生化工程第五章微生物培養(yǎng)及發(fā)酵動(dòng)力學(xué).ppt

第五章 微生物培養(yǎng)及發(fā)酵動(dòng)力學(xué),內(nèi)容,1 基本概念 2 微生物反應(yīng)的物料衡算 3 微生物反應(yīng)的能量衡算 4 微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué),微生物生長的基質(zhì),微生物反應(yīng)的特點(diǎn),二 微生物反應(yīng)過程的質(zhì)量衡算,例題：(選自賈士儒4869頁) 1.葡萄糖為基質(zhì)進(jìn)行面包酵母（S.cereviseae）培養(yǎng)，培養(yǎng)的反應(yīng)式可用下式表達(dá)，求計(jì)量關(guān)系中的系數(shù)a、b、c、d。 反應(yīng)式為： C6H12O63O2aNH3 bC6H10 NO3(面包酵母)cH2OdCO2,解：據(jù)平衡方程式,可得： C: 6=6b+d H: 12+3a=10b+2c O: 6+6=3b+c+2d N: a=b 方程聯(lián)立求解為：a=b0.48 c=4.32 d=3.12 上述反應(yīng)計(jì)量關(guān)系式為: C6H12O63O20.48NH3 0.48C6H10NO34.32H2O 3.12CO2,練習(xí) 1葡萄糖為碳源，NH3為氮源進(jìn)行釀酒酵母發(fā)酵。呼吸商1.04。消耗100mol葡萄糖和48mol NH3生產(chǎn)了48 mol菌體、312 mol CO2和432molH2O。求氧的消耗量和酵母菌體的化學(xué)組成。（呼吸商RQCO2 生成速率/O2消耗速率）,第二節(jié) 微生物反應(yīng)過程的得率系數(shù) 研究得率系數(shù)的意義： 對(duì)碳源等物質(zhì)生成細(xì)胞或其他產(chǎn)物的潛力進(jìn)行定量評(píng)價(jià)的重要參數(shù)。 分為以下幾類：,部分菌體得率與產(chǎn)物得率 得率 定義單位 YX/S消耗1g或1mol基質(zhì)獲得的干菌體克數(shù)，g/g, g/mol YATP消耗1molATP獲得的干菌體克數(shù)，g/mol YKJ消耗1KJ熱量獲得的干菌體克數(shù)， g/KJ YX/O消耗1gO2獲得的干菌體克數(shù)，g/g YX/H 1mol氫受體產(chǎn)生的干菌體克數(shù)，g/mol YX/N 消耗1g氮產(chǎn)生的干菌體克數(shù)，g/mol YX/NO3-消耗1mol NO3獲得的干菌體克數(shù)，g/mol YCO2/S消耗1mol基質(zhì)產(chǎn)生的CO2的摩爾數(shù)，mol /mol YCO2/O消耗1mol O2產(chǎn)生的CO2的摩爾數(shù)，mol /mol YATP/S消耗1mol基質(zhì)獲得的ATP的摩爾數(shù)，mol /mol Yave-消耗1個(gè)有效電子獲得的干菌體克數(shù)，g/ave,細(xì)胞得率（生長得率）: YX/S生產(chǎn)細(xì)胞的質(zhì)量g / 消耗基質(zhì)的質(zhì)量g X/（-S） 碳元素的細(xì)胞得率: YC 細(xì)胞生產(chǎn)量細(xì)胞含碳量/基質(zhì)消耗量 基質(zhì)含碳量 YX/S(Xc/Sc),1葡萄糖為碳源，NH3為氮源進(jìn)行某細(xì)菌的好氧培養(yǎng)。消耗的葡萄糖有2/3的碳源轉(zhuǎn)化為細(xì)胞中的碳。反應(yīng)式為： C6H12O6aO2bNH3 c(C4.4OH7.3N0.86O1. 