奶制品氮含量測(cè)定技術(shù)的研究本科設(shè)計(jì).doc

本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）奶制品氮含量測(cè)定技術(shù)的研究李寧燕山大學(xué)里仁學(xué)院2013年 6月 本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）奶制品氮含量測(cè)定技術(shù)的研究學(xué) 院： 里仁學(xué)院 專(zhuān) 業(yè)： 應(yīng)用化學(xué) 學(xué)生 姓名： 李寧 學(xué) 號(hào)： 091610021037 指導(dǎo) 教師： 李阿丹 答辯 日期： 2013年6月16日 燕山大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書(shū)學(xué)院：里仁學(xué)院 系級(jí)教學(xué)單位：建環(huán)系 學(xué)號(hào)091610021037學(xué)生姓名李寧專(zhuān) 業(yè)班 級(jí)應(yīng)用化學(xué)09-2班題目題目名稱(chēng)奶制品氮含量測(cè)定技術(shù)的研究題目性質(zhì)1.理工類(lèi)：工程設(shè)計(jì) （ ）；工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)研究型（ ）；理論研究型（ ）；計(jì)算機(jī)軟件型（ ）；綜合型（ ）2.文管理類(lèi)（ ）；3.外語(yǔ)類(lèi)（ ）；4.藝術(shù)類(lèi)（ ）題目類(lèi)型1.畢業(yè)設(shè)計(jì)（ ） 2.論文（ ）題目來(lái)源科研課題（ ） 生產(chǎn)實(shí)際（ ）自選題目（ ） 主要內(nèi)容利用凱氏定氮法，雙縮脲法，考馬斯亮藍(lán)法以及反相高效液相色譜法對(duì)牛奶以及摻雜尿素和三聚氰胺的牛奶進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比分析這幾種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，從中找出最適合的蛋白質(zhì)測(cè)定的方法?；疽笳莆崭鞣N檢測(cè)方法的基本原理，明確每種檢測(cè)方法的基本內(nèi)容，熟練掌握分光光度計(jì)，高效液相色譜儀等儀器的使用方法。參考資料中國(guó)期刊數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法與乳制品中蛋白含量測(cè)定奶制品中蛋白質(zhì)測(cè)定方法相關(guān)文獻(xiàn)周 次第1 4周第510周第1113周第1416周第1720周應(yīng)完成的內(nèi)容查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解奶制品中氮含量的測(cè)定方法，提交文獻(xiàn)綜述。實(shí)驗(yàn)階段，用凱氏定氮法、bradford法、雙縮脲法和反相高效液相色譜法測(cè)定牛奶及摻雜的牛奶進(jìn)行檢測(cè)分析。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理計(jì)算。分析比較幾種方法，并提出自己的看法。撰寫(xiě)畢業(yè)論文，提交論文。指導(dǎo)教師：李阿丹職稱(chēng)：副教授 2013年6月16日系級(jí)教學(xué)單位審批： 年 月 日摘要本文采用凱氏定氮法，雙縮脲法，考馬斯亮藍(lán)法以及反相高效液相色譜法分別對(duì)牛奶以及摻入尿素和三聚氰胺的牛奶樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，并對(duì)幾種方法測(cè)得的進(jìn)行比較。在雙縮脲法和考馬斯亮藍(lán)法中對(duì)樣品的前處理時(shí)選用的是有機(jī)溶劑沉淀法，使用乙腈提取牛奶中的蛋白質(zhì)。高效液相色譜法是用的反相色譜法，使用zorbax300sb-c18色譜柱（250 mm 4.6 mm，5 m）和紫外檢測(cè)器，用標(biāo)準(zhǔn)添加法對(duì)純牛奶樣品中的尿素和三聚氰胺的含量進(jìn)行了檢測(cè)分析。通過(guò)對(duì)結(jié)果的分析以及對(duì)比可知，用凱氏定氮法測(cè)得的氮含量是牛奶中的總氮含量，該方法消耗時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣。用雙縮脲法和考馬斯亮藍(lán)法要比凱氏定氮法簡(jiǎn)便迅速，并且這兩種方法也都可以快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出蛋白質(zhì)的含量。用反相高效液相色譜法測(cè)定時(shí)待測(cè)樣品在出峰處不會(huì)受到牛奶中其它組分的干擾，因此可用于奶制品中尿素和三聚氰胺含量的準(zhǔn)確檢測(cè)與分析。關(guān)鍵詞牛奶蛋白質(zhì)；凱氏定氮法；雙縮脲法；考馬斯亮藍(lán)法；反相高效液相色譜法；有機(jī)溶劑沉淀法 燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）abstractin this paper, the kjeldahl method, biuret method, coomassie brilliant blue method and high performance liquid chromatography(hplc), respectively, for milk and milk mixed with urea and melamine test samples analyzed and measured by several methods for comparison. in the biuret method and coomassie brilliant blue method for sample pre-treatment of choice is an organic solvent precipitation method using acetonitrile extract the protein in milk. hplc with reversed-phase chromatography using zorbax300sb-c18 column (250 mm 4.6 mm, 5 m) and a uv detector, using standard addition method for pure milk sample content of urea and melamine the detection and analysis.through analysis and comparison of results shows that, with the kjeldahl nitrogen content measured by the total nitrogen content of the milk, the method consumes a long time and complicated operation. with the biuret method and coomassie blue staining than kjeldahl method is simple and rapid, and these two methods can also be quickly and