【精品論文】白細(xì)胞介素-17A 在大鼠急性胰腺炎胰腺損.doc

精品論文白細(xì)胞介素-17a 在大鼠急性胰腺炎胰腺損傷中的作用倪建波1，胡國(guó)勇2，熊杰1，萬(wàn)榮1，王興鵬25（1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200072；2. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200080） 摘要：【目的】研究促炎因子白細(xì)胞介素-17a 在急性壞死性胰腺炎模型中的表達(dá)及其參與 胰腺腺泡細(xì)胞壞死的分子機(jī)制。【方法】利用基因芯片、實(shí)時(shí)熒光定量 pcr、western-blot、 elisa 和免疫組化等方法檢測(cè)白介素-17a 在 3%牛磺膽酸誘導(dǎo)的大鼠急性壞死性胰腺炎模10型中的表達(dá)變化及定位。用重組大鼠白介素-17a 細(xì)胞因子分別刺激大鼠胰腺腺泡細(xì)胞及星 狀細(xì)胞，檢測(cè)白介素-17a 的下游靶基因包括促炎因子白介素-6、白介素-1 以及 c-x-c 家族 趨化因子在 mrna 水平的表達(dá)變化，及其對(duì)腺泡細(xì)胞壞死的作用?！窘Y(jié)果】在 3%?；悄懰嵴T導(dǎo)的急性胰腺炎模型中，白介素-17a 的表達(dá)顯著上調(diào)且主要表達(dá)于間質(zhì)炎性細(xì)胞、損傷的腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管樣復(fù)合體中；重組大鼠白介素-17a 刺激大鼠腺泡細(xì)胞及星狀細(xì)胞表達(dá)白15介素-6、白介素-1 以及趨化因子 cxcl1、cxcl2 以及 cxcl5，并誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞發(fā)生壞死。【結(jié)論】白介素-17a 在 3%?；悄懰嵴T導(dǎo)的大鼠急性壞死性胰腺炎模型中表達(dá)顯著上調(diào)，并 通過(guò)誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞及星狀細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子白介素-6、白介素-1 和趨化因子 cxcl1、 cxcl2 及 cxcl5 放大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞壞死。關(guān)鍵詞：急性胰腺炎；白介素-17a；壞死；炎癥20中圖分類(lèi)號(hào)：r576involvement of interleukin-17a in pancreatic damage in rat experimental acute necrotizing pancreatitisni jianbo1, hu guoyong2, xiong jie1, wan rong1, wang xingpeng225(1. department of gastroenterology,shanghai tenth peoples hospital, tongji university schoolof medicine, shanghai 200072;2. department of gastroenterology,shanghai first peoples hospital, shanghai jiaotonguniversity school of medicine, shanghai 200080)abstract: 【objects】 interleukin (il)-17a is a pro-inflammatory cytokine, which has recently30attracted much interest due to its pathogenic role in various inflammatory conditions such as ischemia/reperfusion injury, chronic inflammation and autoimmune diseases, but the role of il-17a in acute pancreatitis remains unclear. this study aimed to investigate the role of il-17a inexperimental acute necrotizing pancreatitis (anp). 【methods】 we analysed the expression ofil-17a during the pathogenesis of anp in vivo induced by 3% sodium taurocholate (natc), by35microarray test, qrt-pcr, western blotting, elisa, and immunohistochemistry. the effects ofil-17a on pancreatic acinar cells and pancreatic stellate cells (pscs) were further investigated in vitro using recombinant rat il-17a (ril-17a). 【results】expression of il-17a was significantlyincreased following experimental ap. in addition, ril-17a induced rat pancreatic acinar cell necrosis and promoted expression of several target genes, including il-6, il-1, cxcl1,40cxcl2, and cxcl5, in acinar cells and pscs. 