免疫共沉淀原理及注意事項.ppt

免疫共沉淀,（Co-Immunoprecipitation， Co-IP）,單系金,一 實驗原理,以（抗體和抗原）之間的專一性作用為基礎的用于研究（蛋白質相互作用）的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整（細胞內生理性）相互作用的有效方法。 如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。,問題：細胞怎樣保持生理狀態(tài)-不變性？,Y-X-抗X,CO-IP應用與IP區(qū)別,測定兩種目標蛋白質是否在體內結合 確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔 CO-IP與IP只取決于檢測焦點是初級靶分子（抗原）還是次級靶分子（相互作用蛋白）,實驗基本原理,1.提取蛋白 2.在細胞裂解液中加入抗X的抗體 3.孵育后再加入Protein A或G(于Agarose bead上) 若細胞中有與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成復合物：“YX抗X抗體Protein A或G“ 3.經變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，復合物又被分開。（xy抗原、x抗體）,proteinA/G有一個很重要的特性就是能與抗體的Fc段結合,agarose bead 瓊脂糖珠,CO-IP原理圖解,proteinA/G-瓊脂糖珠復合物,Protein A是一種金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質，能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是IgG）的Fc區(qū)結合。 目前多用protein A/G預先結合在argarose beads上。,ProteinA/G的作用及具體原理,“捕獲”抗體，形成復合物， 抗體-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共價健結合 ProteinA/G-garose beads 共價結合 加樣緩沖液-煮沸變性-離心 Protein A/G beads EP管（抗體-目的蛋白-少量非特異性吸附蛋白）。,二 CO-IP特征,優(yōu)點 （1 相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài) （2 蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響 （3 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物,二 CO-IP特征,局限性 （1 可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質蛋白質相互作用 （2 兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，有第三者在中間起橋梁作用； （3 必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預測不正確，實驗就得不到結果。,三 實驗流程,提取細胞總蛋白 離心，上清電泳(抗原抗體) 準備PA珠子，PBS洗3遍 PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特異性蛋白背景) 離心去PA珠子，取上清 測蛋白濃度 (BCA法) 加一抗反應(4過夜) 加PA珠子捕捉復合物 (室溫1h或4過夜) 離心，收集沉淀，預冷RIPA Buffer洗3遍 上樣緩沖液懸浮沉淀，加熱游離抗原、抗體、珠子 ,四 實驗結果分析,SDS-PAGE Western blotting分析 質譜分析檢測目的蛋白,SDS-PAGE結果分析,標難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。,以每個蛋白標準的分子量對數對它的相對遷移率作圖得標準曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量。,一抗,一抗,一抗(兔抗Actin),曝光后的蛋白條帶,二抗 (辣根酶標記的羊抗兔IgG),ECL,X光片曝光顯影,ECL 試劑,含有轉印蛋白的PVDF膜,+,+,轉印膜上蛋白檢測示意圖,WB結果分析,CO-IP與質譜分析流程,三 實驗的關鍵,1. 實驗最需要注意點就是抗體的性質。特別是多抗的特異性是問題。 2. 為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進行實驗。 3. 考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。 4. 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的，這需要進行蛋白質的定位來確定。？,注意的問題：1.裂解液,細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質蛋白質相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經驗確定。 不能用高濃度的變性劑（0.2SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。,RIPA裂解液-普利萊基因技術有限公司,100ml RIPA Buffer： 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS.（100元） 說明： 1. 裂解液臨用前可新鮮加入最終濃度為1mM的PMSF或其它蛋白酶抑制劑。 2. RIPA裂解液中蛋白樣品含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法測定蛋白濃度,裂解液成分,國內博士： 細胞裂解液： 50mM Tris-HC（lpH7.5）， 150 mM NaCl, 0.5%NP-40, 1mM EDTA 使用前加入PMSF至終濃度1mM、 proteinase inhibitor cocktail（混合物）。 劉巖 BC300 buffer 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 300mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 10% glycerol（甘油）, 0.2 mM PMSF, 0.2%Tween 20,2.1免疫沉淀中抗體的選擇,注意的問題：2.2抗體,使用對照抗體：（陰性和陽性） 陰性：單克隆抗體：同一種屬的IgG 兔多克隆抗體：正常兔IgG 陽性：細胞內某種蛋白的抗體（做膜蛋白A，用膜蛋白B）,未檢測到目得蛋白或蛋白很少,可能原因 處理方法 1.樣品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制劑；所有操作保持4以下冰上操作并防止凍融 2.抗體濃度太低：調整抗體濃度，必要時設立濃度梯度，摸索最佳濃度 3.抗抗體親合力太低： 選用適合于IP和/或IB的相應抗體 4.IP抗體未與agarose珠子結合： 選用適合于IP的相應珠子，正確保存防止變質或干燥 5.Tag未暴露在融合蛋白構象的表面：改變tag融合表達部位 6.裂解液嚴謹度太高： 改用低嚴謹度裂解液,目得蛋白高背景：,可能原因 處理方法 非特異蛋白結合 在無血清培養(yǎng)液中裂解細胞； 在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子預洗， 免疫沉淀后增加漂洗次數和嚴謹度（高鹽或去垢劑） 裂解液嚴謹度太低 改用高嚴謹度裂解液 實驗儀器或液體被污染 使用潔凈的儀器或液體 轉移膜上的非特異吸附 戴手套， 用鑷子夾取， 不要接觸膜轉移面,試劑,RIPA