奶制品氮含量測定技術的研究本科設計.doc

本科畢業(yè)設計（論文）奶制品氮含量測定技術的研究李寧燕山大學里仁學院2013年 6月 本科畢業(yè)設計（論文）奶制品氮含量測定技術的研究學 院： 里仁學院 專 業(yè)： 應用化學 學生 姓名： 李寧 學 號： 091610021037 指導 教師： 李阿丹 答辯 日期： 2013年6月16日 燕山大學畢業(yè)設計（論文）任務書學院：里仁學院 系級教學單位：建環(huán)系 學號091610021037學生姓名李寧專 業(yè)班 級應用化學09-2班題目題目名稱奶制品氮含量測定技術的研究題目性質1.理工類：工程設計 （ ）；工程技術實驗研究型（ ）；理論研究型（ ）；計算機軟件型（ ）；綜合型（ ）2.文管理類（ ）；3.外語類（ ）；4.藝術類（ ）題目類型1.畢業(yè)設計（ ） 2.論文（ ）題目來源科研課題（ ） 生產(chǎn)實際（ ）自選題目（ ） 主要內容利用凱氏定氮法，雙縮脲法，考馬斯亮藍法以及反相高效液相色譜法對牛奶以及摻雜尿素和三聚氰胺的牛奶進行檢測，對比分析這幾種方法的優(yōu)缺點，從中找出最適合的蛋白質測定的方法?；疽笳莆崭鞣N檢測方法的基本原理，明確每種檢測方法的基本內容，熟練掌握分光光度計，高效液相色譜儀等儀器的使用方法。參考資料中國期刊數(shù)據(jù)庫蛋白質的檢測方法與乳制品中蛋白含量測定奶制品中蛋白質測定方法相關文獻周 次第1 4周第510周第1113周第1416周第1720周應完成的內容查閱相關文獻，了解奶制品中氮含量的測定方法，提交文獻綜述。實驗階段，用凱氏定氮法、bradford法、雙縮脲法和反相高效液相色譜法測定牛奶及摻雜的牛奶進行檢測分析。對試驗數(shù)據(jù)進行處理計算。分析比較幾種方法，并提出自己的看法。撰寫畢業(yè)論文，提交論文。指導教師：李阿丹職稱：副教授 2013年6月16日系級教學單位審批： 年 月 日摘要本文采用凱氏定氮法，雙縮脲法，考馬斯亮藍法以及反相高效液相色譜法分別對牛奶以及摻入尿素和三聚氰胺的牛奶樣品進行實驗分析，并對幾種方法測得的進行比較。在雙縮脲法和考馬斯亮藍法中對樣品的前處理時選用的是有機溶劑沉淀法，使用乙腈提取牛奶中的蛋白質。高效液相色譜法是用的反相色譜法，使用zorbax300sb-c18色譜柱（250 mm 4.6 mm，5 m）和紫外檢測器，用標準添加法對純牛奶樣品中的尿素和三聚氰胺的含量進行了檢測分析。通過對結果的分析以及對比可知，用凱氏定氮法測得的氮含量是牛奶中的總氮含量，該方法消耗時間長，操作繁瑣。用雙縮脲法和考馬斯亮藍法要比凱氏定氮法簡便迅速，并且這兩種方法也都可以快速準確的檢測出蛋白質的含量。用反相高效液相色譜法測定時待測樣品在出峰處不會受到牛奶中其它組分的干擾，因此可用于奶制品中尿素和三聚氰胺含量的準確檢測與分析。關鍵詞牛奶蛋白質；凱氏定氮法；雙縮脲法；考馬斯亮藍法；反相高效液相色譜法；有機溶劑沉淀法 燕山大學本科生畢業(yè)設計（論文）abstractin this paper, the kjeldahl method, biuret method, coomassie brilliant blue method and high performance liquid chromatography(hplc), respectively, for milk and milk mixed with urea and melamine test samples analyzed and measured by several methods for comparison. in the biuret method and coomassie brilliant blue method for sample pre-treatment of choice is an organic solvent precipitation method using acetonitrile extract the protein in milk. hplc with reversed-phase chromatography using zorbax300sb-c18 column (250 mm 4.6 mm, 5 m) and a uv detector, using standard addition method for pure milk sample content of urea and melamine the detection and analysis.through analysis and comparison of results shows that, with the kjeldahl nitrogen content measured by the total nitrogen content of the milk, the method consumes a long time and complicated operation. with the biuret method and coomassie blue staining than