維生素d與糖尿病的聯系研究方案.ppt

項 目 名 稱：維生素D對2型糖尿病的預防作用,一、立題依據及意義,糖尿病 （diabetes mellitus）,定義：一種在遺傳和環(huán)境因素長期共同作用下，由于胰島素分泌絕對或者相對不足所導致的漸進性蛋白質、脂肪、水和電介質代謝發(fā)生紊亂的一系列綜合征，其中以高血糖為主要標志。,糖尿病患病人數與日俱增 我國每天新增糖尿病患者約3000例 每年大約增加120萬例糖尿病患者 預計到2025年，中國的糖尿病患者將超過5000萬,型糖尿病患病率特點,2型糖尿病患者約占糖尿病患者總數的90%，多發(fā)生于四十歲以上的人群和老年人，近年其發(fā)病年齡有下降趨勢。 患病率急劇增加 血糖升高，但未達到糖尿病診斷標準者大量存在 各地發(fā)病狀況差異巨大 農村城市化，糖尿病患病率增加,型糖尿病發(fā)病年齡的年輕化,逐代年輕現象：子代發(fā)病年齡低于父母 近年來兒童2型糖尿病患病率迅速增加，值得關注,維生素D與型糖尿病,型糖尿病風險人群總體血清維生素D水平低于非風險人群。 伴有輕微腎功能不全的型糖尿病患者，其心血管疾病的發(fā)病率與其維生素D水平呈負相關。 與那些維生素D濃度高于13.9 nmol/L的患者相比，嚴重缺乏維生素D(少于13.9 nmol/L)的患者死亡的可能性要高103%，死于心血管疾病的可能性要高95%。,維生素D與型糖尿病的相關研究,非籍美國黑人患NIDDM的比例較高，同時他們的維生素D缺乏率也很高，而補充維生素D對他們的NIDDM也存在一定的治療作用。 The potential to improve diabetes control with vitamin D replacement in African American patients: case report and literature review 人們一直認為，維生素含量高可能會增加人們患型糖尿病的風險，但我們的研究并沒有發(fā)現這方面的證據。 克內克特博士所進行的追蹤研究中，共有人患上型糖尿病。統(tǒng)計數據顯示，當獲取的血液樣本排除了年齡、性別和季節(jié)因素后，血液中維生素含量和罹患型糖尿病的關系與之前的看法截然相反 。 芬蘭赫爾辛基國家公共衛(wèi)生研究所的保羅克內克特博士,維生素D預防型糖尿病的機制,維生素D在代謝綜合征中有重要作用，具有改善胰島素敏感性作用的潛力。 維生素D可以令人體免疫系統(tǒng)保持健康，保護人體細胞免遭損壞，如產生胰島素的胰腺細胞。 肥胖人群中2型糖尿病發(fā)生率增加，也和維生素D有關：一方面，維生素D易于在人體脂肪沉積，但不再具有生物活性；另一方面，維生素D可以調節(jié)脂肪細胞儲脂作用。,創(chuàng)新之處及目的,目前，關于2型糖尿病的研究有很多，但大多數都是研究如何治療的。如果可以通過一些簡單的方法來預防它在人群中的發(fā)生，效果將更好。從以上的介紹中可以看出維生素D與2型糖尿病的發(fā)生似乎存在一些關系，所以，針對這一問題，我們小組設計了這項實驗，來探索維生素D對NIDDM的發(fā)生究竟有什么作用。 我們推斷不同濃度的維生素D對機體的作用不同，大劑量維生素D或維生素D缺乏都可能會促進NIDDM的發(fā)生，而少量的維生素D會減少NIDDM的發(fā)生。如果結論得到證實，那么，對易于發(fā)生維生素D缺乏或過多的人群相應的補充或降低維生素D的攝入，將對這類人群NIDDM的發(fā)生起到一定的預防作用。