【conclusion】 these findings suggest thatil-17a may be involved in pancreatic damage by regulating the expression of inflammatory cytokines and chemokines during experimental acute pancreatitis.keywords: interleukin-17a; acute pancreatitis; necrosis; inflammation基金項(xiàng)目：高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（編號(hào) 20090072110022）作者簡(jiǎn)介：倪建波，（1987-），男，博士研究生，急性胰腺炎的基礎(chǔ)研究。通信聯(lián)系人：王興鵬，（1965-），男，教授，胰腺疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。e-mail: - 5 -450引言急性胰腺炎是一個(gè)常見(jiàn)的炎癥性疾病，其發(fā)病率正在逐年上升1。急性胰腺炎的主要病 理過(guò)程包括胰腺及胰腺外器官的炎癥、水腫和壞死。急性胰腺炎的嚴(yán)重程度可能與胰腺腺泡 細(xì)胞損傷后的一系列事件有密切關(guān)系2。胰腺腺泡細(xì)胞自身能夠合成和釋放炎癥因子，包括 炎癥性細(xì)胞因子和趨化因子，它們能夠招募炎癥細(xì)胞諸如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞3, 4。炎癥50細(xì)胞的募集和激活可進(jìn)一步引起腺泡細(xì)胞損傷和炎癥因子如 tnf-，il-1和 il-65。隨著 炎癥因子產(chǎn)生和釋放的增加，局限在胰腺的炎癥反應(yīng)可進(jìn)一步發(fā)展為全身炎癥反應(yīng)綜合癥 (sirs)，后者是決定該疾病死亡率的重要因素1, 3。白細(xì)胞介素（il）-17 家族由 6 個(gè)成員組成，即 il-17a-f6。其中，il-17a 被認(rèn)為是 th17細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子7。除了 th17 細(xì)胞，激活的單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和中性粒細(xì)胞都55能合成 il-17a8。il-17a 在自身免疫性疾病和炎癥性疾病，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸 病、心肌缺血/再灌注損傷以及腎移植排斥反應(yīng)的病理過(guò)程中扮演著重要的作用9-12。il-17a 能刺激成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及白細(xì)胞合成表達(dá)炎癥細(xì)胞因子如 il-6，tnf- 和 il-1以及趨化因子 cxcl1，cxcl2，cxcl5，mcp-1 和 il-8 等13, 14。此外，il-17a 也能夠協(xié)同 tnf-，il-1和 ifn-以增強(qiáng)其促炎反應(yīng)15。已有研究表明 il-17a 的過(guò)度表60達(dá)在急性胰腺炎的病理過(guò)程中可能扮演著重要作用16。il-17a 能通過(guò)誘導(dǎo)激活 nf-b 和 mapk 途徑，刺激人胰腺成纖維細(xì)胞分泌 il-617。然而，目前對(duì)于 il-17a 參與急性胰腺炎 病理生理過(guò)程的機(jī)制仍不清楚。本研究建立了 3%?；悄懰徕c誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性急性壞死性 胰腺炎動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn) il-17a 在急性胰腺炎中的表達(dá)顯著升高，并能促進(jìn)炎癥介質(zhì)的表達(dá) 誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞壞死。651實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1急性胰腺炎模型的建立雄性 sd 大鼠購(gòu)自上海 slac 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。60 只體重 200-250g 的清潔級(jí) sd 大鼠， 分為對(duì)照組、和 sap 組 1 天、3 天、5 天、7 天和 21 天，每組 10 只大鼠。所有關(guān)于動(dòng)物的 操作得到上海市第十人民醫(yī)院動(dòng)物安全委員會(huì)許可（2011-res1）及上海市科學(xué)技術(shù)委員許70可（id: syxk 2007-0006）。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，大鼠禁食不禁水 12 小時(shí)。大鼠用 2%戊巴比妥鈉(0.25 ml/100 g)腹腔注 射麻醉。開(kāi)腹，找到十二指腸和胰管后，用動(dòng)脈夾夾閉膽總管近肝段。sap 組大鼠通過(guò)微 量注射泵逆行胰膽管注射 3%?；悄懰徕c(0.1ml/100g, sigma)，速度控制在 0.10 ml/min。注 射完畢，胰管十二指腸開(kāi)口端用動(dòng)脈夾夾閉十分鐘以維持胰管內(nèi)壓。對(duì)照組大鼠用生理鹽水75代替?；悄懰徕c逆行注射。關(guān)腹，大鼠在 37 度襯墊中進(jìn)行麻醉復(fù)蘇。在急性胰腺炎模型建 立后 1 天，3 天，5 天，7 天和 21 天分別麻醉后心腔取血后處死各組大鼠，快速取出胰腺， 稱(chēng)重后部分凍存于液氮或-80 度冰箱，部分固定于 4%多聚甲醛。