kjeldahl method is simple and rapid, and these two methods can also be quickly and accurately detect the protein content. by reversed-phase high-performance liquid chromatography peaks when the sample in place will not be interference from other components in milk, it can be used in dairy products of urea and melamine accurate detection and analysis.keywords kjeldahl method; biuret method; bradford method; reverse phase high performance liquid chromatography(rp-hplc); organic solvent precipitationiii目 錄摘要iabstractii第1章 緒論11.1 課題背景11.2 蛋白質測定方法概述21.2.1 凱氏定氮法21.2.2 雙縮脲法(biuret法)31.2.3 福林-酚試劑法（lowry法）51.2.4 考馬斯亮藍法（bradford法）61.2.5 高效液相色譜法（hplc）71.3 課題研究的意義81.4 課題研究的主要內容9第2章 實驗材料及方法102.1 用凱氏定氮法測定牛奶中的蛋白質含量102.1.1 實驗儀器及藥品102.1.2 實驗操作及步驟102.2 雙縮脲法測定牛奶中的蛋白質含量122.2.1 實驗儀器及藥品122.2.2 實驗操作及步驟122.3 考馬斯亮藍法測定牛奶中的蛋白質含量152.3.1 實驗儀器及藥品152.3.2 實驗操作及步驟152.4 反相高效液相色譜法測定牛奶中的三聚氰胺及尿素的含量182.4.1 實驗儀器及藥品182.4.2 實驗操作及步驟18第3章 實驗結果與分析213.1 凱氏定氮法的實驗數(shù)據(jù)處理及結果分析213.1.1 實驗數(shù)據(jù)及處理213.1.2 實驗結果及分析223.2 雙縮脲法的實驗數(shù)據(jù)處理及結果分析223.2.1 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計算223.2.2 標準蛋白曲線的繪制223.2.3 雙縮脲法對摻雜尿素溶液的未知樣品溶液中的蛋白質含量的測定233.2.4 雙縮脲法對摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質含量的測定253.3 考馬斯亮藍法的實驗數(shù)據(jù)處理及結果分析263.3.1 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計算263.3.2 標準蛋白曲線的繪制263.3.3 考馬斯亮藍法對摻雜尿素的未知樣品溶液中的蛋白質含量的測定283.3.4 考馬斯亮藍法對摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質含量的測定293.4 反向高效液相色譜法的實驗數(shù)據(jù)處理及結果分析303.4.1 尿素標準曲線和三聚氰胺標準曲線的繪制303.4.2 反向高效液相色譜法測樣品中的尿素和三聚氰胺33結論36參考文獻37致謝40附錄1 開題報告41附錄2 文獻綜述44附錄3 中文譯文47附錄4 外文原文56 65第1章 緒論 第1章 緒論1.1 課題背景隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，人民生活水平的不斷提高，以及營養(yǎng)知識的普及和宣傳，越來越多的人開始注重在飲食方面的質量，越來越多的人追求營養(yǎng)的均衡發(fā)展。蛋白質作為人類最重要的營養(yǎng)物質之一, 是生物體細胞的重要組成成分，有許多的生物學功能。而蛋白質又是牛奶及奶制品中的主要成分，乳蛋白中含有大量的人體必需氨基酸，是人體細胞不可缺少的，也是牛乳中最重要的特征營養(yǎng)成分，因此，作為人們攝取蛋白質的主要來源的奶制品深受人們的青睞。牛奶中的蛋白質含量越高，其營養(yǎng)價值就越高，因此乳及乳制品中蛋白質含量的高低將決定產(chǎn)品的營養(yǎng)價值的高低和質量的優(yōu)劣。過去幾十年中，乳品經(jīng)常被用作為嬰幼兒和老弱病殘孕的營養(yǎng)食品，到近些年，乳品已就成為多數(shù)人的生活必需品，因此，牛乳的產(chǎn)銷量在持續(xù)不斷的快速增長，同時，乳制品消費量的急劇增大也導致了奶源的嚴重不足。在這種情況下，在巨大的經(jīng)濟利益的誘惑下，一些不法商販開始在牛乳中摻雜使假，以從中謀求暴利。乳制品中的摻物的種類有很多種，如：水、米湯、豆?jié){、淀粉、蔗糖、食鹽、碳酸鈉、雙氧水、電解質溶液、牛尿、尿素、三聚氰胺、植物油、陳乳、白礬、亞硝酸鹽、硝酸鹽、洗衣粉、抗生素、化肥等1-3。