實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù).ppt

,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用 (Real time Quantitative PCR),北京天為時(shí)代科技有限公司 歐陽(yáng)志荃 2005-05-20,天為時(shí)代核酸系列講座之 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院,講 座 提 綱,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹 實(shí)時(shí)熒光定量PCR醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹 實(shí)時(shí)熒光定量PCR醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用,實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 實(shí)時(shí)原理,常 規(guī) PCR技術(shù)： 對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析 無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè),實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)： 利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 定量原理,介紹三個(gè)概念： 擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值,如何對(duì)起始模板定量？,通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 - 擴(kuò)增曲線,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 -熒光閾值,熒光信號(hào)閾值 （threshold ）： 前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值 熒光域值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍 手動(dòng) 設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99 真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過(guò)域值,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定義： PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù),實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 -Ct值的重現(xiàn)性,Ct值的特點(diǎn)： 相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定； Ct值則極具重現(xiàn)性,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 - 定量原理,理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n 非理想的PCR反應(yīng)： X=X0 (1+Ex)n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 - 定量原理,在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí): XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M 方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 - 標(biāo)準(zhǔn)曲線,模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量,確定未知樣品的 C(t)值 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 絕對(duì)定量,講 座 提 綱,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用,非特異性熒光標(biāo)記： 1、 SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 - DNA 產(chǎn)物的熒光標(biāo)記,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法 1 -SYBR Green 法,SYBR Green,SYBR Green 法 工作機(jī)理,SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位,SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 變性時(shí)，DNA雙鏈分開(kāi)，無(wú)熒光 復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)。,SYBR Green,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲線分析,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲線分析,將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT),Tm,SYBR Green 法 融解曲線分析,Cycle number,SYBR Green 法 定量原理,模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量,SYBR Green 法 -PCR反應(yīng)的建立,反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化: SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號(hào)太弱，不易檢測(cè) Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn) MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物 反應(yīng)Buffer 體系的優(yōu)化 反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù):由酶和引物決定 其他與常規(guī)PCR相同,天為時(shí)代公司利用SYBR Green 法定量檢測(cè)樣品DNA,SYBR Green 法 應(yīng)用范圍,起始模板的測(cè)定 基因型的分析 融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對(duì)常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對(duì)primer的評(píng)價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。,SYBR Green 法 優(yōu)缺點(diǎn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法2 -TaqMan法,TaqMan-水解型雜交探針,5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q) 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無(wú)熒光， R與Q分開(kāi)，發(fā)熒光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針,TaqMan法 工作原理,每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過(guò)程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光,TaqMan 法 PCR反應(yīng)的建立,1、引物、探針的設(shè)計(jì)： 探針Tm為68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能會(huì)淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400 bp，引物Tm為59-60 2、反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通過(guò)溫度梯度優(yōu)化退火溫度 72 ，45 S， 3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號(hào)/背景比值 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM 4、其他與常規(guī)PCR相同,已肝病人血液中HBV的絕對(duì)定量 目的：利用核酸檢測(cè)，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù) 方法：從血液中提取病毒DNA，擴(kuò)增病毒基因，以TaqMan探針進(jìn)行檢測(cè) 設(shè)置對(duì)照：濃度為106、105 、104 103 的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)陰性和空白對(duì)照 實(shí)驗(yàn)步驟：提取HBV DNA 設(shè)計(jì)特異引物 設(shè)計(jì)TaqMan探針并標(biāo)記探針 擴(kuò)增程序 結(jié)果：獲取血液樣品中HBV DNA的精確copy數(shù),天為時(shí)代公司利用TaqMan法 檢測(cè)血液中的HBV,數(shù)據(jù)分析,分析結(jié)果： HBV DNA的精確copy數(shù)為3.7X105,天為時(shí)代公司利用TaqMan法 