血標(biāo)本于 4 度冰箱保存過(guò) 夜后，離心 3000g15 分鐘，取上清并保存于-80 度冰箱待用。死亡的大鼠用新的大鼠替代 入組，以維持每組 10 只。801.2原代胰腺腺泡細(xì)胞及星狀細(xì)胞分離參照胡國(guó)勇等18膠原酶法分離大鼠胰腺腺泡細(xì)胞。原代腺泡細(xì)胞用含 20%血清的dmem/f-12 培養(yǎng)基(gibco)培養(yǎng)。用不同濃度（0，10，100，200，500ng/ml）重組大鼠 il-17a（peprotech）處理原代腺泡細(xì)胞 12 小時(shí)。參照沈等密度梯度離心法分離原代大鼠胰腺星狀細(xì)胞19。新鮮分離的星狀細(xì)胞培養(yǎng)與85含 10%血清及 1%雙抗（gibco）的培養(yǎng)基中，三天后用重組大鼠 il-17a（200ng/ml）處理 星狀細(xì)胞 6 小時(shí)。1.3血清淀粉酶及脂肪酶檢測(cè)利用 roche/hitachi（roche）儀器檢測(cè)血清淀粉酶、脂肪酶活性。1.4胰腺組織學(xué)評(píng)估90胰腺組織樣本固定于 4%多聚甲醛，不同濃度酒精梯度脫水后進(jìn)行石蠟包埋，將胰腺組 織切成 5um 切片，二甲苯脫蠟后酒精梯度水化，用伊紅及蘇木素染色。1.5實(shí)時(shí)熒光定量 pcr利用鹽酸胍/苯酚/氯仿方法抽屜胰腺組織總 rna。利用 superscript ii 試劑盒（fermentas） 把 rna 逆轉(zhuǎn)錄成 cdna，引物序列見(jiàn)表 1。實(shí)時(shí)熒光定量 pcr 用 abi prism 7900ht 系統(tǒng)檢95測(cè)(applied biosystems)。gapdh 作為內(nèi)參。利用ct 值計(jì)算基因表達(dá)水平變化的倍數(shù)。表 1 實(shí)時(shí)熒光定量 pcr 引物序列table 1. primer sequences used for qpcr analysisgenes primers size (bp) annealing temperature, cil-17af: 5-aggccctcagactacctca-3 r: 5-tctcaggctccctcttcag-3il-17ra f: 5-gggtgtatggcctcatcac-3 r: 5-acaggcagtgatcaggaact-3il-17rc f: 5- ctgggaagagcccgaaga-3 r: 5- gtacctgggtttggtgtagg-3il-1 f: 5-tgtgatgttcccattagac-3r: 5-ttcatctcgaagcctgcagtg-3 il-6f: 5- ccactgccttccctactt-3r: 5- ttgccattgcacaactctt-3 cxcl1f: 5- tcgccaatgagctgcgctgt-3r: 5-gggacaccctttagcatctt-3 cxcl2f: 5-cgcccagacagaagtcatag-3 r: 5-tcctcctttccaggtcagtta-3cxcl5 f: 5- gctcaagctgctcctttc-3r: 5- gtgggtcaagacaaacatta-3 gapdhf: 5 -gcaagttcaacggcacag-3r: 5-cgccagtagactccacgac-3199 52260 51247 52131 51154 50205 54132 51187 50141 521001051.6蛋白質(zhì)免疫印跡（western blot）液氮或-80保存的大鼠胰腺組織迅速用 ripa 裂解液（含蛋白酶抑制劑及 pmsf）在液 氮中研磨后超聲裂解，然后于 4 度 10000g 離心 15 分鐘后，保留上清，用 bca 試劑盒測(cè) 定蛋白濃度(pierce)后加 1/5 體積 5蛋白上樣緩沖液后，100 度水浴煮沸 5-10 分鐘。按 60ug 蛋白上樣，濃縮膠電壓 80v，分離膠電壓 120v 進(jìn)行 sds-page 分析(bio-rad)。用 pvdf 膜（0.22um）200ma 恒流濕轉(zhuǎn) 40 分鐘后，常溫下用 5%牛奶封閉一小時(shí)。兔抗 il-17 多克 隆抗體（santa cruz，1:500 稀釋?zhuān)┗蛐∈?-actin 單克隆抗體(sigma，1:2000 稀釋)于 4 度孵 育過(guò)夜。tbs-t 洗膜 5 分鐘4 次后，用羊抗兔或羊抗鼠 igg-hrp 二抗(santa cruz，1:2000 稀釋)，室溫孵育一小時(shí)。tbst 洗膜 5 分鐘4 次后，用 ecl 檢測(cè)系統(tǒng)（santa cruz）于暗 室顯影、定影，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1101151201251301.7酶聯(lián)免疫吸附（elisa）大鼠血清中的 il-17a 含量用 elisa 試劑盒檢測(cè)（ebioscience）。1.8免疫組化石蠟包埋的胰腺組織切成 5um 厚度切片，用二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，用 edta (1 mm; ph 8.0)微波修復(fù) 15 分鐘。3%過(guò)氧化氫室溫孵育 20 分鐘，以去除過(guò)氧化物酶活性。5%bsa 封閉半小時(shí)，il-17a 一抗于 4 度孵育過(guò)夜，pbs 洗滌 5 分鐘3 次，用 dab 試劑盒檢測(cè)抗 體結(jié)合。蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照組用 pbs 替代一抗。顯微鏡觀察 il-17a 染色情況(ctr 6000； leica)。1.9細(xì)胞活力檢測(cè)用 8mg/ml hoechst33258 和 1mg/ml pi(sigma)雙染檢測(cè)大鼠胰腺原代腺泡細(xì)胞凋亡和壞 死20。