accurately detect the protein content. by reversed-phase high-performance liquid chromatography peaks when the sample in place will not be interference from other components in milk, it can be used in dairy products of urea and melamine accurate detection and analysis.keywords kjeldahl method; biuret method; bradford method; reverse phase high performance liquid chromatography(rp-hplc); organic solvent precipitationiii目 錄摘要iabstractii第1章 緒論11.1 課題背景11.2 蛋白質(zhì)測(cè)定方法概述21.2.1 凱氏定氮法21.2.2 雙縮脲法(biuret法)31.2.3 福林-酚試劑法（lowry法）51.2.4 考馬斯亮藍(lán)法（bradford法）61.2.5 高效液相色譜法（hplc）71.3 課題研究的意義81.4 課題研究的主要內(nèi)容9第2章 實(shí)驗(yàn)材料及方法102.1 用凱氏定氮法測(cè)定牛奶中的蛋白質(zhì)含量102.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品102.1.2 實(shí)驗(yàn)操作及步驟102.2 雙縮脲法測(cè)定牛奶中的蛋白質(zhì)含量122.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品122.2.2 實(shí)驗(yàn)操作及步驟122.3 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定牛奶中的蛋白質(zhì)含量152.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品152.3.2 實(shí)驗(yàn)操作及步驟152.4 反相高效液相色譜法測(cè)定牛奶中的三聚氰胺及尿素的含量182.4.1 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品182.4.2 實(shí)驗(yàn)操作及步驟18第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析213.1 凱氏定氮法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析213.1.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理213.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析223.2 雙縮脲法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析223.2.1 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計(jì)算223.2.2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)的繪制223.2.3 雙縮脲法對(duì)摻雜尿素溶液的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定233.2.4 雙縮脲法對(duì)摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定253.3 考馬斯亮藍(lán)法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析263.3.1 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計(jì)算263.3.2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)的繪制263.3.3 考馬斯亮藍(lán)法對(duì)摻雜尿素的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定283.3.4 考馬斯亮藍(lán)法對(duì)摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定293.4 反向高效液相色譜法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析303.4.1 尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制303.4.2 反向高效液相色譜法測(cè)樣品中的尿素和三聚氰胺33結(jié)論36參考文獻(xiàn)37致謝40附錄1 開(kāi)題報(bào)告41附錄2 文獻(xiàn)綜述44附錄3 中文譯文47附錄4 外文原文56 65第1章 緒論 第1章 緒論1.1 課題背景隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人民生活水平的不斷提高，以及營(yíng)養(yǎng)知識(shí)的普及和宣傳，越來(lái)越多的人開(kāi)始注重在飲食方面的質(zhì)量，越來(lái)越多的人追求營(yíng)養(yǎng)的均衡發(fā)展。蛋白質(zhì)作為人類(lèi)最重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一, 是生物體細(xì)胞的重要組成成分，有許多的生物學(xué)功能。而蛋白質(zhì)又是牛奶及奶制品中的主要成分，乳蛋白中含有大量的人體必需氨基酸，是人體細(xì)胞不可缺少的，也是牛乳中最重要的特征營(yíng)養(yǎng)成分，因此，作為人們攝取蛋白質(zhì)的主要來(lái)源的奶制品深受人們的青睞。牛奶中的蛋白質(zhì)含量越高，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值就越高，因此乳及乳制品中蛋白質(zhì)含量的高低將決定產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低和質(zhì)量的優(yōu)劣。過(guò)去幾十年中，乳品經(jīng)常被用作為嬰幼兒和老弱病殘?jiān)械臓I(yíng)養(yǎng)食品，到近些年，乳品已就成為多數(shù)人的生活必需品，因此，牛乳的產(chǎn)銷(xiāo)量在持續(xù)不斷的快速增長(zhǎng)，同時(shí)，乳制品消費(fèi)量的急劇增大也導(dǎo)致了奶源的嚴(yán)重不足。在這種情況下，在巨大的經(jīng)濟(jì)利益的誘惑下，一些不法商販開(kāi)始在牛乳中摻雜使假，以從中謀求暴利。乳制品中的摻物的種類(lèi)有很多種，如：水、米湯、豆?jié){、淀粉、蔗糖、食鹽、碳酸鈉、雙氧水、電解質(zhì)溶液、牛尿、尿素、三聚氰胺、植物油、陳乳、白礬、亞硝酸鹽、硝酸鹽、洗衣粉、抗生素、化肥等1-3。其摻雜的方式也是多種多樣的，總結(jié)起來(lái)有以下幾種情況：摻入非蛋白成分(尿素，三聚氰胺，乳脂肪，乳糖等)以使奶制品中的蛋白氮含量增加；摻入雜蛋白(大豆粉，明膠等)以使奶制品中的蛋白質(zhì)的種類(lèi)增加；摻入價(jià)格低廉的乳源蛋白如乳清粉等以使奶制品的成本降低；摻入其他動(dòng)物乳汁以降低奶制品的成本。