2)dH2O eCO2 計(jì)算上述反應(yīng)中的得率系數(shù)YX/S 和YX/O 解：據(jù)平衡方程式,可得： C: 6=4.4ce H: 12+3b=7.3c+2d O: 6+2a=2.2c+d +2e N: b=0.86c 由于1mol葡萄糖中含碳72g, 轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的碳為722/3=48(g) 故：（4.412）c=48 得： c= 0.91,轉(zhuǎn)化為CO2的碳為724824（g） 故： 12e=24 e=2 解平衡方程中其他未知數(shù)，得： b=0.78; d=3.85; a=1.47 故平衡方程為： C6H12O61.47O20.78NH3 0.91(C4.4OH7.3N0.86O1.2)3.85H2O2CO2 YX/S0.91（124.4167.3140.86161.2）/ 1800.46(g/g)(以細(xì)胞/葡萄糖計(jì)) YX/O83.1/（1.4732）1.77(g/g)(以細(xì)胞/氧計(jì)),第三節(jié) 微生物反應(yīng)過程的能量衡算 微生物反應(yīng)是放熱過程。 微生物利用碳源，通過呼吸（有氧）或發(fā)酵（無氧）將能量轉(zhuǎn)化為ATP，供微生物生長、代謝，其余能量作為熱量排出，進(jìn)行微生物優(yōu)化培養(yǎng)時(shí)，必須進(jìn)行適宜的溫度控制。 從反應(yīng)熱的角度考慮反應(yīng)過程中的能量代謝，進(jìn)行能量衡算。,一 菌體得率 1YKJ ：微生物對(duì)能量的利用(消耗1KJ熱量獲得的干菌體克數(shù)， g/KJ) YKJ X (細(xì)胞生產(chǎn)量) Ea(細(xì)胞貯存自由能)+Eb(分解代謝釋放自由能) (-Ha)(X)+(-Hc) Ha :菌體X的燃燒熱為基準(zhǔn)的焓變，因菌體不同，一般 取值Ha22.15kJ/g Hc :所消耗基質(zhì)的焓變與代謝產(chǎn)物焓變之差， Hc (-Hs)(-S)- (-Hp)( P) (-H0*)(-O2) Hs :碳源氧化的焓變，kJ/mol； Hp :產(chǎn)物氧化的焓變，kJ/mol； H0*:為呼吸反應(yīng)焓變444 kJ/mol-O2,故總表達(dá)式可寫為： YKJ X (-Ha)(X)+ (-Hs)(-S)- (-Hp)( P) Yx/s (-Ha) Yx/s + (-Hs) - (-Hp) Yp/s,干酪乳桿菌在蛋白胨、牛肉膏為主要成分的復(fù)合培養(yǎng)基 中，分別以葡萄糖、甘露醇為能源進(jìn)行培養(yǎng)，計(jì)算YKJ 由化工手冊(cè)查知： H葡萄糖2816 kJ/mol，H乙酸870 kJ/mol， H乙醇1368 kJ/mol， H甲醇264 kJ/mol，H乳酸1363 kJ/mol， H甘露醇3038 kJ/mol， Ha22.15 kJ/mol,解：以葡萄糖為能源時(shí)， YKJ Yx/s (-Ha) Yx/s + (-Hs) - (-Hp) Yp/s 其中: (-Hp) Yp/s13630.05 8701.05 13680.94 2641.76 2732（kJ/mol） YKJ 62.0 22.1562.0 + 2816 - 2732 0.043 （g/kJ） 以甘露醇為能源時(shí), (-Hp) Yp/s13630.4 8700.22 13681.29 2641.6 2925（kJ/mol） YKJ 40.5 22.1540.5 + 3038 - 2925 0.041 （g/kJ）,2 反應(yīng)熱（代謝熱或發(fā)酵熱） Hh 基質(zhì)燃燒熱菌體燃燒熱產(chǎn)物燃燒熱 = HsS- HxX -HpP 例題： 葡萄糖為惟一碳源進(jìn)行酵母培養(yǎng)。反應(yīng)式為： 1.11C6H12O62.10O2 C.3. 92 H6. 5O 1. 943.42H2O 2.75CO2 求（1）Yx/s; (2) 生成1kg細(xì)胞量時(shí)的Hh。已知酵母細(xì)胞和葡萄糖的燃燒熱分別為1.50104kJ/kg和1.59104kJ/kg。,解： Yx/s酵母細(xì)胞分子質(zhì)量/1.11葡萄糖分子質(zhì)量 3.92126.51.9416 / 1.11180 84.58/199.8 0.42（kg/kg） 生成1kg酵母細(xì)胞需要葡萄糖1/0.42=2.38(kg) Hh HsS- HxX 1.591042.381.501041 2.25104（kJ）,2.