細(xì)胞核顧鎖或染色質(zhì)片段化被認(rèn)為發(fā)生凋亡，細(xì)胞質(zhì)膨脹、細(xì)胞膜被破壞且細(xì)胞核 被 pi 染色被認(rèn)為發(fā)生壞死。同時(shí)檢測(cè)釋放到培養(yǎng)基中 ldh 的濃度以反映細(xì)胞壞死程度21。 細(xì)胞 atp 水平用 cell titer-glo luminescent cell viability assay kit (promega) 檢測(cè)22。1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。方差齊性的數(shù)據(jù)用 one-way anova 方法處理，并用 snk 方法進(jìn)行兩兩比較。方差不齊的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗(yàn) kruskal-wallis 方法處理。p 值0.05 被認(rèn)為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1il-17a 及其受體在大鼠急性胰腺炎模型中的表達(dá)2.1.1血清淀粉酶、脂肪酶及胰腺組織學(xué)改變?cè)?3%?；悄懰徕c逆行灌注后，與正常組相比，血清淀粉酶及脂肪酶（圖 1 a）水平在第 一天顯著升高，在第三天達(dá)到最高水平并一直維持在高水平至第五天，隨后逐漸降低。135140145圖 1 血清淀粉酶、脂肪酶及胰腺組織學(xué)改變。a：血清淀粉酶和血清脂肪酶水平在 3%?；悄懰徕c誘導(dǎo)的大鼠急性壞死性胰腺炎過(guò)程中的變化；b：胰腺組織在正常組及誘導(dǎo)急性胰腺炎后 1 天、3 天、5 天、7 天及14 天后的病理學(xué)改變（400）。*代表與對(duì)照組相比，p0.05fig. 1 serum amylase and lipase activities and histological alterations of the pancreas. a: changes in serum amylase activity and serum lipase activity during anp in rats. b: representative light micrographs from control rats and 3% natc treated rats at 1 day, 3 days, 5 days, 7 days and 21 days after induction of anp are presented. (magnification 400). *p0.05 compared with the saline group急性壞死性胰腺炎模型建立后一天，胰腺組織出現(xiàn)顯著間質(zhì)水腫、出血、腺泡細(xì)胞的空 泡化以及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)（圖 1 b）。隨著時(shí)間的進(jìn)展，腺泡細(xì)胞進(jìn)一步被損傷。第三天， 腺泡細(xì)胞的退行性變及壞死進(jìn)一步發(fā)展。第五天，大部分胰腺小葉被導(dǎo)管樣復(fù)合體替代。第 七天，發(fā)現(xiàn)腺泡細(xì)胞的再生以及間質(zhì)的纖維化。到第二十一天，導(dǎo)管樣復(fù)合體數(shù)量減少，胰 腺組織結(jié)構(gòu)基本修復(fù)。相反，生理鹽水組的胰腺組織僅在第一天出現(xiàn)輕度的間質(zhì)水腫及炎癥 細(xì)胞浸潤(rùn)，在第七天的時(shí)候胰腺組織已經(jīng)完全修復(fù)正常。- 13 -1501551601652.1.2il-17 家族及其受體在 sap 中的表達(dá)為了尋找調(diào)控胰腺損傷的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，我們對(duì) 3%?；悄懰徕c誘導(dǎo)的急性胰腺炎模型進(jìn)行 了基因芯片分析。芯片結(jié)果顯示，il-17a 基因在第一天變達(dá)顯著升高，在第三天至第五天 升至最高水平，在第七天逐漸降低（圖 2 a）。il-17f 是 il-17 家族中與 il-17a 結(jié)構(gòu)最相近 的成員，其表達(dá)水平在芯片中于第一天降低，后逐漸恢復(fù)至正常水平。而其他 il-17 家族成 員 il-17b，il-17d，il-17e 沒(méi)有明顯變化（表 2）。有研究表明，il-17a 通過(guò) il-17ra 及 il-17rc 的復(fù)合體激活下游信號(hào)通路。本研究顯示，il-17ra 及 il-17rc 在 sap 過(guò)程中均 發(fā)生明顯上調(diào)。圖 2 il-17a 及其受體在急性壞死性胰腺炎中的表達(dá)。a：il-17 家族基因表達(dá)的急性壞死性胰腺炎基因芯片 中的結(jié)果；b：il-17a 蛋白在急性壞死性胰腺炎中的表達(dá)；c：il-17a 在急性壞死性胰腺炎大鼠血清中的表 達(dá)；d-f：il-17a 及其受體 il-17ra 和 il-17rc 的 mrna 水平在急性壞死性胰腺炎過(guò)程中的表達(dá)。*代表與 對(duì)照組相比，p0.05fig. 2 expression of il-17a and its receptors during anp. a：mrna levels of il-17 family during anp weredetected by the microarray test. b:western blot analysis of il-17a showed an increase of il-17a at protein level in 3% natc induced pancreatic tissues. c: concentrations of serum il-17a during anp. d-f：quantitative real timert-pcr confirmed the increased mrna levels of il-17a, il-17ra, and il-17rc in pancreatic tissues after induction of anp. * p0.05 compared with the saline group.