這種在牛乳中摻雜使假的行為不僅極大損害了廣大人民群眾的身體健康和切身利益，同時(shí)也大大降低消費(fèi)者對(duì)乳品企業(yè)和乳品質(zhì)量的信任，甚至使政府在人民心目中的形象遭到破壞。例如2008年的三鹿奶粉事件所造成的后果和社會(huì)影響說(shuō)明，乳品質(zhì)量好壞與否不僅關(guān)系到嬰幼兒和青少年的健康成長(zhǎng)，也關(guān)系到無(wú)數(shù)家庭的幸福、社會(huì)的和諧以及我們國(guó)家的形象。雖然這些年來(lái)我們國(guó)家一直都在不停地打假治假，但是這種摻假造假的現(xiàn)象迄今都是禁而未止，摻雜使假的情況時(shí)不時(shí)的浮出水面，乳制品的質(zhì)量安全問(wèn)題也已經(jīng)引起了全社會(huì)的普遍關(guān)注。1.2 蛋白質(zhì)測(cè)定方法概述 蛋白質(zhì)是乳及乳制品中的主要成分，是牛乳中最重要的特征營(yíng)養(yǎng)成分，乳及乳制品中蛋白質(zhì)含量是必測(cè)指標(biāo)4。因此，近年來(lái)，人們發(fā)展了許多測(cè)定蛋白質(zhì)的方法。目前蛋白質(zhì)的測(cè)定方法主要有凱氏定氮法、分光光度法、和滴定法等5。其中分光光度法又包括：雙縮脲法，考馬斯亮藍(lán)法，福林-酚試劑法、bca法和紫外吸收法等，滴定法包括有甲醛滴定法、ph滴定法等。近些年來(lái)，色譜技術(shù)也開(kāi)始用于蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)之中。1.2.1 凱氏定氮法我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定食品中蛋白質(zhì)(gb/t50095-2003)6有2種方法:凱氏定氮法和比色法。其中，凱氏定氮法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中首推的蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法。凱氏定氮法（其裝置圖如下圖1-1）的基本原理是將含氮的有機(jī)物與濃圖1-1 凱氏定氮法消化、蒸餾裝置硫酸共同加熱,反應(yīng)過(guò)程中樣品中的碳、氫等元素被氧化成二氧化碳和水而逸出,有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨,并且進(jìn)一步與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，通常稱(chēng)此過(guò)程為“消化”。但是這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢,通常需要加入硫酸鉀來(lái)提高反應(yīng)液的沸點(diǎn),并加入硫酸銅作為催化劑,以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行,指示消化終點(diǎn)的到達(dá)。消化之后向消化液中加入濃堿，濃堿可以使消化液中的硫酸銨分解,游離出氨,水蒸氣將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量一定濃度的硼酸溶液中,該過(guò)程被稱(chēng)為“堿化蒸餾”。硼酸吸收氨后使溶液中的氫離子的濃度降低,用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定吸收后的硼酸溶液,直到恢復(fù)溶液中原來(lái)氫離子濃度時(shí)為止,最后根據(jù)所消耗標(biāo)準(zhǔn)酸的當(dāng)量數(shù)即可計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量,再乘以蛋白質(zhì)系數(shù)即為蛋白質(zhì)的含量7。凱氏定氮法是測(cè)定待測(cè)樣品中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確的方法,也是各種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)科研人員的不斷研究和改進(jìn)8-10,凱氏定氮法已具有應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、回收率較好、使用儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。但是該方法操作消耗時(shí)間長(zhǎng),消化一個(gè)樣品至少需要2個(gè)小時(shí),完成整個(gè)操作流程一般需要67個(gè)小時(shí)左右,而且在消化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的有害氣體二氧化硫，污染工作環(huán)境,危害操作人員的身體健康。所以該方法一般是在實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)性較好的條件下由訓(xùn)練有素的人員來(lái)完成11。在我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，凱氏定氮法測(cè)定的是總氮的含量，因此得到的結(jié)果代表的是乳品中粗蛋白的含量；而在國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(iso，aoac，idf)中，先用三氯乙酸對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，使蛋白質(zhì)沉淀，然后再分別對(duì)沉淀中的蛋白態(tài)氮和濾液中的非蛋白態(tài)氮進(jìn)行凱氏定氮，測(cè)定的結(jié)果可真實(shí)反映乳品真蛋白的含量12。由于凱氏定氮法操作費(fèi)時(shí)，所以學(xué)者們又研究并建立了快速檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，即分光光度法，下面將逐一介紹一下常用的幾種分光光度法。1.2.2雙縮脲法(biuret法)雙縮脲(h2nocnhconh2)是兩個(gè)分子脲在180 左右加熱，放出一分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液（naoh）中，雙縮脲能與銅離子（cu2+）作用，生成紫紅色絡(luò)合物（該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1-2），該反應(yīng)即雙縮脲反應(yīng)。圖1-2 紫色絡(luò)合物分子結(jié)構(gòu)式由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)所特有的，而為氨基酸所沒(méi)有的一種顏色反應(yīng)。一般分子中含有兩個(gè)氨基甲酪基（即肽鍵：-co-nh-）的化合物與堿性銅溶液作用，就會(huì)形成紫色或藍(lán)紫色絡(luò)合物。具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接相連的肽鍵，或間隔一個(gè)碳原子相連的肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物，他們也都可以發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。