液相色譜法分離手性藥物.ppt

,液相色譜法分離手性藥物,概念,許多藥物中存在著分子組成與構造完全相同但分子的立體結構不同的化合物，他們是立體異構體，不能完全疊合但能互為鏡像，（如左手與右手），這就是手性(chirality)。,手性藥物,藥物作用的靶分子都是手性的，因此藥物分子與靶分子的不對稱性必須相匹配（手性識別手與手套）。 另外，分子藥理學研究發(fā)現(xiàn)，含有手性因素的化學藥物對映體，在人體內(nèi)的藥理活性、代謝過程和毒性存在著顯著差異。在通常情況下，只有一個對映體具有藥理作用，而另一個對映體不僅無藥理作用，還會產(chǎn)生一定副作用。 如20世紀60年代，鎮(zhèn)靜藥反應停（thalidomide,沙利度胺）的消旋體用作緩解妊辰反應作用，后來發(fā)現(xiàn)在歐洲服用過的孕婦不少產(chǎn)下海豚狀畸形兒。隨后研究表明：反應停右旋體（R型）有鎮(zhèn)靜作用，左旋體（S型)具有胚胎毒性和致畸作用。,研究背景,1992年FDA發(fā)布手性藥物指導原則，要求所有在美國上市的消旋體新藥，生產(chǎn)者均需提供詳細報告，說明藥物中所含對映體各自的藥理作用、毒性和效果。 顯然，單一異構體的試驗次數(shù)比較單純，經(jīng)濟上更合算。 目前普遍使用的2000多種合成藥物中有600余種為手性藥物，而活性的單一對映體藥物不足100種，其它500余種都是左右旋混在一起的消旋體藥物。 1999年，手性藥物市場第一次超過1000億美元，單一異構體藥物銷售額達到1150億美元，占世界藥品市場3600億美元的32%。,常用的手性藥物測定技術,高效液相色譜 (HPLC) 氣相色譜 (GC)(樣品需具有一定的揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性） 毛細管電泳(HPCE) 超臨界流體色譜（SFC),HPLC,80年代初HPLC法迅速成為藥物對映體分離和測定最為廣泛應用的方法。 特別適用于極性強、熱穩(wěn)定性差的手性藥物的分析。 HPLC用于手性分離概括起來可分為兩大途徑：間接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。,液相色譜法分離手性藥物,直接法（CMPA、CSP）： 對映體之一與手性固定相或手性流動相添加劑間發(fā)生分子間的三點作用（較穩(wěn)定），另一對映體發(fā)生兩點作用；形成暫時的非對映異構體的結合物質(zhì)，通過洗脫分離。 間接法（CDR) 又稱為非對映體拆分法或柱前手性衍生化法 對映體混合物在預處理中進行柱前衍生組成一對非對映體(Diastereoisomers) ，依其理化性質(zhì)的差異，在非手性柱上得以分離。,間接法：柱前衍生,優(yōu)點： *可采用通用的非手性柱分離； *通過衍生化可提高檢測靈敏度； *分離條件簡單； *分離效果好 缺點： *要有可被衍生化的基團； *要有高光學純度的手性試劑； *對個對映體衍生化率速和平衡常數(shù)應一致； *衍生化和色譜過程中不能發(fā)生消旋化；,直接法：,手性流動相添加劑（CMPA）法： （又可稱為手性流動相(CMP)拆分法或手性洗脫法） & 環(huán)糊精(Cyclodextrins)類（主要是-、-和-環(huán)糊精及其衍生物）； & 手性離子對配合劑(Chiral Ion Pair Complex,CIPC)，如（+）-10-樟腦磺酸、奎寧和奎尼丁等； & 配位體交換型手性流動相添加劑（Chiral Ligand-exchange Complexs, CLEC) 。 手性固定相（CSP）法,手性固定相（CSP）法,優(yōu)點是： 能廣泛適用于各類化合物，適于常規(guī)及生物樣品的分析測定； 除非必須衍生化，否則無需高光學純度試劑； 樣品處理步驟簡單。 制備分離方便，定量分析的可靠性較高； 缺點是： 樣品有時也須作柱前衍生（但不一定是手性衍生化試劑）， 對樣品結構有一定限制，其適用性尚不及普通HPLC固定相（包括正相和反相）那樣廣泛。 迄今為止，CSP柱商品已有40多種，價格大多昂貴，尚未有一種具有類似ODS柱的普遍適用性。,常用的手性固定相（CSP）法,& 刷（Brush）型或稱為Prikle型 & 手性聚合物固定相（如纖維素、淀粉，合成的手性聚合物）； & 含肽或蛋白質(zhì)手性固定相； & 含環(huán)糊精（Cyclodextrin）及其衍生物的手性固定相； & 大環(huán)抗生素（Macrocyclic antibiotics）型 & 配位交換（|Ligand exchange）型 & 冠醚（Crown ethers）型,在手性拆分中，溫度的影響是很顯著的。低溫增加手性識別能力，但可能引起色譜峰變寬而導致分離變差。因此確定手性分析方法過程中要考慮柱溫的影響，確定最優(yōu)柱溫。 根據(jù)分子結構選擇合適的CSP柱是非常重要的。 Chiral Technologies Europe(法國)和Chiral Technologies(美國，是日本Daicel化學工業(yè)公司的全資子公司 )是專門為制藥和農(nóng)業(yè)化學及相關工業(yè)提供對映體分離服務的公司。服務的領域包括分析方法的開發(fā)和cGMP噸級單一對映體的分離和商業(yè)規(guī)模工藝的開發(fā)等。 手性聚合物固定相商品柱主要是日本Daicel公司制造的Chiralcel柱。 Daicel固定相的廣泛選擇性和高負載性能，使Chiral Technologies及整個Daicel集團成為手性色譜產(chǎn)品和服務市場的領先者。Daicel的手性固定相是以纖維素為基礎的，如將甲酰(3，5-二甲苯胺)基引入纖維素的羥基。,合適的CSP柱,手性聚合物固定相Chiralcel柱類型與應用,經(jīng)驗,CHIRALPAK AD-H CHIRALCEL OD-H(50-60%) CHIRALCEL OJ-H # CHIRALPAK AS-H (20%),DAICEL 柱使用的溶劑,流動相采用烷烴-醇混合物體系（主要是正己烷-異丙醇），極性溶劑乙醇、甲醇、乙腈容許存在。 以下溶劑一點也不可以存在（會破壞柱子）： 丙酮、氯仿、DMF、DMSO、THF、甲苯、乙酸乙酯、二氯甲烷、吡啶,流動相添加劑,酸性化合物：TFA乙酸、甲酸 堿性化合物：DEA乙醇胺、丁醇胺 加入量0.1-0.2，不超過0.5。 柱子穩(wěn)定的PH范圍：2.0-7.0。,樣品溶解性,樣品含量0.5mg/ml1.0mg/ml. 酸性化合物和堿性鹽，可加添加劑來增加樣品的溶解性。 仍不好溶，可溶于100醇（甲醇、乙醇、異丙醇）;若流動相中有烷烴則不可用乙腈. 水溶性化合物最好用反相柱，如OD-R、OD-RH、OJ-RH、AD-RH、AS-RH; 可用醇-水、乙腈-水作流動相。,柱子壓力過高,原因：可能是雜質(zhì)堵住了柱頭（frit）。 可更換在線過濾器（in-line filter)或保護柱，或注射前過濾樣品。 由于