jié)果2.1 透射電鏡觀察 a549 細(xì)胞吞噬 af 孢子110a549細(xì)胞培養(yǎng)液中加入1：10的af孢子刺激后10h送透攝電鏡觀察，細(xì)胞內(nèi)即可見到吞噬的孢子（圖1）。ab115120125圖 1 a549 細(xì)胞吞噬煙曲霉孢子透攝電鏡照片fig.1 transmission electron micrographs of a549 cells after incubation with heat-killed af conidia.a4000 b 8400.1302.2real-time pcr 結(jié)果a549 細(xì)胞吞噬 af 孢子后 24h nod2mrna 表達(dá)顯著上調(diào)，與 0h 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。48h 時(shí) nod2mrna 表達(dá)較 24h 時(shí)下降。（圖 2）135140*9.00e-058.00e-057.00e-056.00e-05copy5.00e-054.00e-053.00e-052.00e-05 1.00e-050.00e+000h24h48h time points145圖 2 real-time pcr 檢測(cè) a549 細(xì)胞吞噬 af 孢子后 nod2mrna 表達(dá)fig.2 detection of nod2mrna by real-time pcr1502.3免疫熒光結(jié)果將 a549 細(xì)胞爬片后分別予 25ng/ml lps 和 1：10 的 af 孢子刺激并設(shè)立空白對(duì)照組，24h 后免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察攝片。細(xì)胞核 dipa 染色，發(fā)藍(lán)色熒光，nod2 蛋白 羅達(dá)明染色，發(fā)橙紅色熒光。af 孢子和 lps 刺激后 nod2 蛋白表達(dá)明顯增加（圖 3 af)。aba 空白對(duì)照組細(xì)胞核 dipa 染色b 空白對(duì)照組 nod2 蛋白表達(dá)cdc af 刺激組細(xì)胞核 dipa 染色d af 刺激組 nod2 蛋白表達(dá)ef155e lps 刺激組細(xì)胞核 dipa 染色f lps 刺激組 nod2 蛋白表達(dá)圖 3 免疫熒光攝片 nod2 蛋白表達(dá)fig.3 detection of nod2 proteins by immunofluorescence technique16024mdp 和 af 孢子分別單獨(dú)刺激 a549 細(xì)胞，細(xì)胞中 tnf- mrna 表達(dá)較空白對(duì)照組（con）升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p 0.05）。當(dāng) mdp 聯(lián)合 af 孢子刺激時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中 tnf- mrna表達(dá)與空白對(duì)照組、mdp 單獨(dú)刺激組和 af 孢子單獨(dú)刺激組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（p0.05）。（圖 4）0.012*ratio to gapdh0.010.0080.0060.0040.0020conmdpafaf+mdp1653 討論圖 4 real-time pcr 檢測(cè) a549 細(xì)胞中 tnf-a的 mrna 表達(dá)fig.4 detection of tnf-a mrna by real-time pcrmdp 同時(shí)存在于革蘭陰性和陽性細(xì)菌胞壁的 pgn 的降解產(chǎn)物中，早在 20 世紀(jì) 70 年代 就被發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)作用2。許多研究結(jié)果提示 mdp 能夠直接誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從 而對(duì)免疫和炎癥反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。但是這些結(jié)果存在著爭(zhēng)論，在不同物種、不同細(xì)胞類型，170175180185190195200205210其結(jié)果可能不同。在體外實(shí)驗(yàn)中，幾種動(dòng)物模型證實(shí) mdp 可提高機(jī)體的非特異性免疫，從而降低傷寒桿菌、克雷伯桿菌、白色念珠菌及原蟲感染動(dòng)物的死亡率3。研究證實(shí) mdp 為 nod2 的配體4。nod2 屬于 nod 蛋白家族，主要參與細(xì)胞內(nèi)病原 體的識(shí)別。nod2 又稱為 card15，僅表達(dá)于中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞中。現(xiàn)已 證實(shí) nod 蛋白在機(jī)體抗細(xì)菌感染免疫中起重要作用58。coulombe f 等人研究發(fā)現(xiàn) mdp 可提高流感病毒感染的小鼠的存活率，減少病毒負(fù)荷和肺組織炎癥，并且這種作用與 nod2 有關(guān)9。但迄今為止有關(guān) nod 蛋白與真菌感染免疫方面的研究少有報(bào)道。我們的研究發(fā)現(xiàn) 當(dāng) a549 細(xì)胞吞噬煙曲霉孢子之后細(xì)胞內(nèi) nod2 mrna 及蛋白表達(dá)水平增高，提示 nod2 蛋白表達(dá)可能與 af 孢子刺激有關(guān)。tnf 在機(jī)體抗煙曲霉感染中的作用已經(jīng)有大量詳細(xì)的研究，研究顯示在 ipa 的動(dòng)物 模型中需要 tnf 來啟動(dòng)先天性免疫防御系統(tǒng)10。a549 細(xì)胞是肺上皮細(xì)胞來源的肺腺癌 細(xì)胞，國內(nèi)外研究中多用其來代替肺泡上皮細(xì)胞。以往的研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞在抵御煙曲 霉感染中不僅被動(dòng)的發(fā)揮免疫屏障作用，還能吞噬煙曲霉孢子，分泌細(xì)胞因子，啟動(dòng)先天性 免疫防御系統(tǒng)，發(fā)揮積極抗煙曲霉感染的作用。本研究觀察到當(dāng) af 孢子單獨(dú)刺激 a549 細(xì) 胞，tnf- 的分泌僅輕度增加，當(dāng) mdp 聯(lián)合 af 孢子刺激 a549 細(xì)胞時(shí) tnf 的釋放顯 著增加。該結(jié)果提示 mdp 在 nod2 活化的基礎(chǔ)上能夠顯著促進(jìn)被刺激細(xì)胞的 tnf 分泌。綜上所述我們的研究發(fā)現(xiàn)，mdp 刺激可顯著增加吞噬 af 孢子的 a549 細(xì)胞分泌 tnf- ，其作用可能是通過 nod2 對(duì) af 孢子的識(shí)別來實(shí)現(xiàn)的。以往的研究和我們的研究結(jié)果均 提示 mdp 有希望成為一種治療煙曲霉感染的新的輔助藥物。參考文獻(xiàn) (references)1kousha m, tadi r, soubani ao. pulmonary aspergillosis: a clinical reviewj. eur respir rev,2011,20(121):156-74.2 ellouz f, adam a, ciorbaru r, lederer e. minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivativesj. biochem biophys res commun, 1974,59(4):1317-13253 traub s, von aulock s, hartung t, et al. mdp and other muropeptides-direct and synergistic effects on theimmune systemj. j endotoxin res, 2006,12(2):69-85.4 grimes cl, ariyananda lde z, melnyk je,et al. the innate immune protein nod2 binds directly to mdp, a bacterial cell wall fragmentj. am chem soc, 2012,134(33):13535-13537.5 berrington wr, iyer r, wells rd, et al. nod1 and nod2 regulation of pulmonary innate immunity tolegionella pneumophilaj. eur j immunol, 2010,40(12):3519-35276 geddes