血清球蛋白的提純.ppt

實(shí)驗(yàn)4 血清-球蛋白的提純 Purification of serum -globulin,遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 朱 欣 婷,實(shí)驗(yàn) 思路,蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)有哪些？,蛋白質(zhì)的分離方法有哪些？,本次實(shí)驗(yàn)利用了哪個(gè)性質(zhì)？,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,1.掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質(zhì)的基本原理及操作； 2.掌握離心機(jī)的操作； 3.熟悉蛋白質(zhì)定性檢測的方法；,分離蛋白質(zhì)的方法,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并 使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。 原理: 破壞蛋白質(zhì)兩個(gè)穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層 中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。 優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)不變性，常用。,（一）鹽 析 法,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,【實(shí)驗(yàn)原理】,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,（二）層析法,待分離物質(zhì)(流動(dòng)相)經(jīng)過一個(gè)固態(tài)物質(zhì)(固定相)時(shí)，根據(jù)溶液中待分離物質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離蛋白組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同流速流經(jīng)固定相實(shí)現(xiàn)分離。,凝膠層析法,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,定義：利用半透膜把大小分子分開的方法。,材料：特制的半透膜，截止分子量一般為一萬。,（三）透 析 法,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,臨床應(yīng)用：血液透析,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,（四）離心技術(shù),離心技術(shù) 是將含有微小顆粒的懸浮液置于離心轉(zhuǎn)子中，利用轉(zhuǎn)子繞軸旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力將微小顆粒按密度或質(zhì)量的差異將其分離的方法。,沉降速度(v) 指在強(qiáng)大的離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)顆粒沿半徑方向運(yùn)動(dòng)的距離。 v=6.09210-4D2（m）n2r/m,D 顆粒直徑 顆粒的密度 m 介質(zhì)的密度 m 介質(zhì)粘度 r 旋轉(zhuǎn)半徑（物質(zhì)質(zhì)點(diǎn)所處位置與旋轉(zhuǎn)中心的距離） N 轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,離心操作要領(lǐng) 1、根據(jù)待離心的溶液性質(zhì)及體積選擇合適的離心管。裝載液體時(shí)要按各種離心機(jī)操作說明進(jìn)行。無蓋離心管不能裝的太滿。密封的或有蓋離心管常要求裝滿，以免離心管變形。 2、精確地平衡離心管及其內(nèi)容物。 3、平衡后的離心管和內(nèi)容物（包括套筒）應(yīng)對(duì)稱放置 4、啟動(dòng)離心時(shí)離心速度由慢到快，當(dāng)?shù)竭_(dá)離心時(shí)間時(shí)， 開啟減速或速度調(diào)節(jié)旋鈕減速。,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,檢測蛋白質(zhì) 雙二縮脲試劑：溶液顯紫紅色 20磺柳酸 ：有白色沉淀產(chǎn)生 檢測NH4+ 納氏試劑：黃色或棕色,五、檢測蛋白質(zhì)、 NH4+的方法,1. 鹽 析 透 析 脫 鹽 4. 檢 測,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,1.鹽析,取離心管一支加入血清2ml,加入2ml PBS搖勻,逐滴加入pH7.2飽和(NH4)2SO4 2ml,搖勻,上清液（主要含清蛋白）傾入試管中,靜止10分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘,沉淀用1ml PBS攪拌溶解,逐滴加飽和(NH4)2SO4 0.5ml,搖勻,靜止10分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘,傾棄上清液（主要含、球蛋白）,沉淀即為初步純化的球蛋白,透 析,脫 鹽,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,2.透 析,清蛋白,換 水,透析袋剛放入水中時(shí),立即取袋外液體檢查有無NH4； 每隔4分鐘檢查一次，共3次，比較NH4透出的情況。,約0.5小時(shí)，檢查袋外液體的NH4； 取袋外液2滴，置于小試管中，然后滴加20磺柳 酸12滴，觀察有無沉淀產(chǎn)生。,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,3.脫鹽,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,上樣 球蛋白，PBS 10滴溶解,裝柱 葡聚糖凝膠G25，柱 高3/42/3柱長,流速：每分鐘10滴左右,加入洗脫劑 PBS 10ml,收集 20滴換一支試管,.層析后洗脫液檢測,每組兩塊比色板,洗凈備用。 一塊在各孔滴加納氏試劑（檢測NH4+）,另一塊滴加雙二縮脲試劑（檢測蛋白質(zhì)）。若發(fā)現(xiàn)有顯色反應(yīng)此孔顯色劑棄用。 不用滴管,避免污染,直接倒 用“-”表示無現(xiàn)象，用“+”, “+”, “+”等表示顏色深淺, 回收凝膠,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,表1. 層析后洗脫液的顯色結(jié)果,表2. 透析后的袋外溶液顯色結(jié)果,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,.使用離心機(jī)的操作注意事項(xiàng)。 .裝柱時(shí)檢查是否有尼龍布，是否漏水。 .裝柱后凝膠均一無斷層，無氣泡，柱床面平整。 .柱床面保持有緩沖液。 .層析加樣時(shí)動(dòng)作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。 .每用一次滴管，請(qǐng)用水清洗干凈，防止試劑及被測樣 品交叉污染,思 考,生物化學(xué)教研室 朱欣婷,1為何硫酸銨能沉淀蛋白質(zhì)?第一次鹽析時(shí)硫酸銨的飽和度是多少?沉淀的是何種蛋白質(zhì)，使沉淀溶解再次鹽析的目的是什么? 2根據(jù)凝膠過濾原理解釋Sephadex G25脫鹽的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 3用硫酸銨分段沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，透析袋外液體會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)嗎?你能否做一個(gè)小實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)，并說明實(shí)驗(yàn)原理。 4. 請(qǐng)用已學(xué)習(xí)的方法來證明本次實(shí)驗(yàn)每次離心后所得的樣品是血清蛋白中的哪種蛋白