其摻雜的方式也是多種多樣的，總結起來有以下幾種情況：摻入非蛋白成分(尿素，三聚氰胺，乳脂肪，乳糖等)以使奶制品中的蛋白氮含量增加；摻入雜蛋白(大豆粉，明膠等)以使奶制品中的蛋白質的種類增加；摻入價格低廉的乳源蛋白如乳清粉等以使奶制品的成本降低；摻入其他動物乳汁以降低奶制品的成本。這種在牛乳中摻雜使假的行為不僅極大損害了廣大人民群眾的身體健康和切身利益，同時也大大降低消費者對乳品企業(yè)和乳品質量的信任，甚至使政府在人民心目中的形象遭到破壞。例如2008年的三鹿奶粉事件所造成的后果和社會影響說明，乳品質量好壞與否不僅關系到嬰幼兒和青少年的健康成長，也關系到無數(shù)家庭的幸福、社會的和諧以及我們國家的形象。雖然這些年來我們國家一直都在不停地打假治假，但是這種摻假造假的現(xiàn)象迄今都是禁而未止，摻雜使假的情況時不時的浮出水面，乳制品的質量安全問題也已經(jīng)引起了全社會的普遍關注。1.2 蛋白質測定方法概述 蛋白質是乳及乳制品中的主要成分，是牛乳中最重要的特征營養(yǎng)成分，乳及乳制品中蛋白質含量是必測指標4。因此，近年來，人們發(fā)展了許多測定蛋白質的方法。目前蛋白質的測定方法主要有凱氏定氮法、分光光度法、和滴定法等5。其中分光光度法又包括：雙縮脲法，考馬斯亮藍法，福林-酚試劑法、bca法和紫外吸收法等，滴定法包括有甲醛滴定法、ph滴定法等。近些年來，色譜技術也開始用于蛋白質含量的檢測之中。1.2.1 凱氏定氮法我國國家標準中測定食品中蛋白質(gb/t50095-2003)6有2種方法:凱氏定氮法和比色法。其中，凱氏定氮法是國家標準和國際標準中首推的蛋白質的檢測方法。凱氏定氮法（其裝置圖如下圖1-1）的基本原理是將含氮的有機物與濃圖1-1 凱氏定氮法消化、蒸餾裝置硫酸共同加熱,反應過程中樣品中的碳、氫等元素被氧化成二氧化碳和水而逸出,有機氮轉化為氨,并且進一步與硫酸結合生成硫酸銨，通常稱此過程為“消化”。但是這個反應進行得比較緩慢,通常需要加入硫酸鉀來提高反應液的沸點,并加入硫酸銅作為催化劑,以促進反應的進行,指示消化終點的到達。消化之后向消化液中加入濃堿，濃堿可以使消化液中的硫酸銨分解,游離出氨,水蒸氣將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量一定濃度的硼酸溶液中,該過程被稱為“堿化蒸餾”。硼酸吸收氨后使溶液中的氫離子的濃度降低,用標準無機酸滴定吸收后的硼酸溶液,直到恢復溶液中原來氫離子濃度時為止,最后根據(jù)所消耗標準酸的當量數(shù)即可計算出待測物中的總氮量,再乘以蛋白質系數(shù)即為蛋白質的含量7。凱氏定氮法是測定待測樣品中總有機氮最準確的方法,也是各種蛋白質含量測定方法的基礎。經(jīng)過科研人員的不斷研究和改進8-10,凱氏定氮法已具有應用范圍廣、靈敏度高、回收率較好、使用儀器設備簡單等優(yōu)點。但是該方法操作消耗時間長,消化一個樣品至少需要2個小時,完成整個操作流程一般需要67個小時左右,而且在消化過程中會產(chǎn)生大量的有害氣體二氧化硫，污染工作環(huán)境,危害操作人員的身體健康。所以該方法一般是在實驗室通風性較好的條件下由訓練有素的人員來完成11。在我國的國家標準中，凱氏定氮法測定的是總氮的含量，因此得到的結果代表的是乳品中粗蛋白的含量；而在國際標準(iso，aoac，idf)中，先用三氯乙酸對樣品進行預處理，使蛋白質沉淀，然后再分別對沉淀中的蛋白態(tài)氮和濾液中的非蛋白態(tài)氮進行凱氏定氮，測定的結果可真實反映乳品真蛋白的含量12。由于凱氏定氮法操作費時，所以學者們又研究并建立了快速檢測蛋白質的方法，即分光光度法，下面將逐一介紹一下常用的幾種分光光度法。1.2.2雙縮脲法(biuret法)雙縮脲(h2nocnhconh2)是兩個分子脲在180 左右加熱，放出一分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液（naoh）中，雙縮脲能與銅離子（cu2+）作用，生成紫紅色絡合物（該物質的分子結構式見圖1-2），該反應即雙縮脲反應。圖1-2 紫色絡合物分子結構式由于蛋白質分子中含有很多與雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應。雙縮脲反應是肽和蛋白質所特有的，而為氨基酸所沒有的一種顏色反應。一般分子中含有兩個氨基甲酪基（即肽鍵：-co-nh-）的化合物與堿性銅溶液作用，就會形成紫色或藍紫色絡合物。具有兩個酰胺基或兩個直接相連的肽鍵，或間隔一個碳原子相連的肽鍵結構的化合物，他們也都可以發(fā)生雙縮脲反應。肽鍵是組成蛋白質的基本結構，在堿性環(huán)境下，蛋白質中的肽鍵與cu2+作用生成紫紅色絡合物，且在一定條件下，顏色的深淺程度與蛋白質的含量的關系在一定范圍內符合比爾定律，即蛋白質濃度隨著顏色的加深而呈增加的趨勢，且成正比關系，而顏色的變化與蛋白質的氨基酸組成及分子量無關，因此我們可以通過雙縮脲法比色的方法來測定蛋白質的濃度，這種方法也是常用的方法之一13。雙縮脲反應主要涉及肽鍵，因此受蛋白質特異性的影響較小。