肽鍵是組成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與cu2+作用生成紫紅色絡(luò)合物，且在一定條件下，顏色的深淺程度與蛋白質(zhì)的含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比爾定律，即蛋白質(zhì)濃度隨著顏色的加深而呈增加的趨勢(shì)，且成正比關(guān)系，而顏色的變化與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無(wú)關(guān)，因此我們可以通過(guò)雙縮脲法比色的方法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，這種方法也是常用的方法之一13。雙縮脲反應(yīng)主要涉及肽鍵，因此受蛋白質(zhì)特異性的影響較小。而且使用的試劑價(jià)廉易得，操作簡(jiǎn)便，可測(cè)定的范圍為110 mg蛋白質(zhì)，適于精度要求不太高的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，能測(cè)出的蛋白質(zhì)含量須在約0.5 mg以上。雙縮脲法的缺點(diǎn)是精確度低、所需樣品量大，干擾此測(cè)定的物質(zhì)有很多。主要的干擾有：酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、trsi緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用14。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸鈉(l%),硝酸鈉(l%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液對(duì)顯色無(wú)影響,但這些物質(zhì)濃度高時(shí),必須作校正曲線(xiàn)。含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉-氫氧化鈉溶液,即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高,顯色后會(huì)較淺,則必須提高碳酸鈉-氫氧化鈉溶液的濃度1-2倍。1.2.3福林-酚試劑法（lowry法）福林-酚試劑法（lowry法）是lowry 在雙縮脲方法的基礎(chǔ)上發(fā)展的。lowry確定了使用該方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的基本步驟,他在雙縮脲試劑的基礎(chǔ)上又增加了一種增強(qiáng)顯色的試劑磷鉬酸和磷鎢酸的混合液,蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的酚羥基會(huì)將它們還原，從而產(chǎn)生深藍(lán)色(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物),增加顯色量,這樣就提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。lowry法是最靈敏的蛋白質(zhì)測(cè)定方法之一,該法在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。（1）實(shí)驗(yàn)原理福林-酚試劑法的顯色原理是在雙縮脲法的基礎(chǔ)上12,加入了第二種試劑福林-酚試劑,增加了顯色量,從而達(dá)到了提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度的效果。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因是:在堿性環(huán)境中,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子結(jié)合生成復(fù)合物；福林-酚試劑中的磷鋁酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深藍(lán)色(鋁藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物)。lowry法中的樣品的吸光度取決于一些氨基酸的濃度，同時(shí)也取決于叔肽的量，因?yàn)閮烧叨紩?huì)使福林-酚試劑的量減少34，在一定的條件下,藍(lán)色的深度與蛋白的量是成正比的。（2）優(yōu)缺點(diǎn)lowry法的優(yōu)點(diǎn)在于它的靈敏度高,與雙縮脲法相比，它的靈敏度要高得多。其缺點(diǎn)有：消耗時(shí)間較長(zhǎng),而且要精確的控制操作的時(shí)間,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)也不是嚴(yán)格的直線(xiàn)形式,且專(zhuān)一性較差,干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脈反應(yīng)發(fā)生干擾的離子,同樣容易干擾福林-酚反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。需要注意的是，在進(jìn)行測(cè)定時(shí),加入福林-酚試劑時(shí)要特別小心,因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性條件下穩(wěn)定,但上述的還原反應(yīng)只能在ph=10的情況下才可以進(jìn)行,故當(dāng)福林-酚試劑加入堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時(shí),必須立即混勻,以便在磷鋁酸-磷鎢酸試劑在遭到破壞之前,還原反應(yīng)就能發(fā)生15。1.2.4考馬斯亮藍(lán)法（bradford法） 由于biuret法和lowry法存在著很多的弊端，因此人們開(kāi)始去尋找更加完善的蛋白質(zhì)測(cè)定方法。bradford在1976年根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)而建立了考馬斯亮藍(lán)法，這種測(cè)定蛋白質(zhì)的方法具有超過(guò)其他幾種方法的突出的優(yōu)點(diǎn),因而得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法16。（1）實(shí)驗(yàn)原理由于考馬斯亮藍(lán)g-250染料存在著兩種不同的顏色形式棕紅色和藍(lán)色，在酸性溶液中染料與蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸和某些堿性氨基酸發(fā)生反應(yīng),使染料的最大吸收峰的位置(max)由465 nm變?yōu)?95 nm，溶液的顏色也由棕紅色變?yōu)樗{(lán)色。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)(10-1000 g/ml)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合的規(guī)律符合比爾定律(beers law)17。通過(guò)測(cè)定在595 nm下的吸光度值a595nm，可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。