實(shí)驗(yàn)七人體性染色質(zhì)體的觀察.ppt

實(shí)驗(yàn)七 人體性染色質(zhì)小體的觀察 2009年11月,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握人體性染色質(zhì)的檢測方法； 觀察人體性染色質(zhì)的形態(tài)特征及存在部位；為進(jìn)一步研究人體染色體的畸變與疾病提供參考條件； 了解雌性哺乳動物X染色體失活假說和劑量補(bǔ)償效應(yīng)的機(jī)制。,1949年M.L.Barr等研究發(fā)現(xiàn)雌貓神經(jīng)細(xì)胞核膜內(nèi)凝縮的深染小體性染色質(zhì)體(sex-chromatin body)或巴氏小體(Barr body)，而雄性個體細(xì)胞中則沒有。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：所有哺乳類雌體細(xì)胞中都可以見到這一結(jié)構(gòu)。,二、實(shí)驗(yàn)原理,巴氏小體是由雌性哺乳動物體細(xì)胞中失活的X染色體在間期細(xì)胞核中呈異固縮狀態(tài)（染色質(zhì)高度螺旋化），形成直徑約1m，貼近于核膜邊緣的染色小體。 細(xì)胞分裂間期 細(xì)胞核中出現(xiàn)異固縮現(xiàn)象：濃縮、染色深、無活性； 細(xì)胞分裂期 可形成正常的染色體形態(tài)；復(fù)制時間比有活性的X染色體稍遲一些。,Barr小體的數(shù)目=n-1（n為X染色體數(shù)目） 正常女人的體細(xì)胞間期核中Barr小體為1； 正常男人的體細(xì)胞間期核中Barr小體為0； XXX女人的體細(xì)胞間期核中Barr小體為2； XXXX女人的體細(xì)胞間期核中Barr小體為3。,為什么正常男女之間的X染色質(zhì)存在差異？ 為什么女性兩個X染色體上的每個基因座的兩個等位基因所形成的產(chǎn)物，不比只有一個X染色體半合子男性的相應(yīng)基因產(chǎn)物多？ 為什么某一X連鎖的突變基因在純合子女性的病情并不比半合子的男性嚴(yán)重？,定義：具有兩份或兩份以上的基因量的個體與只有一份基因量的個體的基因表達(dá)趨于一致的遺傳效應(yīng)。 舉例：雌性哺乳動物一條X染色體異染色質(zhì)化（失活），只有一條X染色體具有活性，使雌雄動物雖然X染色體數(shù)目不同但基因產(chǎn)物的劑量是平衡的。 補(bǔ)償方式,劑量補(bǔ)償效應(yīng) （dosage compensation effect）,萊昂假說(Lyon hypothesis),1961年，Mary Lyon 提出了X染色體失活的假說。其實(shí)驗(yàn)依據(jù)是對小鼠X連鎖的毛色基因的遺傳學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)雌性小鼠毛色雜合體不表現(xiàn)顯性性狀，也不是中間類型，而是顯性隱性兩種顏色嵌合組成斑點(diǎn)狀（不是共顯性）。而雄性小鼠卻從不表現(xiàn)斑點(diǎn)狀毛色，而是顯性或隱性單一顏色的毛色。,內(nèi)容： 巴氏小體是一條失活的X染色體；哺乳動物雌性個體兩條X染色體的其中一條在受精后失活； 兩條X染色體中哪一條失活是隨機(jī)的；在同一哺乳動物的體細(xì)胞中，有些父源X染色體失活，有些為母源失活。 失活在胚胎早期發(fā)生(人類在胚胎發(fā)育16天時)，失活的X染色體在以后分裂中不會復(fù)活；當(dāng)生殖細(xì)胞形成時，失活的染色體可恢復(fù)。 雜合體雌性在伴性基因的作用上是嵌合體。,證據(jù)：1）玳瑁貓毛皮上的黑色和黃色班塊XOXo 2）人類葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性測定GdA/GdB,X染色體失活的機(jī)制,X染色體上都存在與失活有關(guān)的Xic（X染色體失活中心）位點(diǎn)，Xic位點(diǎn)的丟失會影響萊昂化，胚胎不能存活。X染色體失活分起始、維持、擴(kuò)散3個階段。