根據(jù)基因芯片結(jié)果，我們進(jìn)一步用 real-time pcr 的方法驗(yàn)證了 il-17a 及其受體在體內(nèi) 及體外的表達(dá)。急性胰腺炎過(guò)程中胰腺組織 il-17a 的表達(dá)變化與基因芯片一致，與第一天 開(kāi)始發(fā)生上調(diào)，于第三天達(dá)到最高水平后逐漸下降（圖 2 b，d）。此外，il-17ra 及 il-17rc精品論文170175在 mrna 水平也顯著上調(diào)（圖 2 e，f）。同時(shí)，我們運(yùn)用 elisa 方法檢測(cè)了 il-17a 在大鼠血清中的濃度。在正常大鼠血清中，il-17a 的濃度為 46.815.51 pg/l，但是在 sap 第一天 的大鼠血清中，il-17a 的濃度上升至 73.44 8.57 pg/ l。而到第三天增加至 152.45 21.48 pg/l)(圖 2 c)，隨后逐漸下降。而在對(duì)照組大鼠的血清中，il-17a 的濃度并未出現(xiàn)顯著性改 變。表 2 il-17 家族基因在 3%?；悄懰嵋认傺字械谋磉_(dá)table 2 gene expression of il-17 family during 3% natc-induced anpgenescontrol1d3d5d7dil-17a19.9 7.157.0 8.2*66.0 9.4*58.7 5.7*25.4 10.1il-17b217.2 13.195.1 7.4*27.9 3.5*50.6 5.9*38.8 6.5*il-17c893.9 55.3572.0 65.2*1225.8 76.9*792.4 35.3*842.5 37.1il-17d205.4 15.7217.0 14.6211.7 17.9265.5 32.3*200.7 28.4il-17e217.8 29.6149.6 17.4*113.4 22.6*227.6 26.782.3 9.8*il-17f538.9 36.6305.3 41.6*504.5 46.1541.3 54.7288.6 33.8*il-17ra163.0 35.0256.2 27.7*434.9 29.1*308.1 48.5*183.3 35.2il-17rc396.2 40.8564.9 34.6*513.0 45.2*488.9 27.5*395.1 31.2*代表與對(duì)照組相比，p0.05*p0.05 compared with the control group1801852.1.3il-17a 的表達(dá)定位如圖 4 a 所示，il-17a 在正常胰腺組織中幾乎未檢測(cè)到表達(dá)。在胰腺炎后第一天，il-17a 免疫組化陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)于間質(zhì)浸潤(rùn)炎性細(xì)胞（圖 3 b）。隨著腺泡細(xì)胞的損傷，il-17a 在壞死的 腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管復(fù)合體中表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性（圖 3 c）。另外，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中也檢測(cè)到免疫原 性。在第五天，除了導(dǎo)管復(fù)合體外，在間質(zhì)炎性細(xì)胞中也觀察到到 il-17a 強(qiáng)陽(yáng)性（圖 3 d）。 到了第七天，導(dǎo)管復(fù)合體上 il-17a 的表達(dá)較前減弱（圖 3 e）。190195200圖 3 il-17a 在 anp 中的表達(dá)定位。a：il-17a 在正常胰腺組織中罕有表達(dá)；b：anp 后第 1 天 il-17a 主要表達(dá)與浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞中；c：anp 后第 3 天 il-17a 主要表達(dá)于發(fā)生損傷的腺泡細(xì)胞（箭頭）和導(dǎo)管樣 復(fù)合體（星標(biāo)）；d：anp 后第 5 天 il-17a 在導(dǎo)管樣復(fù)合體（星標(biāo)）上表現(xiàn)為強(qiáng)陽(yáng)性；e：anp 后第 7 天il-17a 在導(dǎo)管復(fù)合體上仍見(jiàn)微弱表達(dá)；f：陰性對(duì)照組圖片（400）。fig. 3 immunohistochemical analyses of il-17a on rat pancreas during anp. a：in control pancreas, il-17a immunoreactivity was hardly observed. b：on day 1, il-17a protein immunostaining was mainly detected in infiltrated interstitial inflammatory cells (arrows). c：on day 3, il-17a was observed in injured acinar cells withvacuolization (arrowhead) and tubular complexes (asterisk). d：immunoreactivity for il-17a was stronglyexpressed mainly in tubular complexs (asterisk) on day 5；e：immunoreactivity for il-17a became weaker on day7；f：negative control. (magnification 400).2.2重組大鼠 il-17a 體外誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞壞死目前已證實(shí)，炎性細(xì)胞的募集和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生可導(dǎo)致腺泡細(xì)胞的損傷4。