蛋白質(zhì)和染料結(jié)合的過(guò)程很快,只需2 min左右即可完全反應(yīng),呈現(xiàn)出最大光的吸收,并且穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1 h。超過(guò)穩(wěn)定時(shí)間之后,蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物就會(huì)發(fā)生聚合并沉淀出來(lái)。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù),因此在測(cè)定蛋白質(zhì)時(shí)的靈敏度很高18,19。（2）優(yōu)缺點(diǎn)考馬斯亮藍(lán)法的優(yōu)點(diǎn)在于它的靈敏度高。與福林-酚試劑法相比，考馬斯亮藍(lán)法的靈敏度要高四倍左右,其最低的蛋白質(zhì)檢測(cè)量可低達(dá)10g。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與考馬斯亮藍(lán)g-250染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色的變化很大,再加上蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物又有很高的消光系數(shù),因而吸光度值隨蛋白質(zhì)濃度的變化要比福林-酚試劑法大的多20。bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于它測(cè)定的快速和簡(jiǎn)便性。完成一個(gè)樣品的測(cè)定, 只需加一種試劑，并且只需要5分鐘左右即可。由于考馬斯亮藍(lán)g-250染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程大約只要2分鐘就可以完成,其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定,且在5分鐘至20分鐘之間時(shí)的顏色的穩(wěn)定性最好，因而bradford法完全不用像福林-酚法那樣費(fèi)時(shí)并且還必須嚴(yán)格地控制時(shí)間21。除上述優(yōu)點(diǎn)之外，bradford法干擾物質(zhì)少，如干擾福林-酚試劑法的k+、na+、mg2+ 離子、tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edat等物質(zhì)均不會(huì)對(duì)bradford法造成干擾22。bradford法在測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)也有一些不足之處。由于不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量分布不同,因此考馬斯亮藍(lán)法在測(cè)不同的蛋白質(zhì)時(shí)會(huì)有較大的偏差,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)通常選用-球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白以減少這方面的偏差23。另外，bradford法在測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)也仍然存在一些物質(zhì)的干擾,主要的干擾物質(zhì)有:去污劑、trtion x-100、十二烷基磺酸鈉(sds)和氫氧化鈉24。第三，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在蛋白質(zhì)濃度較大時(shí)有輕微的非線(xiàn)性,因此不能使用比爾定律直接進(jìn)行計(jì)算,而只能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度25。除此之外，在測(cè)定中, 也會(huì)有少部分的蛋白-染料復(fù)合物吸附于比色皿的壁上,實(shí)驗(yàn)證明這種蛋白-染料復(fù)合物的吸附的影響是可以忽略的,實(shí)驗(yàn)完畢后用乙醇可以將藍(lán)色的比色皿清洗干凈。1.2.5 高效液相色譜法（hplc）高效液相色譜法（high performance liquid chromatography / hplc）又稱(chēng)“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。高效液相色譜法是在經(jīng)典的液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。高效液相色譜法是在高壓條件下，溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換的過(guò)程，它借溶質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離26。高效液相色譜法有“四高一廣”的特點(diǎn)：高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在1530分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01 ng，進(jìn)樣量在微升數(shù)量級(jí)。應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長(zhǎng)，相互補(bǔ)充。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測(cè)器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測(cè)池等）中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜。高效液相色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法。其中，正向色譜法是采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑（烷烴類(lèi)如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類(lèi)、胺類(lèi)、羰基類(lèi)及氨基酸類(lèi)等）。而反向色譜法則一般用非極性固定相（如c18、c8)；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。rpc在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)hplc應(yīng)用的80%左右。1.3 課題研究的意義 奶制品已經(jīng)成為每個(gè)家庭的生活必需品，由于中國(guó)家庭較多，對(duì)奶制品的需求量大，因此有不少?gòu)S商為牟取暴利，向奶制品中摻假。在原奶中摻雜摻假27,28，這種丑惡行為既影響了牛奶的品質(zhì)，又損害了消費(fèi)者的健康，在社會(huì)產(chǎn)生了極大的反響。然而在牛奶中摻入廉價(jià)的水解蛋白、其他動(dòng)物乳或者含氮有機(jī)化合物等新的摻假方式，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法29-34則難以檢出，現(xiàn)在的乳品檢測(cè)技術(shù)往往是等參假物出來(lái)后才能確定相對(duì)的檢測(cè)技術(shù)，因而不能未卜先知。