檢測(cè)血液中的HBV,TaqMan法 應(yīng)用范圍,起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 產(chǎn)物鑒定 SNP分析,TaqMan法 優(yōu)缺點(diǎn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法 3- Molecular beacon 法(分子信標(biāo)),標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針 環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ) 莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成,發(fā)夾型雜交探針,Molecular beacon (分子信標(biāo)) 工作原理,熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET） 探針與DNA雜交時(shí)產(chǎn)生熒光 -變性過(guò)程：產(chǎn)生非特異性熒光 -延伸過(guò)程：不產(chǎn)生熒光 -退火過(guò)程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測(cè)熒光信號(hào),Molecular beacon (分子信標(biāo)) 應(yīng)用范圍,起始模板的定量 基因型分析 產(chǎn)物鑒定 SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析,Molecular beacon (分子信標(biāo)) 優(yōu)缺點(diǎn),講 座 提 綱,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 標(biāo)準(zhǔn)樣品,相對(duì)定量中的內(nèi)標(biāo) 內(nèi)標(biāo)通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小 內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量,絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA拷貝數(shù),用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品如何設(shè)定？ 含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒 含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA 紫外分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)測(cè)定濃度 根據(jù)質(zhì)粒或cDNA分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀釋,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 定量方法,絕對(duì)定量檢測(cè)起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常用到標(biāo)準(zhǔn)曲線 相對(duì)定量確定經(jīng)過(guò)不同處理的樣本目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間基因的表達(dá)差異（不同時(shí)相） 2-C（t） 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 TaqMan法舉例,TaqMan法研究ERBB2 在乳腺腫瘤 組織標(biāo)本中的表達(dá)差異,TaqMan法舉例 標(biāo)記探針,使用 TaqMan 探針進(jìn)行雙通道熒光定量,Fam標(biāo)記目標(biāo)基因探針 VIC標(biāo)記看家基因探針,TaqMan法舉例 材料準(zhǔn)備,從正常乳腺組織中提取的總 RNA 從乳腺癌組織中提取的 總RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的質(zhì)粒用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線 單雙通道同時(shí)進(jìn)行，獨(dú)立分析 Controls no RNA：陰性對(duì)照 RNA + no reverse transcriptase：基因組對(duì)照,TaqMan法舉例 反應(yīng)程序,RT-qPCR 反應(yīng)程序：,TaqMan法舉例 癌癥標(biāo)記物表達(dá),Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,TaqMan法舉例 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 單雙通道相互驗(yàn)證,TaqMan法舉例 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 定量,Copies ng/ l Total RNA,TaqMan法舉例 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 定量分析,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.0115,0.018,Copies ng/ l Total RNA,TaqMan法舉例 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表達(dá)差異,Healthy Tissue,Carc. Tissue,Relative Expression,ERBB2的表達(dá)差異,TaqMan法舉例 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 討論,通過(guò)RT-qPCR成功檢測(cè)了ERBB2基因在不同組織的 表達(dá)差異；在乳腺癌組織中，ERBB2的表達(dá)量是正常水平的1.8倍,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 SYBR Green I法舉例,利用SYBR Green 1進(jìn)行GMO定量 (SGI) for GMO soy detection,SYBR Green I法 GMO概念,轉(zhuǎn)基因生物又稱遺傳修飾生物（Genetically Modified Organisms，GMO），是經(jīng)基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成的生物，包括轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因微生物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。,SYBR Green I法 GMO概念,1983年：首例轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因煙草 1986年：轉(zhuǎn)基因植物首次進(jìn)入田間實(shí)驗(yàn) 1994年：首例轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品Flavr Savr 延熟保鮮轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)入市場(chǎng) 1996年至今：轉(zhuǎn)基因作物迅猛發(fā)展期,SYBR Green I法 檢測(cè)方法,轉(zhuǎn)基因生物包括了特異的核酸序列，調(diào)控序列、目標(biāo)基因、報(bào)告基因 通過(guò)內(nèi)源基因來(lái)對(duì)每個(gè)樣品DNA進(jìn)行定量（Normalization) 利用插入基因的定量來(lái)進(jìn)行GMO含量檢測(cè),SYBR Green I法 材料準(zhǔn)備,Roundup Ready 大豆（RTC公司，IRMM-41050-56） 普通非轉(zhuǎn)基因大豆 從超級(jí)市場(chǎng)買來(lái)的下列食物用來(lái)作為測(cè)試樣品： 大豆餅,豆制甜點(diǎn) 和兩個(gè)牌子的大豆粉,SYBR Green I法 樣品制備,標(biāo)準(zhǔn)品的制備:轉(zhuǎn)基因成分含量分別為 0%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2% 和 5% 轉(zhuǎn)基因大豆 實(shí)驗(yàn)樣本 從含大豆成分的樣本中提取DNA,SYBR Green I法 引物設(shè)計(jì),Lectin 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為318bp 其引物為： 正向：5-GAC-GCT-ATT-GTG-ACC-TCC-TC-3， 反向：5-GAA-AGT-GTC-AAG-CTT-AAC-AGC-GAC-G-3 EPSPS 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為356bp 其引物為： 正向：5-TGG-CGC-CCA-AAG-CTT-GCA-TGG-C-3 反向：5-CCC-CAA-GTT-CCT-AAA-TCT-TCA-AGT-3,SYBR Green I法 C（t）定量,log A/B = logA- logB A: EPSPS GMO B: Lectin all bean A/B: %GMO,SYBR Green I法測(cè)GMO 數(shù)據(jù)收集與分析,標(biāo)準(zhǔn)曲線log%GMO對(duì)應(yīng)C（t）獲得 熔解曲線分析，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,數(shù)據(jù)處理： C（t）EPSPS-C（t）lectin=C（t） 處理?xiàng)l件： 假定兩對(duì)引物有相同的擴(kuò)增效率并且相互獨(dú)立擴(kuò)增。,SYBR Green I法測(cè)GMO 熔解曲線分析,Tm = 92oC,Tm = 88.5oC,SYBR Green I法測(cè)GMO 實(shí)驗(yàn)結(jié)果