,二、技術路線,動物：120只健康雄性小鼠 藥品：STZ（鏈佐脲菌素，Streptozotocin ）、1,25-(OH)2D3、檸檬酸鹽緩沖液、花生油、肝素 儀器設備：哺乳動物手術器械一套、注射器、試管、便攜式血糖儀、SDS-PAGE電泳儀和轉膜儀、搖床、離心機、胰島素ELISA 檢測試劑盒、光學顯微鏡,實驗步驟,1、模型的建立：取只體重在2025g的健康雄性小鼠，連續(xù)7d腹腔注射STZ（20 mgkg-1），期間喂食高熱量食物。分別于注射STZ的第1、2、3、4、6周末各測一次血糖，以血糖水平持續(xù)高于11.1mmol/L為判斷成模的標準。造模期間死亡動物不計入統(tǒng)計范圍。,2、動物分組：每組30只小鼠（實驗在相對較暗的環(huán)境中進行） 糖尿病組，隔日腹腔注射花生油(5gkg-1)，共14次；連續(xù)7d腹腔注射STZ（20 mgkg-1）；分別于注射STZ的第1、2、3、4、6周末各測一次血糖，以血糖水平持續(xù)高于11.1mmol/L為判斷成模的標準，期間喂食高熱量食物。造模期間死亡動物不計入統(tǒng)計范圍。 少量Vd組，隔日腹腔注射1,25-(OH)2D3（2gkg-1），共14次; 連續(xù)7d腹腔注射STZ（20 mgkg-1），期間喂食高熱量食物。 大量Vd組，隔日腹腔注射1,25-(OH)2D3（5gkg-1），共14次; 連續(xù)7d腹腔注射STZ（20 mgkg-1），期間喂食高熱量食物。 空白對照組，隔日腹腔注射花生油(5gkg-1)，共14次；連續(xù)7d腹腔注射與糖尿病組等容量檸檬酸鹽緩沖液，期間喂以正常食物。,3、樣本采集與處理：實驗第9周，開始記錄一周內各組小鼠的尿量和飲水量。第9周結束后，各組小鼠空腹8小時后，測糖耐量。之后，斷尾取血用便攜式血糖儀檢測血糖水平；采集血清用胰島素ELISA 檢測試劑盒檢測血清胰島素水平；采集肝臟標本利用細胞免疫組化及Western blot法檢測胰島素受體的表達情況；采集胰腺標本利用Western blot法檢測胰島細胞Bax和Bcl-xL蛋白表達水平；取胰腺制作標本，觀察胰島B細胞損傷情況。,4、統(tǒng)計學分析：SPSS10.0軟件處理。結果以s表示。同組內處理前后比較用配對t檢驗。組間比較用完全隨機設計的方差分析，若結果有意義再進行多個樣本均數間比較的SNK-q檢驗（Bax、Bcl-xL陽性率經平方根轉化后再進行統(tǒng)計分析）。糖尿病發(fā)病率用fisher確切概率法。P0.05表示差異有顯著性，P0.01表示差異有極顯著性。,三、結果預測,實驗時程,9周后，各組小鼠空腹8小時后，測糖耐量。之后，斷尾取血用便攜式血糖儀檢測血糖水平；采集血清用胰島素ELISA 檢測試劑盒檢測血清胰島素水平；采集肝臟標本利用細胞免疫組化及Western blot法檢測胰島素受體（IR）的表達情況；采集胰腺標本利用Western blot法檢測胰島細胞Bax和Bcl-xL蛋白表達水平；取胰腺制作標本，觀察胰島B細胞損傷情況。 記錄實驗結果,并分析.,數據表格,數據處理結果存在具有統(tǒng)計學意義，則結果說明Vd確實對2型糖尿病的發(fā)生有所影響。 飲水量與尿量：少量組糖尿病組大量組 血糖：少量組糖尿病組大量組 Bcl-xl表達水平：少量組糖尿病組大量組 Bax表達水平：少量組糖尿病組大量組 胰島B細胞損傷情況：少量組糖尿病組大量組,理想結果,四、討論,糖尿病是一種代謝紊亂綜合癥。