而且使用的試劑價廉易得，操作簡便，可測定的范圍為110 mg蛋白質，適于精度要求不太高的蛋白質含量的測定，能測出的蛋白質含量須在約0.5 mg以上。雙縮脲法的缺點是精確度低、所需樣品量大，干擾此測定的物質有很多。主要的干擾有：酚類、檸檬酸、硫酸銨、trsi緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用14。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸鈉(l%),硝酸鈉(l%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響,但這些物質濃度高時,必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉-氫氧化鈉溶液,即可顯色測定。若樣品酸度較高,顯色后會較淺,則必須提高碳酸鈉-氫氧化鈉溶液的濃度1-2倍。1.2.3福林-酚試劑法（lowry法）福林-酚試劑法（lowry法）是lowry 在雙縮脲方法的基礎上發(fā)展的。lowry確定了使用該方法測定蛋白質濃度的基本步驟,他在雙縮脲試劑的基礎上又增加了一種增強顯色的試劑磷鉬酸和磷鎢酸的混合液,蛋白質中酪氨酸殘基的酚羥基會將它們還原，從而產(chǎn)生深藍色(鉬藍和鎢藍的混合物),增加顯色量,這樣就提高了檢測蛋白質的靈敏度。lowry法是最靈敏的蛋白質測定方法之一,該法在生物化學領域得到廣泛的應用。（1）實驗原理福林-酚試劑法的顯色原理是在雙縮脲法的基礎上12,加入了第二種試劑福林-酚試劑,增加了顯色量,從而達到了提高了檢測蛋白質的靈敏度的效果。這兩種顯色反應產(chǎn)生深藍色的原因是:在堿性環(huán)境中,蛋白質中的肽鍵與銅離子結合生成復合物；福林-酚試劑中的磷鋁酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深藍色(鋁藍和鎢藍的混合物)。lowry法中的樣品的吸光度取決于一些氨基酸的濃度，同時也取決于叔肽的量，因為兩者都會使福林-酚試劑的量減少34，在一定的條件下,藍色的深度與蛋白的量是成正比的。（2）優(yōu)缺點lowry法的優(yōu)點在于它的靈敏度高,與雙縮脲法相比，它的靈敏度要高得多。其缺點有：消耗時間較長,而且要精確的控制操作的時間,標準曲線也不是嚴格的直線形式,且專一性較差,干擾物質較多。對雙縮脈反應發(fā)生干擾的離子,同樣容易干擾福林-酚反應。而且對后者的影響還要大得多。需要注意的是，在進行測定時,加入福林-酚試劑時要特別小心,因為該試劑僅在酸性條件下穩(wěn)定,但上述的還原反應只能在ph=10的情況下才可以進行,故當福林-酚試劑加入堿性的銅-蛋白質溶液中時,必須立即混勻,以便在磷鋁酸-磷鎢酸試劑在遭到破壞之前,還原反應就能發(fā)生15。1.2.4考馬斯亮藍法（bradford法） 由于biuret法和lowry法存在著很多的弊端，因此人們開始去尋找更加完善的蛋白質測定方法。bradford在1976年根據(jù)蛋白質與染料相結合的原理設計而建立了考馬斯亮藍法，這種測定蛋白質的方法具有超過其他幾種方法的突出的優(yōu)點,因而得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法16。（1）實驗原理由于考馬斯亮藍g-250染料存在著兩種不同的顏色形式棕紅色和藍色，在酸性溶液中染料與蛋白質中的芳香族氨基酸和某些堿性氨基酸發(fā)生反應,使染料的最大吸收峰的位置(max)由465 nm變?yōu)?95 nm，溶液的顏色也由棕紅色變?yōu)樗{色。在一定的蛋白質濃度范圍內(10-1000 g/ml)，蛋白質和染料結合的規(guī)律符合比爾定律(beers law)17。通過測定在595 nm下的吸光度值a595nm，可知與其結合蛋白質的量。蛋白質和染料結合的過程很快,只需2 min左右即可完全反應,呈現(xiàn)出最大光的吸收,并且穩(wěn)定時間長達1 h。超過穩(wěn)定時間之后,蛋白質-染料復合物就會發(fā)生聚合并沉淀出來。蛋白質-染料復合物具有很高的消光系數(shù),因此在測定蛋白質時的靈敏度很高18,19。（2）優(yōu)缺點考馬斯亮藍法的優(yōu)點在于它的靈敏度高。與福林-酚試劑法相比，考馬斯亮藍法的靈敏度要高四倍左右,其最低的蛋白質檢測量可低達10g。這是因為蛋白質與考馬斯亮藍g-250染料結合后產(chǎn)生的顏色的變化很大,再加上蛋白質-染料復合物又有很高的消光系數(shù),因而吸光度值隨蛋白質濃度的變化要比福林-酚試劑法大的多20。bradford法測定蛋白質含量的另一個優(yōu)點在于它測定的快速和簡便性。完成一個樣品的測定, 只需加一種試劑，并且只需要5分鐘左右即可。由于考馬斯亮藍g-250染料與蛋白質結合的過程大約只要2分鐘就可以完成,其顏色可以在1小時內保持穩(wěn)定,且在5分鐘至20分鐘之間時的顏色的穩(wěn)定性最好，因而bradford法完全不用像福林-酚法那樣費時并且還必須嚴格地控制時間21。