為此，急需建立適應(yīng)新?lián)郊偾闆r的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)對(duì)牛奶蛋白質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn)，對(duì)牛奶中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，為牛奶的摻假檢驗(yàn)提供可靠數(shù)據(jù)，以確保奶制品的質(zhì)量和安全。本研究的目的是從幾種傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)測(cè)定方法中來(lái)尋找適合乳品蛋白質(zhì)測(cè)定的方法。主要選用考馬斯亮藍(lán)法(bradford法) 29,35，雙縮脲法31，與凱氏定氮法的結(jié)果進(jìn)行比較，從中找出最適合乳源蛋白質(zhì)測(cè)定的方法。由于福林-酚試劑法對(duì)實(shí)驗(yàn)時(shí)間要求嚴(yán)格，而實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備條件不能達(dá)到要求，所以本課題中將不再用此方法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。本課題還研究反相高效液相色譜法33對(duì)牛乳蛋白和常見(jiàn)的三種可能摻假蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析，以期建立有效可行的分析檢測(cè)乳蛋白成分和牛乳中蛋白質(zhì)摻假的方法。1.4 課題研究的主要內(nèi)容 本課題的主要研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)問(wèn)題：（1）通過(guò)凱氏定氮法準(zhǔn)確測(cè)定牛奶中的蛋白質(zhì)的含量。（2）使用雙縮脲(lowry)法、bradford方法檢測(cè)牛奶中的蛋白質(zhì)的含量，并與國(guó)標(biāo)法結(jié)果進(jìn)行比較。（3）使用雙縮脲(lowry)法、bradford方法對(duì)于牛奶中摻入不同比例的尿素溶液、三聚氰胺溶液樣品，樣品經(jīng)前處理后，看能否準(zhǔn)確測(cè)定牛乳蛋白含量。（4）應(yīng)用反相高效液相色譜法（rp-hplc）對(duì)牛奶中的三聚氰胺和尿素的含量進(jìn)行測(cè)定。 第2章 實(shí)驗(yàn)材料及方法2.1 用凱氏定氮法測(cè)定牛奶中的蛋白質(zhì)含量 2.1.1實(shí)驗(yàn)儀器及藥品實(shí)驗(yàn)儀器：凱氏定氮裝置、凱氏燒瓶、冷凝管、接收瓶、燒杯、移液管、100 ml容量瓶、量筒、酸式滴定管、分析天平、電熱套、研缽、藥匙、玻璃棒、膠頭滴管、吸管、燒杯和試管若干、鐵架臺(tái)等。實(shí)驗(yàn)藥品：純牛奶、96%濃硫酸、40%(m/m)氫氧化鈉溶液、20 g/l的硼酸溶液、0.01mol/l的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、無(wú)水乙醇、中性甲基紅、亞甲藍(lán)溶液、硫酸鉀、五水硫酸銅、30%過(guò)氧化氫、蒸餾水等。2.1.2實(shí)驗(yàn)操作及步驟1、試劑的配制1) 40%的氫氧化鈉溶液：40 g氫氧化鈉加蒸餾水定容至100 ml。2) 0.01 mol/l鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：可先配制成0.1 mol/l的母液，用時(shí)吸取10 ml定容至100 ml。3) 2%的硼酸溶液：2g硼酸加蒸餾水定容至100 ml。4) 混合催化劑：五水硫酸銅和硫酸鉀分別研碎,按1:15的比例混合均勻。5) 混合指示劑：0.1%的甲基紅乙醇溶液（0.10 g甲基紅試劑溶于20 ml無(wú)水乙醇乙醇，稀釋至100 ml）20 ml與0.1%亞甲基藍(lán)乙醇溶液（2 g亞甲基藍(lán)定溶于100 ml無(wú)水乙醇中）10 ml混合搖勻。 2、分析步驟取6個(gè)凱氏燒瓶，編號(hào)1、2、3、4、5、6，其中1、2、3號(hào)為待測(cè)樣品，4、5、6號(hào)為空白對(duì)照，分別按下述方法進(jìn)行操作。1) 試樣消化。精密稱(chēng)取牛奶樣品（空白樣為加蒸餾水）5 ml,小心放入干燥的凱氏燒瓶中, 避免試樣附著在管壁；加入混合催化劑10 g, 與試樣混合均勻； 再加入25 ml硫酸和5 ml的雙氧水；然后將燒瓶以45角斜放在支架上，用第2章 實(shí)驗(yàn)材料及方法 電爐緩慢加熱，當(dāng)瓶?jī)?nèi)泡沫消失后強(qiáng)熱至沸。待瓶壁不附有炭化物時(shí)，且瓶?jī)?nèi)液體為澄清淺綠色后，繼續(xù)加熱30 min使其完全分解。消煮好后關(guān)閉熱源讓其自然降溫。2) 堿化蒸餾。將消化好并冷卻至室溫的樣品溶液全部轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度搖勻。向100 ml接受瓶中加入20 ml 2%硼酸溶液和23滴混合指示液，將接收瓶置于冷凝管下口，使下口浸入到硼酸接收液中。再吸取10 ml定容后的樣品液，沿小玻璃杯移入反應(yīng)室，并用少量的蒸餾水沖洗小玻璃杯，塞緊棒狀杯塞。向小玻璃杯中加入2030 ml40%的氫氧化鈉溶液（過(guò)量），慢慢提起棒狀杯塞，使氫氧化鈉緩慢流入反應(yīng)室（防止反應(yīng)室氣體從杯塞處外泄），立即塞緊棒狀杯塞，并在小玻璃杯中加入蒸餾水使之密封。通入蒸汽5 min，降低接收瓶位置使冷凝管末端離開(kāi)液面后再繼續(xù)蒸餾1 min，用少量蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液并入接收瓶，取下接收瓶。3) 滴定。用0.01 mol/l的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定接收瓶瓶中的液體，使之剛剛出現(xiàn)灰紫色即為終點(diǎn)，記錄所消耗0.01 mol/l的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml）。4) 計(jì)算。根據(jù)所消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，計(jì)算出總的氮的含量，再乘以蛋白質(zhì)中氮的轉(zhuǎn)化系數(shù)即可得到樣品中的蛋白質(zhì)的含量。即：計(jì)算公式： 式中：x-試樣的蛋白質(zhì)含量(g/ 100ml) v1-滴定樣品消耗鹽酸體積( ml) v2-滴定空白樣消耗鹽酸體積( ml) c-所用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的濃度( mol/ l) 0. 014-每毫克當(dāng)量氮的克數(shù) f-食品中氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，奶制品f值為6.38 m-奶樣品的質(zhì)量(g) 2.2 雙縮脲法測(cè)定牛奶中的蛋白質(zhì)含量 2.2.1實(shí)驗(yàn)儀器及藥品雙縮脲法中用到的實(shí)驗(yàn)儀器及藥品除凱氏定氮法外，還需要特別用到的如下所示：實(shí)驗(yàn)儀器：722型光柵分光光度計(jì)(如圖2-1)、試管若干、移液槍、移液管、離心機(jī)。