分別采用含有蛋白胨和牛肉膏的復(fù)合培養(yǎng)基、含有多種氨基酸合成培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基進(jìn)行單胞菌的厭氧培養(yǎng)。碳源為葡萄糖，獲得如下結(jié)果(下表)。已知菌體的含碳量（以碳源/細(xì)胞計(jì)）為0.45g/g ,求采用不同培養(yǎng)基時(shí)的YkJ. 化工手冊(cè)可知H葡萄糖2816kJ/mol, H乙醇1368kJ/mol, H乳酸1363kJ/mol, Ha22.15kJ/mol.,一 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究內(nèi)容： 研究細(xì)胞生長速度與產(chǎn)物生成速 度的關(guān)系及環(huán)境條件對(duì)速度的影響。 二 發(fā)酵過程的反應(yīng)描述：,X S（底物） X（菌體） P（產(chǎn)物）,發(fā)酵反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究內(nèi)容,研究反應(yīng)速度及其影響因素并建立反應(yīng)速度與影響因素的關(guān)聯(lián),反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型,反應(yīng)器特性,+,反應(yīng)器的操作模型,操作條件與反應(yīng)結(jié)果的關(guān)系，定量地在線控制反應(yīng)過程,調(diào)整期,對(duì)數(shù)期,穩(wěn)定期,衰亡期,二 微生物生長曲線,第一節(jié) 微生物生長動(dòng)力學(xué)的基本概念,一、微生物在一個(gè)密閉系統(tǒng)中的生長情況：,時(shí)間,菌體濃度,延遲期,指數(shù)生長期,減速期,靜止期,衰亡期,延遲期：,指數(shù)生長期:,倍增時(shí)間：td,靜止期： ;,衰亡期:,一 指數(shù)生長方程 dX/dt = （ ）X X為微生物的菌體濃度，單位體積內(nèi)干細(xì)胞質(zhì)量（g/L）； 比生長速率，每單位細(xì)胞濃度的生長速率(1/min;1/h)； 為細(xì)胞自溶或內(nèi)源代謝速率，其導(dǎo)致細(xì)胞量的損失. 在 指數(shù)生長期，,故上式可改寫為： dX/dt = X， 積分變形為： ln (X/X0) =t 或 t = ln (X/X0) / 或 X=X0 et,第二節(jié) 微生物生長動(dòng)力學(xué),注： 1）一般情況下，在微生物生長的各階段，細(xì)胞增值規(guī)律均符合指數(shù)生長定律，但值隨時(shí)間變化； 2）在指數(shù)生長期，值達(dá)最大m ，且保持穩(wěn)定；其他生長期， 值隨時(shí)間變化。 3）表示微生物生長快慢的另一方法： 倍增時(shí)間td：菌體細(xì)胞質(zhì)量增加一倍所需的時(shí)間 td =0.693/,例： 以乙醇為碳源進(jìn)行產(chǎn)氣桿菌培養(yǎng)，菌體初始濃度X0=0.1kg/m3,培養(yǎng)至3.2h,菌體濃度為8.44kg/m3 ，若不考慮延遲期，而且一定，求td,二 Monod方程 隨溫度、pH、基質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、溶氧等條件而變化. f(s,p,T,pH,) Monod發(fā)現(xiàn)：在一定條件下(基質(zhì)限制) f(S) 經(jīng)驗(yàn)公式：m S/ (Ks + S),：菌體的生長比速（1/h） S：限制性基質(zhì)濃度（g/L） Ks：飽和常數(shù)(相當(dāng)于1/2m時(shí)的限制性基質(zhì)濃度, g/L ) max: 最大生長比速（1/h）,：菌體的生長比速 S：限制性基質(zhì)濃度 Ks：飽和常數(shù)(相當(dāng)于1/2m時(shí) 的限制性基質(zhì)濃度, g/L ) max: 最大生長比速（1/h）,S Ks時(shí)，S直線關(guān)系 S Ks 時(shí)，m， Ks與m反映了微生物的特征：基質(zhì) Ks反映微生物對(duì)基質(zhì)的親和力：Ks小，親和力大,Monod方程的參數(shù)求解(雙倒數(shù)法)： Ks與m,將Monod方程取倒數(shù)可得：,或：,這樣通過測定不同限制性基質(zhì)濃度下，微生物的比生長速度，就可以通過回歸分析計(jì)算出Monod方程的兩個(gè)參數(shù)。,例：在一定條件下培養(yǎng)大腸桿菌，得如下數(shù)據(jù)：,S(mg/l) 6 33 64 153 221 (h-1) 0.06 0.24 0.43 0.66 0.70,求在該培養(yǎng)條件下，求大腸桿菌的max，Ks和td?,解：將數(shù)據(jù)整理：,S/ 100 137.5 192.5 231.8 311.3 S 6 33 64 153 221,max，1.11 (h-1); Ks97.6 mg/L,tdln2/ max0.64 h,第三節(jié) 產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué),一、初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物,次級(jí)代謝產(chǎn)物：還有一類產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞的代謝功能沒有明顯 的影響，一般是在穩(wěn)定期形成，如抗生素等 這一類化合物稱為次級(jí)代謝產(chǎn)物。,初級(jí)代謝產(chǎn)物：微生物合成的主要供給細(xì)胞生長的一類物質(zhì)。 如氨基酸、核苷酸等等，這些物質(zhì)稱為初級(jí) 代謝產(chǎn)物。,二、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)類型（產(chǎn)物形成和菌體生長關(guān)系）：,一類發(fā)酵偶聯(lián)型 產(chǎn)物的形成和菌體的生長相偶聯(lián),x,p,t,二類發(fā)酵混合型 產(chǎn)物的形成和菌體的生長部分偶聯(lián),x,p,t,三類發(fā)酵非偶聯(lián)型 產(chǎn)物的形成和菌體的生長非偶聯(lián),x,p,t,濃 度,三 在分批發(fā)酵過程中，微生物生長、產(chǎn)物形成均與基質(zhì)利用 有關(guān)，因此可建立平衡方程： 微生物生長：細(xì)胞積累生長 dX/dt = X 產(chǎn)物形成：產(chǎn)物積累產(chǎn)物合成 dP/dt = X Yp/x = qpX 基質(zhì)利用：基質(zhì)積累生長消耗產(chǎn)物消耗維持 dS/dt =X/Yx/sqpX / Yp/s mX = qs X qpX / Yp/s mX 比速率（、qp、qs）：單位時(shí)間內(nèi)單位細(xì)胞濃度所引起的細(xì)胞生長或產(chǎn)物形成或底物消耗的量。（g /g細(xì)胞.h） 生長得率Yx/s ；產(chǎn)物得率 Yp/s,四. 生產(chǎn)得率系數(shù)和產(chǎn)物得率系數(shù) 1. 生產(chǎn)得率系數(shù)： Yx/s表示每消耗1mol的基質(zhì)所形成的菌體質(zhì)量（g） Yx/s X/SX-X0/S0-S Yx/o2 表示每消耗1mol的O2所形成的菌體質(zhì)量（g） Yx/s X/O2 Yx/ATP 表示每消耗1mol的ATP所形成的菌體質(zhì)量（g） Yx/s X/ATP 2. 產(chǎn)物得率系數(shù)： Yp/s表示每消耗1mol的基質(zhì)所生成的產(chǎn)物質(zhì)量（g） Yp/s P/SP-P0/S0-S,五. 