為了證明 il-17a 能調(diào)節(jié)腺泡細(xì)胞的活力，我們用重組大鼠 il-17a（ril-17a）細(xì)胞因子處理大鼠原代 胰腺腺泡細(xì)胞。高濃度的 il-17a（500ng/ml）可誘導(dǎo)體外腺泡細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變。如圖4a 所示，原代分離的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞呈高度極化，基底膜光滑、完整（左圖）。高濃度il-17a 處理 12 個(gè)小時(shí)候，腺泡細(xì)胞從基底膜發(fā)泡，發(fā)生空泡化，并失去了細(xì)胞膜的完整性（右圖）。205210215220225圖 4 重組大鼠 il-17a 誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞壞死。a：重組大鼠 il-17a（500ng/ml）作用 12 小時(shí)誘導(dǎo)腺泡細(xì) 胞發(fā)生壞死樣形態(tài)學(xué)改變圖片（400）；b：hoechst/pi 雙染標(biāo)記腺泡細(xì)胞壞死及凋亡圖片（200） c：不 同濃度重組大鼠 il-17a 致腺泡細(xì)胞 atp 水平下降；d：重組大鼠 il-17a 處理腺泡細(xì)胞致腺泡細(xì)胞降 ldh 釋放。*代表與對(duì)照組相比，p0.05fig. 4 ril-17a induced pancreatic acinar cells necosis. a：treatment with 500ng/ml ril-17a for 12 hours inducedacinar morphological changes in rat pancreatic acinar cells. arrowheads denote the damaged acinar cells. (magnification 400). b：hoechst 33258/pi double staining. arrowheads indicate apoptotic cells and arrows indicate necrotic cells (magnification 200). c：treatment with ril-17a resulted in a dose-dependent depletion of the cellular atp levels；d：treatment with ril-17a resulted in increased percentage of ldh release into theextracellular medium. *p 0.05 compared with pbs-treated group因?yàn)?atp 耗竭被認(rèn)為腺泡細(xì)胞壞死相關(guān)23。結(jié)果顯示，ril-17a 處理腺泡細(xì)胞后，細(xì) 胞內(nèi) atp 耗竭顯著高于對(duì)照組，且 atp 水平的耗竭程度隨著 ril-17a 濃度的增加而增加（圖4 c）。此外，血清 ldh 水平也是一個(gè)細(xì)胞損傷和壞死的分子標(biāo)記21。ldh 釋放依賴(lài)于作 用活細(xì)胞的 ril-17a 濃度。在 1000ng/ml ril-17a 刺激腺泡細(xì)胞 12 小時(shí)后，僅殘存 66.75% 細(xì)胞活力(圖 4 d)。500ng/ml ril-17a 作用于腺泡細(xì)胞 12 小時(shí)后，hoechest 33258/pi 雙染進(jìn) 一步證實(shí) il-17a 主要誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞發(fā)生壞死（圖 4 b）。2.3il-17a 誘導(dǎo) il-17ra/c 及炎癥介質(zhì)表達(dá)為了進(jìn)一步研究 il-17a 誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞壞死的分子機(jī)制，首先，我們發(fā)現(xiàn) il-17ra 及 il-17rc 隨著 ril-17a 的刺激均發(fā)生上調(diào)（圖 5 a），表明 il-17a 介導(dǎo)的信號(hào)通路被激活。 同時(shí)，我們進(jìn)一步檢測(cè)了 il-17a 的靶基因在大鼠胰腺腺泡細(xì)胞及星狀細(xì)胞的表達(dá)。在 il-17a 的刺激下，腺泡細(xì)胞及星狀細(xì)胞合成炎癥細(xì)胞因子如 il-1、il-6 以及 c-x-c 家族趨化因子 包括 cxcl1，cxcl2 和 cxcl5）增加（圖 5 b-g）。該結(jié)果表明 il-17a 可能通過(guò)觸發(fā)炎 癥反應(yīng)而誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞壞死，進(jìn)而誘導(dǎo)急性胰腺炎的發(fā)生。230235240245圖 5 ril-17a 誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞及星狀細(xì)胞表達(dá)炎癥因子及趨化因子。