圖2-1 722型光柵分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)藥品：酒石酸鉀鈉、碘化鉀、酪蛋白（用作標(biāo)準(zhǔn)蛋白）、乙腈、6%naoh溶液。2.2.2實(shí)驗(yàn)操作及步驟1、試劑的準(zhǔn)備雙縮脲試劑：稱(chēng)取沒(méi)有丟失結(jié)晶水的硫酸銅（cuso45h2o）3 g，溶于 500 ml新鮮制備的蒸餾水中，加入酒石酸鉀鈉9 g，碘化鉀5 g，攪拌至完全溶解。另取24 g氫氧化鈉溶解于新鮮制備的蒸餾水約100 ml 中，完全溶解后加至前述溶液中，最后以蒸餾水稀釋至1 l。置聚乙烯瓶?jī)?nèi)蓋緊保存。6%naoh溶液：先配成naoh濃溶液，然后稀釋成6%naoh溶液。酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(1 mg/ml)：準(zhǔn)確稱(chēng)取110 mg的酪蛋白，加水溶解定溶至100 ml即為l mg/ml標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液。2、摻雜樣品處理1）牛奶中摻入尿素溶液的摻假樣品處理根據(jù)凱氏定氮法測(cè)得的牛奶中的氮含量配置尿素溶液，使每毫升尿素溶液的氮含量等于凱氏定氮法測(cè)得的牛奶的氮含量。取不同體積的牛奶5份，樣品1為l ml牛奶(作為摻假牛乳的標(biāo)準(zhǔn)樣品)，樣品25分別為0.9 ml、0.8 ml、0.7 ml、0.5 ml的牛奶，然后向25號(hào)樣品中添加不同體積的尿素溶液，使得總體積都為1 ml，配制的樣品編號(hào)及含量如表2-1所示。表2-1 雙縮脲法測(cè)定方法中牛奶中添加尿素溶液的配制樣品編號(hào)牛奶所占比例牛奶/ ml尿素溶液/ ml1100%10290%0.90.1380%0.80.2470%0.70.3550%0.50.52）牛奶中摻入三聚氰胺溶液的摻假樣品處理根據(jù)凱氏定氮法測(cè)得的牛奶中的氮含量配置三聚氰胺溶液，使每毫升三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測(cè)得的牛奶的氮含量。取不同體積的牛奶4份，以樣品1作為對(duì)照樣，樣品69分別為0.9 ml、0.8 ml、0.7 ml、0.5 ml的牛奶，然后向69號(hào)樣品中添加不同體積的三聚氰胺溶液，使得總體積都為1 ml，配制的樣品編號(hào)及含量如表2-2所示。表2-2 雙縮脲法測(cè)定方法中牛奶中添加三聚氰胺溶液的配制樣品編號(hào)牛奶所占比例牛奶/ ml三聚氰胺溶液/ ml690%0.90.1780%0.80.2870%0.70.3950%0.50.53、樣品前處理向19號(hào)樣品中分別加入13 ml乙腈33和5 ml水，劇烈振蕩6 min，充分混勻后靜置10 min，在10000 r/min轉(zhuǎn)速下，離心20 min，去上清，沉淀待用。將上述各沉淀樣品中加入少量的水和l ml的0.1 mol/l氫氧化鈉溶液溶解，加水定溶至50 ml待用。4、實(shí)驗(yàn)操作步驟1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)的繪制(1)取6支試管，編號(hào)，取出一支試管作為空白對(duì)照，然后分別向其余的5支試管中準(zhǔn)確的加入0ml，0.2 ml，0.4 ml，0.6 ml，0.8 ml，1.0 ml濃度為lmg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，然后用蒸餾水分別將各試管補(bǔ)齊到1.5 ml（如表2-3所示）。再向分別各試管中加入1.5 ml6%的氫氧化鈉溶液，最后分別向各試管中加入0.15 ml的雙縮脲試劑，每加完一管，立刻混合搖勻。(2)經(jīng)充分混合后在室溫下放置30 min。就可以開(kāi)始用石英比色皿在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在550 mn處的光吸收值a550nm，空白對(duì)照樣品為1號(hào)試管，即1.5 ml水，1.5 ml6的氫氧化鈉溶液和0.15 ml的雙縮脲試劑。(3)以用吸光度值a550nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2）樣品中的蛋白含量測(cè)定取9只試管并編號(hào)，19號(hào)試管中各按2.2.2中2中的順序?qū)?yīng)的取一定量的摻雜不同濃度并處理過(guò)的未知樣品，按照1）中的測(cè)定方法，使未知樣品測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的a550nm值，在(3)中制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，再乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算出原樣品中的蛋白濃度(mg/m1)。表2-3 雙縮脲法實(shí)驗(yàn)表試管號(hào)試劑123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液/ml00.20.40.60.81.0蒸餾水/ml1.51.31.10.90.70.52.3 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定牛奶中的蛋白質(zhì)含量 2.3.1實(shí)驗(yàn)儀器及藥品考馬斯亮藍(lán)法中用到的實(shí)驗(yàn)儀器及藥品與雙縮脲法中所用的儀器及藥品基本相同，需要特別用到藥品的如下所示：實(shí)驗(yàn)藥品：考馬斯亮藍(lán)-g-250染料、85%的磷酸。2.3.2實(shí)驗(yàn)操作及步驟1、試劑的準(zhǔn)備考馬斯亮藍(lán)g-250溶液：稱(chēng)取 100mg 考馬斯亮藍(lán) g-250，溶于 50 ml乙醇中，加入 100 ml 85%的磷酸，再用蒸餾水定容到1 l，濾紙過(guò)濾。2、摻雜樣品處理1）牛奶中摻入尿素溶液的摻假樣品處理根據(jù)凱氏定氮法測(cè)得的牛奶中的氮含量配置尿素溶液，使每毫升尿素溶液的氮含量等于凱氏定氮法測(cè)得的牛奶的氮含量。 取不同體積的牛奶5份，樣品1為l ml牛奶(作為摻假牛乳的標(biāo)準(zhǔn)樣品)，樣品25分別為0.9 ml、0.8 ml、0.7 ml、0.5 ml的牛奶，然后向25號(hào)樣品中添加不同體積的尿素溶液，使得總體積都為1 ml，配制的樣品編號(hào)及含量如表2-4所示。表2-4 考馬斯亮藍(lán)測(cè)定方法中牛奶中添加尿素溶液的配制樣品編號(hào)牛奶所占比例牛奶/ ml尿素溶液/ ml1100%10290%0.90.1380%0.80.2470%0.70.3550%0.50.52）牛奶中摻入三聚氰胺溶液的摻假樣品處理根據(jù)凱氏定氮法測(cè)得的牛奶中的氮含量配置三聚氰胺溶液，使每毫升三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測(cè)得的牛奶的氮含量。取不同體積的牛奶4份，以樣品1作為對(duì)照樣，樣品69分別為0.9 ml、0.8 ml、0.7 ml、0.5 ml的牛奶，然后向25號(hào)樣品中添加不同體積的三聚氰胺溶液，使得總體積都為1 ml，配制的樣品編號(hào)及含量如表2-5所示。