除上述優(yōu)點之外，bradford法干擾物質少，如干擾福林-酚試劑法的k+、na+、mg2+ 離子、tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edat等物質均不會對bradford法造成干擾22。bradford法在測定蛋白質含量時也有一些不足之處。由于不同種類的蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量分布不同,因此考馬斯亮藍法在測不同的蛋白質時會有較大的偏差,在制作標準曲線時通常選用-球蛋白作為標準蛋白以減少這方面的偏差23。另外，bradford法在測定蛋白質含量時也仍然存在一些物質的干擾,主要的干擾物質有:去污劑、trtion x-100、十二烷基磺酸鈉(sds)和氫氧化鈉24。第三，標準曲線在蛋白質濃度較大時有輕微的非線性,因此不能使用比爾定律直接進行計算,而只能通過標準曲線來測定未知蛋白質的濃度25。除此之外，在測定中, 也會有少部分的蛋白-染料復合物吸附于比色皿的壁上,實驗證明這種蛋白-染料復合物的吸附的影響是可以忽略的,實驗完畢后用乙醇可以將藍色的比色皿清洗干凈。1.2.5 高效液相色譜法（hplc）高效液相色譜法（high performance liquid chromatography / hplc）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學、醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術。高效液相色譜法是在經(jīng)典的液相色譜法的基礎上發(fā)展起來的。高效液相色譜法是在高壓條件下，溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次交換的過程，它借溶質在兩相間的分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起排阻作用的差別使不同溶質得以分離26。高效液相色譜法有“四高一廣”的特點：高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在1530分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內即可完成，一般小于1小時。高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。高靈敏度：紫外檢測器可達0.01 ng，進樣量在微升數(shù)量級。應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有“柱外效應”。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。高效液相色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法。其中，正向色譜法是采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。而反向色譜法則一般用非極性固定相（如c18、c8)；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。rpc在現(xiàn)代液相色譜中應用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個hplc應用的80%左右。1.3 課題研究的意義 奶制品已經(jīng)成為每個家庭的生活必需品，由于中國家庭較多，對奶制品的需求量大，因此有不少廠商為牟取暴利，向奶制品中摻假。在原奶中摻雜摻假27,28，這種丑惡行為既影響了牛奶的品質，又損害了消費者的健康，在社會產(chǎn)生了極大的反響。然而在牛奶中摻入廉價的水解蛋白、其他動物乳或者含氮有機化合物等新的摻假方式，傳統(tǒng)的檢測方法29-34則難以檢出，現(xiàn)在的乳品檢測技術往往是等參假物出來后才能確定相對的檢測技術，因而不能未卜先知。為此，急需建立適應新?lián)郊偾闆r的快速、準確的檢測方法。本實驗對牛奶蛋白質進行檢驗，對牛奶中的蛋白質進行定量檢測，為牛奶的摻假檢驗提供可靠數(shù)據(jù)，以確保奶制品的質量和安全。本研究的目的是從幾種傳統(tǒng)的蛋白質測定方法中來尋找適合乳品蛋白質測定的方法。主要選用考馬斯亮藍法(bradford法) 29,35，雙縮脲法31，與凱氏定氮法的結果進行比較，從中找出最適合乳源蛋白質測定的方法。由于福林-酚試劑法對實驗時間要求嚴格，而實驗室的設備條件不能達到要求，所以本課題中將不再用此方法進行蛋白質含量的測定。本課題還研究反相高效液相色譜法33對牛乳蛋白和常見的三種可能摻假蛋白質進行定性分析，以期建立有效可行的分析檢測乳蛋白成分和牛乳中蛋白質摻假的方法。1.4 課題研究的主要內容 本課題的主要研究內容包括以下幾個問題：（1）通過凱氏定氮法準確測定牛奶中的蛋白質的含量。（2）使用雙縮脲(lowry)法、bradford方法檢測牛奶中的蛋白質的含量，并與國標法結果進行比較。