分批培養(yǎng)的生產(chǎn)率 1.分批培養(yǎng)的生產(chǎn)率（Productivity）： 生產(chǎn)率P=細(xì)胞或產(chǎn)物濃度（g/ L）/發(fā)酵時(shí)間t(h） 其中：發(fā)酵時(shí)間t = 1/m ln Xf/X0 + tc + tf + tl tc 為放罐清洗時(shí)間； tf 為裝料消毒時(shí)間； tl為生長停滯時(shí)間。 X0 、Xf 分別為細(xì)胞最初與最終濃度。 若令: tc + tf + tltL 則： P （Xf X0 ） m /ln（Xf /X0）+m tL,1. 在5m3的培養(yǎng)液中按5%接種量接種，原接種液含菌5106（個(gè)/mL），求菌含量為4109（個(gè)/mL）的培養(yǎng)時(shí)間。（假定培養(yǎng)期間均SKs, m=0.8 h1） 2. 采用合成培養(yǎng)基，在1m3的反應(yīng)器中對(duì)大腸桿菌進(jìn)行分批培養(yǎng)，菌體生長可用Monod方程描述。已知m=0.935 h1，Ks=0.71 kg/m3,基質(zhì)初始濃度S=50 kg/m3，菌體初始濃度X0=0.1 kg/m3,菌體得率YX/S=0.6kg/kg(細(xì)胞/基質(zhì))。問:當(dāng)80基質(zhì)已消耗所需時(shí)間。 3.以甘油為基質(zhì)進(jìn)行陰溝氣桿菌分批培養(yǎng)。時(shí)間t=0，X0=0.1g/L, S0=50g/L.，菌體生長可用Monod方程描述，m=0.85 h1，Ks=1.23102g/L，YX/S=0.6kg/kg(細(xì)胞/葡萄糖)。 不考慮誘導(dǎo)期和死亡期，求培養(yǎng)6h后的菌體濃度及底物濃度。,第三節(jié) 連續(xù)培養(yǎng)及其動(dòng)力學(xué) 連續(xù)培養(yǎng)（cintinuous culture）有稱連續(xù)發(fā)酵，以一定速度向發(fā)酵罐注入新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以同速排出培養(yǎng)液。使罐內(nèi)液量維持恒定，使培養(yǎng)物在恒定狀態(tài)下生長的培養(yǎng)方法。 連續(xù)培養(yǎng)與分批培養(yǎng)的區(qū)別：維持恒定狀態(tài)環(huán)境條件如基質(zhì)濃度S、產(chǎn)物濃度P、細(xì)胞濃度X、比生長速率、pH等始終維持不變 維持恒定狀態(tài)目的：穩(wěn)定高效的培養(yǎng)微生物或產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物。,一 單罐連續(xù)發(fā)酵的前提和假設(shè)： 穩(wěn)定狀態(tài)下物料平衡，參數(shù)變化為零：dX/dt=0, dS/dt=0, dP/dt=0； 培養(yǎng)基混合均勻，菌體、基質(zhì)、含氧等均勻一； 微生物無死亡（比死亡速率0）,單罐連續(xù)培養(yǎng),流入速度=流出速度=F,反應(yīng)器內(nèi)(V)全混流溶質(zhì)濃度處處相等,連續(xù)反應(yīng)器：,二 單罐連續(xù)發(fā)酵的動(dòng)力學(xué) 通過連續(xù)培養(yǎng)的物料衡算來推導(dǎo)其動(dòng)力學(xué)方程： 微生物細(xì)胞的物料平衡： 積累細(xì)胞（進(jìn)入流出）細(xì)胞（生長死亡）細(xì)胞 dX/dt = F（X0X）/V()X 由于流入細(xì)胞濃度X00，0，故簡化為: dX/dt = FX / VX（F/ V）X 穩(wěn)定態(tài)下: dX/dt =0 則：F/ V,連續(xù)培養(yǎng)中，稀釋率（dilution rate）D = F/V, 故：D D (1/h)：單位時(shí)間內(nèi)新進(jìn)入的培養(yǎng)液體積（F）占罐內(nèi)培養(yǎng)液總體積(V)的分?jǐn)?shù)。 