生化實(shí)驗(yàn)05凱氏定氮法.ppt

1,實(shí)驗(yàn)06 植物組織中總氮含量的測(cè)定 （微量凱氏定氮法）,2,氮素代謝在植物新陳代謝中占有主導(dǎo)地位。測(cè)定氮素含量對(duì)于研究植物的氮素吸收、運(yùn)輸和代謝規(guī)律，以及確定農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等均具有一定意義。 動(dòng)植物組織中的氮包括蛋白氮和非蛋白氮兩大類，主要以有機(jī)氮形式存在。由于蛋白質(zhì)的含氮量相對(duì)穩(wěn)定，測(cè)定出樣品中總氮含量，再乘上一個(gè)系數(shù)即可得出樣品中粗蛋白含量。如要準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)含量，則需利用三氯乙酸將樣品中蛋白質(zhì)沉淀出來，再分別測(cè)定蛋白氮和非蛋白氮。 組織中含氮量常用凱氏定氮法測(cè)定。,3,一、原理,在催化劑（如CuSO4、K2SO4、硒粉等）存在的條件下，將植物材料與濃硫酸共熱，有機(jī)物氧化分解成CO2和H2O，其中的氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘?，并進(jìn)一步生成(NH4)2SO4，這個(gè)過程稱為消化。在消化后的樣品中加入過量的NaOH，經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解釋放出NH3,通過蒸餾借蒸汽將NH3導(dǎo)入過量的硼酸溶液中生成四硼酸銨；再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復(fù)到原來的H+濃度，根據(jù)鹽酸的用量即可計(jì)算出樣品中總氮的含量。,4,一、原理,以甘氨酸為例的化學(xué)反應(yīng)式： 消化：CH2NH2COOH + 3H2SO42CO2 + 3SO2 + 4H2O+NH3 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 蒸餾: (NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O + Na2SO4 + 2NH3 2NH3 + 4H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5H2O 滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO3,5,材料：面粉 儀器設(shè)備：消化管、分析天平、微量凱氏定氮蒸餾裝置、容量瓶、三角瓶、滴定管、移液管、消煮爐等。 試劑： 1. 濃硫酸（AR級(jí)）；2. 30%（W/V）NaOH； 3. 30%H2O2； 4. 0.01mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液； 5. 2%硼酸溶液； 6. 混合催化劑； 7. 混合指示劑； 8. 標(biāo)準(zhǔn)(NH4)2SO4溶液,二、材料、儀器設(shè)備及試劑,6,凱氏定氮蒸餾裝置,全自動(dòng)凱氏定氮儀,7,三、實(shí)驗(yàn)步驟,1. 樣品消化（已完成） 準(zhǔn)確稱取0.1-0.2g樣品（依其含氮量而定）至消化管中，加入5mL濃硫酸和0.3-0.5g混合催化劑，浸泡數(shù)小時(shí)后在管口蓋一小漏斗，放在消煮爐上加熱消化。開始時(shí)溫度可稍低，加熱至管口不再產(chǎn)生泡沫時(shí)可逐漸升溫，使消化管內(nèi)液體達(dá)到微沸，直到消化液褐色消失并全部變?yōu)榍宄和该鳛橹埂?在消化過程中，可分?jǐn)?shù)次加入少許H2O2以加速有機(jī)物氧化。如發(fā)現(xiàn)在消化管上部有黑色顆粒，應(yīng)小心轉(zhuǎn)動(dòng)消化管，用消化液將其沖洗下來。整個(gè)過程一般需3-4小時(shí)，均應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。,8,2. 定容： 消化液冷卻后，沿管壁仔細(xì)加入10mL左右無氨蒸餾水以沖洗管壁冷卻后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶，再用少量無氨蒸餾水沖洗消化管數(shù)次，洗滌液一并轉(zhuǎn)入容量瓶冷卻后用無氨蒸餾水定容至刻度，混勻后備用。,3. 蒸餾 （1）儀器洗滌：在蒸汽發(fā)生器中加入2/3體積蒸餾水關(guān)閉汽水分離器閥和進(jìn)樣漏斗、并使管道聯(lián)通打開冷凝管打開電爐加熱蒸汽發(fā)生器，用熱蒸汽通入儀器各部分清洗15min。,9,3. 蒸餾 （1）儀器洗滌 沖洗完畢，從加樣漏斗向蒸餾反應(yīng)管加入無氨蒸餾水，清洗蒸餾反應(yīng)管打開汽水分離器閥、夾緊蒸汽發(fā)生器與蒸餾反應(yīng)管之間的橡皮管，由于冷卻減壓使得反應(yīng)瓶中廢液被虹吸進(jìn)入隔熱套中打開隔熱套下端的活塞閥排出廢液。如此清洗2-3次。 可將冷凝管下口浸入硼酸-指示劑混合液中檢測(cè)清洗效果，當(dāng)硼酸-指示劑混合液不變色時(shí)，表明蒸餾裝置清洗干凈 。,10,3. 