（3）使用雙縮脲(lowry)法、bradford方法對于牛奶中摻入不同比例的尿素溶液、三聚氰胺溶液樣品，樣品經(jīng)前處理后，看能否準確測定牛乳蛋白含量。（4）應用反相高效液相色譜法（rp-hplc）對牛奶中的三聚氰胺和尿素的含量進行測定。 第2章 實驗材料及方法2.1 用凱氏定氮法測定牛奶中的蛋白質含量 2.1.1實驗儀器及藥品實驗儀器：凱氏定氮裝置、凱氏燒瓶、冷凝管、接收瓶、燒杯、移液管、100 ml容量瓶、量筒、酸式滴定管、分析天平、電熱套、研缽、藥匙、玻璃棒、膠頭滴管、吸管、燒杯和試管若干、鐵架臺等。實驗藥品：純牛奶、96%濃硫酸、40%(m/m)氫氧化鈉溶液、20 g/l的硼酸溶液、0.01mol/l的鹽酸標準溶液、無水乙醇、中性甲基紅、亞甲藍溶液、硫酸鉀、五水硫酸銅、30%過氧化氫、蒸餾水等。2.1.2實驗操作及步驟1、試劑的配制1) 40%的氫氧化鈉溶液：40 g氫氧化鈉加蒸餾水定容至100 ml。2) 0.01 mol/l鹽酸或硫酸標準溶液：可先配制成0.1 mol/l的母液，用時吸取10 ml定容至100 ml。3) 2%的硼酸溶液：2g硼酸加蒸餾水定容至100 ml。4) 混合催化劑：五水硫酸銅和硫酸鉀分別研碎,按1:15的比例混合均勻。5) 混合指示劑：0.1%的甲基紅乙醇溶液（0.10 g甲基紅試劑溶于20 ml無水乙醇乙醇，稀釋至100 ml）20 ml與0.1%亞甲基藍乙醇溶液（2 g亞甲基藍定溶于100 ml無水乙醇中）10 ml混合搖勻。 2、分析步驟取6個凱氏燒瓶，編號1、2、3、4、5、6，其中1、2、3號為待測樣品，4、5、6號為空白對照，分別按下述方法進行操作。1) 試樣消化。精密稱取牛奶樣品（空白樣為加蒸餾水）5 ml,小心放入干燥的凱氏燒瓶中, 避免試樣附著在管壁；加入混合催化劑10 g, 與試樣混合均勻； 再加入25 ml硫酸和5 ml的雙氧水；然后將燒瓶以45角斜放在支架上，用第2章 實驗材料及方法 電爐緩慢加熱，當瓶內泡沫消失后強熱至沸。待瓶壁不附有炭化物時，且瓶內液體為澄清淺綠色后，繼續(xù)加熱30 min使其完全分解。消煮好后關閉熱源讓其自然降溫。2) 堿化蒸餾。將消化好并冷卻至室溫的樣品溶液全部轉移到100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度搖勻。向100 ml接受瓶中加入20 ml 2%硼酸溶液和23滴混合指示液，將接收瓶置于冷凝管下口，使下口浸入到硼酸接收液中。再吸取10 ml定容后的樣品液，沿小玻璃杯移入反應室，并用少量的蒸餾水沖洗小玻璃杯，塞緊棒狀杯塞。向小玻璃杯中加入2030 ml40%的氫氧化鈉溶液（過量），慢慢提起棒狀杯塞，使氫氧化鈉緩慢流入反應室（防止反應室氣體從杯塞處外泄），立即塞緊棒狀杯塞，并在小玻璃杯中加入蒸餾水使之密封。通入蒸汽5 min，降低接收瓶位置使冷凝管末端離開液面后再繼續(xù)蒸餾1 min，用少量蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液并入接收瓶，取下接收瓶。3) 滴定。用0.01 mol/l的鹽酸標準溶液滴定接收瓶瓶中的液體，使之剛剛出現(xiàn)灰紫色即為終點，記錄所消耗0.01 mol/l的鹽酸標準溶液的體積（ml）。4) 計算。根據(jù)所消耗的標準鹽酸的體積，計算出總的氮的含量，再乘以蛋白質中氮的轉化系數(shù)即可得到樣品中的蛋白質的含量。即：計算公式： 式中：x-試樣的蛋白質含量(g/ 100ml) v1-滴定樣品消耗鹽酸體積( ml) v2-滴定空白樣消耗鹽酸體積( ml) c-所用標準鹽酸的濃度( mol/ l) 0. 014-每毫克當量氮的克數(shù) f-食品中氮換算為蛋白質的系數(shù)，奶制品f值為6.38 m-奶樣品的質量(g) 2.2 雙縮脲法測定牛奶中的蛋白質含量 2.2.1實驗儀器及藥品雙縮脲法中用到的實驗儀器及藥品除凱氏定氮法外，還需要特別用到的如下所示：實驗儀器：722型光柵分光光度計(如圖2-1)、試管若干、移液槍、移液管、離心機。圖2-1 722型光柵分光光度計實驗藥品：酒石酸鉀鈉、碘化鉀、酪蛋白（用作標準蛋白）、乙腈、6%naoh溶液。2.2.2實驗操作及步驟1、試劑的準備雙縮脲試劑：稱取沒有丟失結晶水的硫酸銅（cuso45h2o）3 g，溶于 500 ml新鮮制備的蒸餾水中，加入酒石酸鉀鈉9 g，碘化鉀5 g，攪拌至完全溶解。另取24 g氫氧化鈉溶解于新鮮制備的蒸餾水約100 ml 中，完全溶解后加至前述溶液中，最后以蒸餾水稀釋至1 l。置聚乙烯瓶內蓋緊保存。6%naoh溶液：先配成naoh濃溶液，然后稀釋成6%naoh溶液。酪蛋白標準蛋白溶液(1 mg/ml)：準確稱取110 mg的酪蛋白，加水溶解定溶至100 ml即為l mg/ml標準酪蛋白溶液。2、摻雜樣品處理1）牛奶中摻入尿素溶液的摻假樣品處理根據(jù)凱氏定氮法測得的牛奶中的氮含量配置尿素溶液，使每毫升尿素溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量。