它是由于胰島素分泌相對或絕對不足、胰島素活性的缺乏或是胰島素抵抗等原因而導致的以高血糖為特征的疾病。,WHO推薦糖尿病分為四種類型,1型糖尿病又稱胰島素依賴型糖尿病（IDDM） 患者病狀通常出現在兒童或青少年時期。是由各種原因引起的自身免疫機制紊亂所致的胰島B細胞破壞，是胰島素分泌絕對缺乏，血糖升高 。,2型糖尿病又稱非胰島素依賴性糖尿?。∟IDDM） 目前認為，是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結果，病因與胰島素抵抗和胰島素分泌不足有關 。還可能與向心性肥胖以及衰老所致的體內自由基生成增多密切相關。,關于NIDDM,由于胰島B細胞響應有缺陷，導致胰島素分泌不足： 產生的數量 分泌時間 末梢組織對胰島素的響應性和敏感性都明顯減弱 肝臟對胰島素的敏感性減弱 對于正常人來說，胰島素可以抑制肝臟釋放葡萄糖入血。而對于NIDDM病人，肝臟持續(xù)分解糖原形成葡萄糖進入血液。,胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)是指胰島素作用的靶器官對胰島素作用的敏感性下降，即正常劑量的胰島素產生低于正常生物學效應的一種狀態(tài),2型糖尿病中一部分病人以胰島素抵抗為主，病人多肥胖，因胰島素抵抗，胰島素敏感性下降，初期可能出現血中胰島素增高以補償其胰島素抵抗，隨著病情的發(fā)展，出現胰島素抵抗伴胰島素分泌的絕對不足。,維生素D,維生素D是類固醇衍生物，屬脂溶性維生素類，其中最主要的是維生素D3。人體內的膽固醇在皮膚細胞被氧化成維生素D3原，經紫外線照射轉變?yōu)榫S生素D3。 維生素D可以調節(jié)鈣、磷的代謝 在一定人群中經?？沙霈F維生素D的缺乏，（黑人，不曬太陽，飲食不均衡，長期使用抗癲癇藥物（苯巴比妥）相反也有人過量補充維生素D造成體內維生素D含量過高 。,維生素D與NIDDM的關系,研究發(fā)現維生素D與2型糖尿病的發(fā)生關系密切.低維生素D血癥的人群中2型糖尿病的發(fā)病率明顯增高，而補充維生素D對這些病人也有一定的治療作用。 其機制可能是低維生素D抑制胰島素的合成和分泌,加重胰島素抵抗而導致糖尿病的發(fā)生發(fā)展,關于實驗模型,實驗中應用的STZ是鏈脲佐菌素（Streptozotocin），這種化學物質對胰島細胞有選擇性破壞作用 。 大劑量注射時，由于直接引起胰島細胞的廣泛破壞，可造成1型糖尿病模型；而注射較少量STZ時，由于只是破壞一部分胰島細胞的功能，造成外周組織對胰島不敏感，同時給予高熱量飼料喂養(yǎng)，兩者結合便誘導出病理、生理改變都接近于人類2型糖尿病的動物模型。 本次試驗中，相對于補充Vd的兩組，糖尿病組處于維生素D缺乏的狀態(tài) 。,關于實驗數據,尿量和飲水量： 糖尿病患者在早期通常會出現有所謂的“三多一少”癥狀：多飲、多食、多尿和消瘦。糖尿病病人血糖升高，而高血糖對人體損害很大，人體為了保護自己，不得不通過尿液排出多余糖分，致使尿量明顯增多。人如果尿得太多，體內損失了大量的水分，就會感到口渴難忍。所以尿量和飲水量明顯增高，可以一定程度上反映是否患糖尿病。若實驗中尿量和飲水量一項出現“少量組糖尿病組大量組”現象，則可說明大劑量維生素D或維生素D缺乏都會促進NIDDM的發(fā)生，而少量的維生素D會減少NIDDM的發(fā)生,血糖： 血糖濃度是反映是否患糖尿及病情輕重的最重要的指標，為主要的觀察項目。它可以直接反應糖尿病的發(fā)病率，比較出不同濃度的Vd對NIDDM的發(fā)生的影響。