a-b：ril-17a（200ng/ml）處理 6 小 時(shí)誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞及星狀細(xì)胞表達(dá)其受體 il-17ra 及 il-17rc；c-g：ril-17a 促進(jìn)腺泡細(xì)胞及星狀細(xì)胞表達(dá) 炎性細(xì)胞因子 il-1、il-6 及趨化因子 cxcl1、cxcl2 和 cxcl5。*代表與對(duì)照組相比，p0.05fig. 5 ril-17a upregulated expression of induced various cytokines and c-x-c-chemokines in pancreatic acinar cells and pancreatic stellate cells. a-b：ril-17a upregulated expression of il-17ra and il-17rc；c-g：ril-17ainduced its downstream targets il-1, il-6, cxcl1, cxcl2 and cxcl5 in pancreatic acinar cells and pancreatic stellate cells (pscs). isolated rat acinar cells and pscs were treated with 200 ng/ml ril-17a for the 6 hours. *p 0.05 compared with pbs-treated group.3討論在本研究中，我們發(fā)現(xiàn) il-17a 在 3%牛黃膽酸鈉誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性急性重癥胰腺炎中的表 達(dá)水平顯著上調(diào)。此外，高濃度的 il-17a 通過(guò)促進(jìn)下游促炎靶基因包括細(xì)胞因子如 il-1， il-6 和 c-x-c 家族趨化因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞的壞死。il-17a 細(xì)胞因子家族是與清除細(xì)胞外病原體高度相關(guān)的炎癥因子24，并且是多種炎癥 性疾病的驅(qū)動(dòng)因素。目前關(guān)于 il-17a 在心臟、腦、腎臟、小腸及肺組織缺血/再灌注損傷中 的證據(jù)越來(lái)越多10, 25-28。然而，il-17a 在急性胰腺炎中扮演的角色卻仍不清楚。目前有研250255260265270275280285究證實(shí)，多種固有免疫細(xì)胞包括 cd4+ t 細(xì)胞、 t 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、樹(shù)突樣 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及激活的單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及中性粒細(xì)胞均可產(chǎn)生 il-17a 細(xì)胞 因子29。相反，il-17 受體家族的五個(gè)成員，即 il-17rare 在結(jié)構(gòu)上與其他細(xì)胞因子受體 的結(jié)構(gòu)同源性較低30。il-17ra 是最早被發(fā)現(xiàn)的 il-17a 受體，它廣泛地表達(dá)與各種不同的 細(xì)胞如造血細(xì)胞、多種骨髓細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及造骨細(xì)胞。此外， il-17rc 可以與 il-17a 結(jié)合成異二聚體，成為 il-17a 共同受體進(jìn)而激活下游信號(hào)通路6。我們運(yùn)用基因芯片篩選發(fā)現(xiàn) il-17a 及其受體 il-17ra 和 il-17rc 均在 3%牛黃膽酸鈉 誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎模型中顯著升高。然而，il-17 家族其他成員的表達(dá)變化卻沒(méi)有類(lèi) 似 il-17a 的趨勢(shì)。我們進(jìn)一步運(yùn)用 real-time pcr 方法驗(yàn)證了 il-17a 及其受體在 mrna 水 平的表達(dá)與芯片結(jié)果基本一致，這表明 il-17a 介導(dǎo)的信號(hào)途徑在急性胰腺炎模型中被激活。 此外，我們發(fā)現(xiàn) sap 大鼠血清中 il-17a 的濃度較對(duì)照組亦顯著升高。如上所述，過(guò)量的 il-17a 可介導(dǎo)多種器官的損傷，因?yàn)槲覀兺茰y(cè) il-17a 血清水平的增高跟急性重癥胰腺炎發(fā) 生全身炎癥反應(yīng)綜合癥和遠(yuǎn)隔器官的損傷相關(guān)。此外，il-17a 的表達(dá)水平與血清淀粉酶和 脂肪酶的表達(dá)水平和胰腺損傷程度相平行，而后者是衡量急性胰腺炎嚴(yán)重程度的常用指標(biāo)。 這提示著 il-17a 可能參與急性胰腺炎的急性損傷。因此，我們進(jìn)一步用免疫組化方法對(duì) il-17a 進(jìn)行表達(dá)定位，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)于炎性細(xì)胞以及損傷的腺泡細(xì)胞中。有趣的是，il-17a在導(dǎo)管樣復(fù)合體中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。導(dǎo)管復(fù)合體常見(jiàn)于急性胰腺炎損傷和修復(fù)期，有研究認(rèn)為 其中有一部分導(dǎo)管復(fù)合體來(lái)源于急性胰腺炎早期受損腺泡細(xì)胞的轉(zhuǎn)化31。此外，導(dǎo)管復(fù)合 體也見(jiàn)于慢性胰腺炎及胰腺癌中31, 32。il-17a 是否參與急性胰腺炎向慢性胰腺炎的轉(zhuǎn)化需 要進(jìn)一步的研究。