取不同體積的牛奶5份，樣品1為l ml牛奶(作為摻假牛乳的標準樣品)，樣品25分別為0.9 ml、0.8 ml、0.7 ml、0.5 ml的牛奶，然后向25號樣品中添加不同體積的尿素溶液，使得總體積都為1 ml，配制的樣品編號及含量如表2-1所示。表2-1 雙縮脲法測定方法中牛奶中添加尿素溶液的配制樣品編號牛奶所占比例牛奶/ ml尿素溶液/ ml1100%10290%0.90.1380%0.80.2470%0.70.3550%0.50.52）牛奶中摻入三聚氰胺溶液的摻假樣品處理根據(jù)凱氏定氮法測得的牛奶中的氮含量配置三聚氰胺溶液，使每毫升三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量。取不同體積的牛奶4份，以樣品1作為對照樣，樣品69分別為0.9 ml、0.8 ml、0.7 ml、0.5 ml的牛奶，然后向69號樣品中添加不同體積的三聚氰胺溶液，使得總體積都為1 ml，配制的樣品編號及含量如表2-2所示。表2-2 雙縮脲法測定方法中牛奶中添加三聚氰胺溶液的配制樣品編號牛奶所占比例牛奶/ ml三聚氰胺溶液/ ml690%0.90.1780%0.80.2870%0.70.3950%0.50.53、樣品前處理向19號樣品中分別加入13 ml乙腈33和5 ml水，劇烈振蕩6 min，充分混勻后靜置10 min，在10000 r/min轉速下，離心20 min，去上清，沉淀待用。將上述各沉淀樣品中加入少量的水和l ml的0.1 mol/l氫氧化鈉溶液溶解，加水定溶至50 ml待用。4、實驗操作步驟1）標準蛋白曲線的繪制(1)取6支試管，編號，取出一支試管作為空白對照，然后分別向其余的5支試管中準確的加入0ml，0.2 ml，0.4 ml，0.6 ml，0.8 ml，1.0 ml濃度為lmg/ml標準蛋白質溶液，然后用蒸餾水分別將各試管補齊到1.5 ml（如表2-3所示）。再向分別各試管中加入1.5 ml6%的氫氧化鈉溶液，最后分別向各試管中加入0.15 ml的雙縮脲試劑，每加完一管，立刻混合搖勻。(2)經(jīng)充分混合后在室溫下放置30 min。就可以開始用石英比色皿在分光光度計上測定各樣品在550 mn處的光吸收值a550nm，空白對照樣品為1號試管，即1.5 ml水，1.5 ml6的氫氧化鈉溶液和0.15 ml的雙縮脲試劑。(3)以用吸光度值a550nm為縱坐標，標準蛋白質量(mg)為橫坐標，繪制標準曲線圖，可得到一條標準曲線。2）樣品中的蛋白含量測定取9只試管并編號，19號試管中各按2.2.2中2中的順序對應的取一定量的摻雜不同濃度并處理過的未知樣品，按照1）中的測定方法，使未知樣品測定值在標準曲線的測定范圍內。根據(jù)所測定的a550nm值，在(3)中制得的標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，再乘以稀釋倍數(shù)計算出原樣品中的蛋白濃度(mg/m1)。表2-3 雙縮脲法實驗表試管號試劑123456標準蛋白溶液/ml00.20.40.60.81.0蒸餾水/ml1.51.31.10.90.70.52.3 考馬斯亮藍法測定牛奶中的蛋白質含量 2.3.1實驗儀器及藥品考馬斯亮藍法中用到的實驗儀器及藥品與雙縮脲法中所用的儀器及藥品基本相同，需要特別用到藥品的如下所示：實驗藥品：考馬斯亮藍-g-250染料、85%的磷酸。2.3.2實驗操作及步驟1、試劑的準備考馬斯亮藍g-250溶液：稱取 100mg 考馬斯亮藍 g-250，溶于 50 ml乙醇中，加入 100 ml 85%的磷酸，再用蒸餾水定容到1 l，濾紙過濾。2、摻雜樣品處理1）牛奶中摻入尿素溶液的摻假樣品處理根據(jù)凱氏定氮法測得的牛奶中的氮含量配置尿素溶液，使每毫升尿素溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量。 取不同體積的牛奶5份，樣品1為l ml牛奶(作為摻假牛乳的標準樣品)，樣品25分別為0.9 ml、0.8 ml、0.7 ml、0.5 ml的牛奶，然后向25號樣品中添加不同體積的尿素溶液，使得總體積都為1 ml，配制的樣品編號及含量如表2-4所示。表2-4 考馬斯亮藍測定方法中牛奶中添加尿素溶液的配制樣品編號牛奶所占比例牛奶/ ml尿素溶液/ ml1100%10290%0.90.1380%0.80.2470%0.70.3550%0.50.52）牛奶中摻入三聚氰胺溶液的摻假樣品處理根據(jù)凱氏定氮法測得的牛奶中的氮含量配置三聚氰胺溶液，使每毫升三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量。取不同體積的牛奶4份，以樣品1作為對照樣，樣品69分別為0.9 ml、0.8 ml、0.7 ml、0.5 ml的牛奶，然后向25號樣品中添加不同體積的三聚氰胺溶液，使得總體積都為1 ml，配制的樣品編號及含量如表2-5所示。表2-5 考馬斯亮藍測定方法中牛奶中添加三聚氰胺溶液的配制樣品編號牛奶所占比例牛奶/ ml三聚氰胺溶液/ ml690%0.90.1780%0.80.2870%0.70.3950%0.50.53、樣品前處理向16號樣品中分別加入13 ml乙腈和5 ml水，劇烈振蕩6 min，充分混勻后靜置10 min，在10000 r/min轉速下，離心20 min，去上清液，沉淀待用。