1/D (h)：培養(yǎng)液在罐內(nèi)的平均停留時(shí)間，可用t表示 注： D =F/V，可通過改變F（流加速率）調(diào)節(jié)值： D0, 微生物濃度將隨時(shí)間而增加； D, 則dX/dt 0, 微生物濃度將隨培養(yǎng)物被洗出（wash out）而減少； D, 則dX/dt 0，微生物濃度不隨時(shí)間而變化，處于恒態(tài) 連續(xù)培養(yǎng)穩(wěn)定狀態(tài),限制性底物的物料平衡： 底物積累（進(jìn)入流出）底物（生長形成 產(chǎn)物維持代謝）底物 dS/dt = F（S0S）/V（X/Yx/sqpX/Yp/smX） 由于mXX/Yx/s，產(chǎn)物形成的需求（qpX/YP/s）忽略時(shí)，該式簡化為： dS/dt = F（S0S）/VX/Yx/s 穩(wěn)定態(tài)下 dX/dt =0 則：D（S0S）=X/Yx/s 當(dāng)穩(wěn)定態(tài)D=時(shí)，XYx/s（S0S） （1）,其中： S0，S流入和流出的營養(yǎng)底物的濃度（g/L）； F培養(yǎng)液體積流量（L/h）； V反應(yīng)器容積(L)； m維持系數(shù)（g基質(zhì)/g細(xì)胞.h）； 比生長速率（h1）； Yx/s以消耗基質(zhì)為基準(zhǔn)的細(xì)胞得率 （g細(xì)胞/g基質(zhì)）； Yp/s以消耗基質(zhì)為基準(zhǔn)的產(chǎn)物生成率 （g產(chǎn)物/g基質(zhì)）,3）細(xì)胞濃度與稀釋率的關(guān)系 據(jù)Monod方程: m S/ (Ks + S) 當(dāng)穩(wěn)定態(tài)D=時(shí), D Dc S /(Ks + S) Dc:臨界稀釋速率（Dc=m）,代表能運(yùn)行的最大稀釋 速率。 一般情況下DDc；DDc, 則菌體將被洗出 上式變形為： SDKs / (m - D) (2) (1),(2)合并：XYx/sS0DKs / (m - D) （3）,注： 連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)下，Yx/s、S0、Ks及m均定值，故菌種濃度X、底物濃度取決于稀釋率D。 連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)下，X、S0、D為主要變量，其他屬于因變量。但當(dāng)D發(fā)生改變，均會(huì)造成X、S、的變化。 菌種濃度X、基質(zhì)濃度S、細(xì)胞產(chǎn)率P及稀釋率D 的變化關(guān)系如圖：,菌種濃度X與稀釋率D的關(guān)系： 隨D增加，X逐漸減少，起初 不明顯，當(dāng)D漸接近Dcm， X急跌至0，微生物全部洗出。 基質(zhì)濃度S與稀釋率D的關(guān)系： S變化與X相反：一般當(dāng)D0.8 時(shí),S很?。浑SD再增大，S急劇 上升，當(dāng)D漸接近Dcm時(shí)， SS0。 細(xì)胞產(chǎn)率P=DX與稀釋率D的關(guān) 系： 隨D的增加P逐步增大，可達(dá)最 大DX值（DmXm），Dm為理論上 的最適宜稀釋速率。,菌種濃度X、基質(zhì)濃度S、細(xì)胞產(chǎn)率P及稀釋率D的關(guān)系 Dc為臨界稀釋速率； Dm為理論上的最適宜稀釋速率。,三 連續(xù)發(fā)酵與分批發(fā)酵生產(chǎn)率的比較 1分批培養(yǎng)的生產(chǎn)率 P分=(Xf X0) / 1/m* ln(Xf / X0) + tL 2連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)強(qiáng)度P連為稀釋率D與菌體濃度X 之積 P連DXD Yx/sS0DKs / (m - D) 3連續(xù)培養(yǎng)與分批培養(yǎng)之比： P連/P分=