表2-5 考馬斯亮藍(lán)測(cè)定方法中牛奶中添加三聚氰胺溶液的配制樣品編號(hào)牛奶所占比例牛奶/ ml三聚氰胺溶液/ ml690%0.90.1780%0.80.2870%0.70.3950%0.50.53、樣品前處理向16號(hào)樣品中分別加入13 ml乙腈和5 ml水，劇烈振蕩6 min，充分混勻后靜置10 min，在10000 r/min轉(zhuǎn)速下，離心20 min，去上清液，沉淀待用。將上述各沉淀樣品中加入少量的水和l ml的0.1 mol/l氫氧化鈉溶液溶解，加水定溶至50 ml。從各定溶好的各樣品中分別取l ml，然后再用9 ml的蒸餾水稀釋至考馬斯亮藍(lán)法的檢測(cè)范圍內(nèi)。4、實(shí)驗(yàn)操作步驟1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)的繪制(1)取6支試管，編號(hào)，取出一支試管作為空白對(duì)照，然后分別向其余的5支試管中準(zhǔn)確的加入0 ml，0.2 ml，0.4 ml，0.6 ml，0.8 ml，1.0 ml濃度為l mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，然后用蒸餾水分別將各試管補(bǔ)齊到1.5 ml，其添加方法及順序如表2-6所示。最后再分別向各試管中加入5 ml的考馬斯亮藍(lán)g-250溶液，每加完一管，立刻混合搖勻。(2)經(jīng)充分混合后在室溫下放置25 min后就可以開(kāi)始用石英比色皿在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595 mn處的光吸收值a595nm，空白對(duì)照樣品為1號(hào)試管，即1.5 ml水，5 ml考馬斯亮藍(lán)g-250溶液。(3)以用吸光度值a595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。表2-6 考馬斯亮藍(lán)法實(shí)驗(yàn)表試管號(hào)試劑123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液/ml00.20.40.60.81.0蒸餾水/ml1.51.31.10.90.70.52）樣品中的蛋白含量測(cè)定取9只試管并編號(hào)，19號(hào)試管中各按2.3.2中2中的順序?qū)?yīng)的取一定量的摻雜不同濃度并處理過(guò)的未知樣品，按照1）中的測(cè)定方法，使未知樣品測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的a595nm值，在(3)中制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，再乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算出原樣品中的蛋白濃度(mg/ml)。2.4反相高效液相色譜法測(cè)定牛奶中的三聚氰胺及尿素的含量 2.4.1實(shí)驗(yàn)儀器及藥品儀器：高效液相色譜儀（如圖2-1所示）、一次性注射器、針式濾膜、精密ph試紙。藥品：乙腈（色譜純）、磷酸二氫鉀、超純水（或用娃哈哈純凈水代替）。注：在本方法中所用的水均為超純水。2.4.2實(shí)驗(yàn)操作及步驟1、試劑的準(zhǔn)備1）尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g尿素標(biāo)準(zhǔn)品于100 ml容量瓶中配制成濃度為20.00 mg/ml的尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再分別稀釋為濃度為1 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用 0.45 m的針式濾膜過(guò)濾，濾液待用。2）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 ml棕色容量瓶中，配制成濃度為1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到的濃度為5 g/ml、25 g/ml、50 g/ml、75 g/ml、100 g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。用0.45 m的針式濾膜過(guò)濾，濾液待用。3）磷酸鹽緩沖液：濃度為0.05 mol/l。稱(chēng)取6.8 g磷酸二氫鉀（準(zhǔn)確至0.01 g），加800 ml水使其完全溶解后，再用磷酸調(diào)節(jié)為ph=3.0，用水稀釋至1l，用0.45 m的針式濾膜過(guò)濾后備用。2、樣品前處理稱(chēng)取5 ml牛奶樣品，置于50 ml具塞刻度試管中，加入30 ml乙腈，劇烈振蕩6 min后加水定容至滿(mǎn)刻度，充分混勻，靜置3 min，用一次性注射器吸取上清液用針式過(guò)濾器(0.45 m)過(guò)濾后，作為高效液相色譜分析用試樣。圖2-2 高效液相色譜儀3、尿素及三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制1）尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：按以下色譜條件對(duì)尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。色譜條件： 色譜柱：zorbax300sb-c18色譜柱（250 mm 4.6 mm，5 m） 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器 流動(dòng)相：乙腈：水=5：95 (體積比) 檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm 流速：1 ml/min 柱溫：室溫 進(jìn)樣體積：10 l在上面的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后注入尿素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，記錄色譜峰面積，以尿素溶液的質(zhì)量濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：按以下色譜條件對(duì)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。色譜條件：色譜柱：zorbax300sb-c18色譜柱（250 mm 4.6 mm，5 m）檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器 流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液：乙腈=70：30 (體積比) 檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm 流速：1 ml/min 柱溫：40 進(jìn)樣體積：10 l在上面的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后注入三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，記錄色譜峰面積，以三聚氰胺溶液的質(zhì)量濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。4、樣品的測(cè)定將2中制備好的樣品作為空白樣