將上述各沉淀樣品中加入少量的水和l ml的0.1 mol/l氫氧化鈉溶液溶解，加水定溶至50 ml。從各定溶好的各樣品中分別取l ml，然后再用9 ml的蒸餾水稀釋至考馬斯亮藍法的檢測范圍內。4、實驗操作步驟1）標準蛋白曲線的繪制(1)取6支試管，編號，取出一支試管作為空白對照，然后分別向其余的5支試管中準確的加入0 ml，0.2 ml，0.4 ml，0.6 ml，0.8 ml，1.0 ml濃度為l mg/ml標準蛋白質溶液，然后用蒸餾水分別將各試管補齊到1.5 ml，其添加方法及順序如表2-6所示。最后再分別向各試管中加入5 ml的考馬斯亮藍g-250溶液，每加完一管，立刻混合搖勻。(2)經(jīng)充分混合后在室溫下放置25 min后就可以開始用石英比色皿在分光光度計上測定各樣品在595 mn處的光吸收值a595nm，空白對照樣品為1號試管，即1.5 ml水，5 ml考馬斯亮藍g-250溶液。(3)以用吸光度值a595nm為縱坐標，標準蛋白質量(mg)為橫坐標，繪制標準曲線圖，可得到一條標準曲線。表2-6 考馬斯亮藍法實驗表試管號試劑123456標準蛋白溶液/ml00.20.40.60.81.0蒸餾水/ml1.51.31.10.90.70.52）樣品中的蛋白含量測定取9只試管并編號，19號試管中各按2.3.2中2中的順序對應的取一定量的摻雜不同濃度并處理過的未知樣品，按照1）中的測定方法，使未知樣品測定值在標準曲線的測定范圍內。根據(jù)所測定的a595nm值，在(3)中制得的標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，再乘以稀釋倍數(shù)計算出原樣品中的蛋白濃度(mg/ml)。2.4反相高效液相色譜法測定牛奶中的三聚氰胺及尿素的含量 2.4.1實驗儀器及藥品儀器：高效液相色譜儀（如圖2-1所示）、一次性注射器、針式濾膜、精密ph試紙。藥品：乙腈（色譜純）、磷酸二氫鉀、超純水（或用娃哈哈純凈水代替）。注：在本方法中所用的水均為超純水。2.4.2實驗操作及步驟1、試劑的準備1）尿素標準溶液：準確稱取2 g尿素標準品于100 ml容量瓶中配制成濃度為20.00 mg/ml的尿素標準儲備液，再分別稀釋為濃度為1 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml的標準溶液，用 0.45 m的針式濾膜過濾，濾液待用。2）三聚氰胺標準溶液：準確稱取100 mg三聚氰胺標準品于100 ml棕色容量瓶中，配制成濃度為1 mg/ml的標準儲備液。再將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到的濃度為5 g/ml、25 g/ml、50 g/ml、75 g/ml、100 g/ml 的標準工作液。用0.45 m的針式濾膜過濾，濾液待用。3）磷酸鹽緩沖液：濃度為0.05 mol/l。稱取6.8 g磷酸二氫鉀（準確至0.01 g），加800 ml水使其完全溶解后，再用磷酸調節(jié)為ph=3.0，用水稀釋至1l，用0.45 m的針式濾膜過濾后備用。2、樣品前處理稱取5 ml牛奶樣品，置于50 ml具塞刻度試管中，加入30 ml乙腈，劇烈振蕩6 min后加水定容至滿刻度，充分混勻，靜置3 min，用一次性注射器吸取上清液用針式過濾器(0.45 m)過濾后，作為高效液相色譜分析用試樣。圖2-2 高效液相色譜儀3、尿素及三聚氰胺標準曲線的繪制1）尿素標準曲線的繪制：按以下色譜條件對尿素標準溶液進行高效液相色譜檢測。色譜條件： 色譜柱：zorbax300sb-c18色譜柱（250 mm 4.6 mm，5 m） 檢測器：紫外檢測器 流動相：乙腈：水=5：95 (體積比) 檢測波長：220 nm 流速：1 ml/min 柱溫：室溫 進樣體積：10 l在上面的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后注入尿素標準系列溶液，記錄色譜峰面積，以尿素溶液的質量濃度（mg/ml）為橫坐標，相應的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。2）三聚氰胺標準曲線的繪制：按以下色譜條件對三聚氰胺標準溶液進行高效液相色譜檢測。色譜條件：色譜柱：zorbax300sb-c18色譜柱（250 mm 4.6 mm，5 m）檢測器：紫外檢測器 流動相：磷酸鹽緩沖液：乙腈=70：30 (體積比) 檢測波長：240 nm 流速：1 ml/min 柱溫：40 進樣體積：10 l在上面的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后注入三聚氰胺標準系列溶液，記錄色譜峰面積，以三聚氰胺溶液的質量濃度（mg/ml）為橫坐標，相應的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。4、樣品的測定將2中制備好的樣品作為空白樣