X染色體失活只是部分失活，在失活染色體的Xic位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)有活性的基因（XIST）。,Xic的失活作用,XIST基因的表達(dá),X-染色質(zhì)的形態(tài)特征及所在部位： X-染色質(zhì)的形態(tài)表現(xiàn)為一結(jié)構(gòu)致密的濃染小體；輪廓清楚；大小11.5m；常附著于核膜邊緣或靠近內(nèi)側(cè)；形狀為凸形、三角形、卵形、短棒及雙球形等。 正常女性口腔黏膜細(xì)胞中出現(xiàn)率：30 50%。,巴氏小體,1、器材： 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、牙簽、解剖針等。 2、試劑： 改良苯酚品紅、60%醋酸、45%冰醋酸、95%乙醇 3、實(shí)驗(yàn)材料： 女生口腔黏膜細(xì)胞（男生為對照）；女生毛囊細(xì)胞（男生為對照）,三、實(shí)驗(yàn)用品,1、口腔頰部粘膜細(xì)胞巴氏小體觀察 （1）取干凈載玻片，用記號筆在將涂細(xì)胞的一面右上角做好標(biāo)記； （2）嗽口（三次），盡可能除去口中雜物； （3）用牙簽刮取頰部粘膜上皮細(xì)胞，棄第一次刮取物，在同一部位繼續(xù)刮??； （4）將刮得的細(xì)胞涂在干凈載玻片上，反復(fù)幾次，使玻片上的材料盡可能多些（每人做2張，1張女生的，1張男生的）； （5）空氣中干燥； （6）涂片區(qū)滴上100l的60%冰醋酸固定5分鐘； （7）吸去冰醋酸，滴20l改良苯酚品紅染色2分鐘； （8）壓片； （9）鏡檢。,四、實(shí)驗(yàn)操作,拔取帶毛囊頭發(fā)一段,置于載玻片上滴100l 45%乙酸解離5分鐘后，吸掉乙酸解剖針剝?nèi)⊥鈱用壹?xì)胞，在載玻片上將組織細(xì)胞均勻攤平晾干滴上100l 改良苯酚品紅染色10分鐘吸去染液，滴100l 95% 乙醇分色，1分鐘后吸掉壓片鏡檢,2、發(fā)根細(xì)胞巴氏小體觀察,X-染色質(zhì)的辨認(rèn)： 低倍鏡下檢出典型的可數(shù)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)： 核質(zhì)是網(wǎng)狀或細(xì)顆粒狀分布； 核膜清晰、核無缺損； 染色適度； 周圍無雜菌。 在高倍鏡或油鏡下進(jìn)一步觀察。 注意：在女性間期細(xì)胞核內(nèi)側(cè)靠近核膜處有約1微米大小的反光極強(qiáng)的顆粒狀亮點(diǎn)，即為巴氏小體。材料不同，觀察結(jié)果可能有不同，且必須和核仁區(qū)別開來（核仁往往離核膜較遠(yuǎn)或接近核中央部位）。,刮口腔上皮細(xì)胞前要漱口； 涂片略干再加改良苯酚口紅； 染色時間不要太長，否則核質(zhì)著色深，X染色質(zhì)體不易區(qū)分； 毛囊細(xì)胞要充分解離，壓片前可先用解剖針敲片，使細(xì)胞解離。,五、注意事項(xiàng),分別觀察男女各50個可數(shù)細(xì)胞，計算顯示X染色質(zhì)所占百分比。（正常女性口腔粘膜細(xì)胞中約3050%有一個巴氏小體，男性則低于12%。） 觀察中選繪45個典型細(xì)胞，示明X染色質(zhì)體的形成和部位。 正常男人的染色體組成是44+XY，而正 常女人的染色體組成是44+XX，請按要求填寫下列表格：,六、作業(yè) （實(shí)驗(yàn)結(jié)果）,Barr小體 性別表現(xiàn) 性染色體的 體細(xì)胞中 數(shù)目 組成情況 染色體總數(shù) 0 正常男人 0 有缺陷的女人 1 有缺陷的男人 1 正常女人 2 有缺陷的男人 2 有缺陷的女人 3 有缺陷的男人 3 有缺陷的女人,1、什么是劑量補(bǔ)償效應(yīng)？ 2、為什么巴氏小體一般出現(xiàn)在核膜邊緣？ 3、巴氏小體在人類遺傳學(xué)工作中有什么用途？,七、思考題,固體廢棄物丟到水槽旁的廢物桶中！ 每組同學(xué)：請在實(shí)驗(yàn)后用擦鏡紙把鏡頭擦凈；如使用高倍鏡，則立即用擦鏡紙蘸二甲苯將鏡頭和載玻片擦凈，以免污染鏡頭。登記顯微鏡使用記錄本，到助教處登記實(shí)驗(yàn)記錄。把桌面整理好，最后經(jīng)助教檢