,糖耐量： 通俗地說就是人體對葡萄糖的耐受能力。醫(yī)院通常會對疑似糖尿病患者進行糖耐量測試，如果糖耐量試驗服糖后2小時血糖介于7.8至 11.1毫摩/升，表明機體糖耐量能力減低，也就是說身體對糖的吸收和利用比正常狀態(tài)差了。糖耐量越低說明機體對糖的耐受越差，病情越嚴重。所以可以通過檢測實驗動物的糖耐量來反映小鼠是否患糖尿病，及病情輕重程度。,胰島素含量： 該項指標可一定程度反映不同濃度維生素D對胰島素分泌功能的影響。但NIDDM初期可能出現血中胰島素增高以補償其胰島素抵抗，隨著病情的發(fā)展，出現胰島素抵抗伴胰島素分泌的絕對不足。所以本次試驗中該項指標需與其他指標結合比較才能發(fā)揮作用。,肝臟胰島素受體（insulin receptor）的表達水平： 肝臟對胰島素的敏感性是保證機體血糖正常的重要因素。一些研究發(fā)現一定濃度的維生素D可能刺激胰島素受體的表達從而增強胰島素對葡萄糖轉運的反應，可改善胰島素敏感性，減弱胰島素抗性，對NIDDM起到預防作用。實驗可以從這項指標來確定不同濃度的Vd對IR的表達有什么作用。,胰島B細胞Bcl-xl蛋白和Bax蛋白表達水平： 維生素D有保護胰島細胞和促進損傷的細胞修復再生的作用,試驗中的Bcl-xl蛋白和Bax蛋白的表達水平可以反映這一情況。Bcl-xl蛋白可以抑制細胞凋亡。Bcl-xl高表達,凋亡指數低,bcl-2低表達或不表達,則凋亡指數高。Bax蛋白情況相反,Bax高表達時,則凋亡指數高,Bax低表達或不表達時凋亡指數低，Bax促進凋亡。實驗中測胰島B細胞這兩種蛋白的表達水平就可以判斷胰島B細胞的破壞情況。,病理切片觀察胰島B細胞損傷情況： 一定濃度的維生素D有保護胰島B細胞和促進損傷的B細胞修復再生的作用, 而該項指標可以直接表示胰島B細胞的受損情況。若結果出現胰島B細胞損傷“少量組糖尿病組大量組”的現象，則可證明低濃度的維生素D有保護胰島B細胞和促進損傷的B細胞修復再生的作用，進而證明其預防NIDDM發(fā)生的作用。,其他機制（本次試驗沒有涉及）,通過調節(jié)細胞外鈣濃度以保證正常的鈣內流（維生素D調節(jié)鈣代謝的作用） 骨骼肌和脂肪組織維持一個正常的胰島素敏感性所需要的合適的 鈣濃度范圍是很窄的，因此鈣濃度波動可能使得這些重要的周圍組織的胰島素信號傳導發(fā)生障礙，使得胰島素轉運子4的活性下降，從而導致胰島素抵抗。 減輕炎癥反應 這可能源于維生素受體（VDR）介導的免疫調節(jié)作用,五、參考文獻,1.J Diabetes. 2010 Mar;2(1):36-40. doi: 10.1111/j.1753-0407.2009.00057.x. Epub 2009 Oct 5Lack of effect of subtherapeutic vitamin D treatment on glycemic and lipid parameters in Type 2 diabetes: A pilot prospective randomized trial 2.Int J Intem Med, 2009,36:82-83 Zhanglili ,Yuanli Clinical progress in studies on vitamin D and type 2 diabetes 3.Vitamin D and Diabetes Looking for links between the sunshine vitamin