蒸餾 （2）樣品蒸餾 在三角瓶中裝入20mL硼酸-指示劑混合液（此時(shí)應(yīng)為紫紅色，如變?yōu)樗{(lán)色，應(yīng)倒出重裝或清洗三角瓶）承接在冷凝管下端出口，將出口浸入在溶液中打開隔熱套下端的活塞準(zhǔn)確吸取10mL樣品消化液通過加樣漏斗加入蒸餾反應(yīng)管中通過漏斗加入10mL NaOH溶液用少量無氨蒸餾水重復(fù)沖洗漏斗3次塞緊漏斗塞，再在漏斗中加入少量蒸餾水密封漏斗關(guān)閉隔熱套下端活塞和汽水分離閥，打開蒸汽發(fā)生器與蒸餾反應(yīng)管之間的橡皮管夾，開始蒸餾觀察硼酸-指示劑混合液顏色變化，從顏色變綠起再蒸餾3-5min后，將三角瓶液面移離冷凝管下口約1cm 繼續(xù)蒸餾1min左右，結(jié)束蒸餾。,11,3. 蒸餾 （3）空白蒸餾 用未加植物樣品的消化液（其余試劑都加入并按同樣方法進(jìn)行消化）為空白液，按樣品消化液的蒸餾方法進(jìn)行蒸餾。 4. 樣品及空白滴定 樣品和空白蒸餾完畢后，分別用0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直到硼酸-指示劑混合液變回淡紫紅色即為滴定終點(diǎn)，記錄滴定樣品和空白蒸餾液的鹽酸用量。 （滴定空白蒸餾液的鹽酸用量一般為0.2mL）,12,W= g（根據(jù)樣品管編號(hào)在講臺(tái)上查表獲得）； VT= mL; Vs= mL; A= mL；B= 0.2 mL,四、數(shù)據(jù)記錄,五、結(jié)果計(jì)算,樣品總氮含量（%）= 面粉粗蛋白含量（%）=樣品含氮量（%）5.70,（C：滴定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液濃度（0.0100mol/L ）；VT：消化液定容總體積（mL）；W：樣品質(zhì)量（g）；Vs：蒸餾時(shí)取樣體積（mL）；A：滴定樣品所用鹽酸體積（mL）；B：滴定空白所用鹽酸體積（0.2 mL） ）,13,為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術(shù)和檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性及誤差，常用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液測(cè)試3次； 每次蒸餾前均需清洗蒸餾反應(yīng)管； 在蒸餾過程中，不能同時(shí)關(guān)閉汽水分離閥和蒸汽發(fā)生器與蒸餾反應(yīng)管之間的橡皮管夾； 定氮儀各連接處不能漏氣。,注意事項(xiàng)：,14,實(shí)驗(yàn)07 抗壞血酸（Vc）含量的測(cè)定 （滴定法）,15,一、原理,Vc具有很強(qiáng)的還原性，染料2,6-二氯酚靛酚具有較強(qiáng)的氧化性，且在酸性溶液中呈紅色，在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色。用草酸提取Vc，然后用藍(lán)色的堿性2,6-二氯酚靛酚溶液對(duì)其進(jìn)行滴定時(shí)，Vc可將2,6-二氯酚靛酚還原成無色。但當(dāng)Vc被消耗完后，再滴入少許2,6-二氯酚靛酚就會(huì)使溶液呈現(xiàn)紅色，借此可指示滴定終點(diǎn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)2,6-二氯酚靛酚的用量，可以計(jì)算出被測(cè)樣品中Vc的含量。,抗壞血酸又稱為維生素c（Vc），在一般水果、果蔬中含量較高。測(cè)定Vc含量，可作為衡量果蔬品質(zhì)指標(biāo)之一。,16,材料：苞菜或其他果蔬 儀器設(shè)備：蒸發(fā)皿、天平、容量瓶、研缽、堿式滴定管、漏斗、移液管等 試劑： 1. 2%草酸； 2. 堿性2,6-二氯酚靛酚溶液（藍(lán)色）； 3. 0.1mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)Vc溶液（用草酸配制）,二、材料、儀器設(shè)備及試劑,2,6-二氯酚靛酚溶液（藍(lán)色）,17,三、實(shí)驗(yàn)步驟,1. 樣品提取 準(zhǔn)確稱取3g左右樣品放入研缽中，加入2%草酸溶液約5mL研磨勻漿液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶，用草酸洗滌研缽3次，洗滌液一并轉(zhuǎn)入容量瓶中用草酸定容至刻度過濾，收集濾液，備用。,2. 空白滴定 取2%草酸10 mL至蒸發(fā)皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉紅色，并在30s內(nèi)不褪色為滴定終點(diǎn)，記錄染料用量。,18,三、實(shí)驗(yàn)步驟,4. 樣品滴定 取濾液10 mL至蒸發(fā)皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉紅色，并在30s內(nèi)不褪色為止。記錄染料用量。,3. 染料標(biāo)定 取10 mL標(biāo)準(zhǔn)Vc溶液至蒸發(fā)皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉紅色，并在30s內(nèi)不褪色為滴定終點(diǎn)。計(jì)算1mL染料相當(dāng)于Vc的mg數(shù)，即滴定度（A）。,19,W= g；V1= mL; V0= mL； VT= mL; Vs= m