然后，我們聚焦于研究 il-17a 在介導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)中扮演的角色高劑 量 ril-17a 作用 12 小時(shí)誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞發(fā)生空泡化，伴隨腺泡細(xì)胞 atp 發(fā)生耗竭及 ldh 釋 放入培養(yǎng)液。此外，hoechst/pi 雙染進(jìn)一步證實(shí) ril-17a 誘導(dǎo)的腺泡細(xì)胞死亡方式以壞死為 主。il-17a 能誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，因?yàn)楸粴w為促炎細(xì)胞因子30。急性胰腺炎的發(fā)生 觸發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、趨化因子和粘附分子4。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn) ril-17a 能刺激胰腺腺泡細(xì)胞和星狀細(xì)胞表達(dá) il-1 和 il-6。有研究報(bào)道，il-17a 能誘導(dǎo) il-6 通過(guò) nf-b 和 erk1/2 map 激酶途徑而促進(jìn)并穩(wěn)定人胰周成纖維細(xì)胞表達(dá) il-6 的 mrna17,33，并能與其他細(xì)胞因子如 tnf-，il-1，和干擾素- 促進(jìn) il-6 的表達(dá)與合成33。而 il-6 被認(rèn)為是急性胰腺炎病理生理過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并與疾病的嚴(yán)重程度正相關(guān)34。il-6 也是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的 il-17a 的靶基因，它能通過(guò) rort 依賴(lài)的途徑促進(jìn) th17 細(xì)胞的分化 35，這提示可能存在一個(gè)對(duì) il-17a 的正反饋應(yīng)答環(huán)路。除了炎性細(xì)胞因子，c-x-c 家族趨化因子，包括 cxcl1、cxcl2、cxcl5、cxcl8 (il-8) 和 cxcl10 等也是 il-17a 的靶基因15。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在 ril-17a 刺激腺泡細(xì)胞和 星狀細(xì)胞后，cxcl1、cxcl2 和 cxcl5 的 mrna 水平發(fā)生上調(diào)。這些 il-17a 下游趨化 因子也參與中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化過(guò)程14, 15。如上所述，中性粒細(xì)胞本身也能合 成表達(dá) il-17a。il-17a 誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞募集參與多種疾病的病理生理過(guò)程。比如，il-17a 在中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的腦缺血/再灌注損傷中扮演著重要作用25。最近研究報(bào)道，中性粒細(xì)胞 及巨噬細(xì)胞也能通過(guò)誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞胰酶激活劑腺泡細(xì)胞壞死而加重急性胰腺炎36, 37。因此，il-17a 可能通過(guò)參與中性粒細(xì)胞的趨化和激活來(lái)決定急性胰腺炎的嚴(yán)重程度。 綜上所述，本研究表明 il-17a 信號(hào)通路的激活參與急性胰腺炎過(guò)程中的腺泡細(xì)胞的壞死和炎癥反應(yīng)。il-17a 促進(jìn) c-x-c 家族趨化因子成員 cxcl1、cxcl2 及 cxcl5 在腺泡細(xì)290胞和星狀細(xì)胞的表達(dá)，后者可能在中心粒細(xì)胞的趨化和組織浸潤(rùn)中扮演重要作用。然而，阻斷 il-17a 信號(hào)通路是否能夠減輕實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎仍待進(jìn)一步研究。本研究可能為將來(lái)針 對(duì)重癥急性胰腺炎的治療提供新的思路。參考文獻(xiàn) (references)2953003053103153203253303353403451 pandol sj, saluja ak, imrie cw, banks pa. acute pancreatitis: bench to the bedsidej. gastroenterology.2007, 132(3):1127-51.2 bhatia m. apoptosis versus necrosis in acute pancreatitisj. am j physiol gastrointest liver physiol, 2004,286: g189-196.3 bhatia m. inflammatory response on the pancreatic acinar cell injuryj. scand j surg, 2005, 94: 97-102.4 vonlaufen a，apte mv，imhof ba, et al. the role of inflammatory and parenchymal cells in acutepancreatitisj. j pathol, 2007, 213: 239-248.5 bakoyiannis a，delis s，dervenis c. pathophysiology 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