冬蟲夏草中腺苷含量的測定.doc

冬蟲夏草及含片中腺苷含量的測定摘要目的：建立用HPLC法測定冬蟲夏草及含片中腺苷的含量。方法：C18(4.6mm250mm,5um)色譜柱，0.05molL-1磷酸二氫鉀+甲醇（90+10）為流動相，流速為1.0mlmin-1,檢測波長260nm，柱溫為35。結(jié)果：腺苷含量在0.0050.2ug(r=0.9998)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。平均回收率為99.49%，RSD=1.47%。結(jié)論：方法準確可靠、結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，分析速度快，可有效控制制劑的質(zhì)量。關(guān)鍵字：HPLC；冬蟲夏草菌粉；含片；腺苷；DAD7AbstractObjective: to determine the contentof adenosineCordyceps powderandtablets byHPLC method.Methods: kromasil-C18( 4.6mm 250mm ,5um) column,using methanoltwo hydrogen0.5mol L-1phosphoric acid(90:10)as mobile phase,the flow rate was 1.0ml min-1,the detection wavelength was 260nm,the column temperature was 35.Results:adenosinein0.005 0.2ug(r=09998)showed a good linear relationshipin the range of.The average recovery was 101.16%,RSD=1.47%.Conclusion: themethod is Conclusion: the method is accurate and reliable, strong specificity, results stability, good reproducibility, which can effectively control the quality of the preparation.Keywords:Cordyceps sinensis powder;tablet;adenosine;HPLC目錄摘要IAbstractII1. 前言21.1 儀器與試藥22. 實驗條件22.1 供試品提取溶劑的選擇22.2 檢測波長的選擇22.3 流動相的選擇23. 試驗方法與結(jié)果33.1 分析溶液33.1.1 對照品溶液制備33.1.2 供試品溶液制備33.2 色譜條件33.3 分析方法學(xué)考察33.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗33.3.2 標準曲線繪制及線型范圍考察43.3.3 精密度試驗43.3.4 重復(fù)性試驗43.3.5 穩(wěn)定性試驗43.3.6 加樣回收率試驗43.3.7 樣品測定44. 討論54.154.254.35參考文獻：6致謝71. 前言 冬蟲夏草，僅僅是我國190多種蟲草中的一種，也是中藥傳統(tǒng)的滋補藥材。冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，主要活性成分是蟲草素，是中國特有的蟲生真菌，其有調(diào)節(jié)免疫力功能、抗腫瘤、抗疲勞等功效。在藥理學(xué)現(xiàn)代研究結(jié)果中，青海冬蟲夏草含有腺苷約7%，糖類28.9%，脂肪約8.4%，蛋白質(zhì)約25%。其中冬蟲夏草中82.2%為不飽和脂肪酸1。此外冬蟲夏草中主要成分為腺苷，在2000版中國藥典2和文獻報道3中均采用高效液相色譜法測定蟲草中腺苷的含量。在實際分析檢測中其兩種方法檢測時，峰形對稱性不佳，有一干擾峰且干擾嚴重，為了改善它對樣品提取條件進行改進，取得了較好的效果，對冬蟲夏草的質(zhì)量控制提供了一定的技術(shù)依據(jù)。分析實驗采用HPLC（高效液相色譜法）4，5分離技術(shù)，性能未定，能快速、準確測定其含量，樣品的預(yù)先處理方法簡單易行。1.1 儀器與藥品的選擇（1）Agilent1100高效液相色譜儀，配置在線脫氣機、高壓泵及梯度洗脫裝置、自動進樣器、C18(4.6mm250mm,5um)色譜柱、光電二極管陣列檢測器（DAD）、Agilent色譜工作站、JD500E超聲波清洗器，優(yōu)普超純水機。（2）腺苷標準品（上海永葉生物科技有限公司），水為UP水，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。（3）冬蟲夏草、冬蟲夏草含片在青海省格爾木市冬蟲夏草雪域?qū)Ｙu店購買。2. 分析測定前的準備2.1試驗樣品的預(yù)處理首先為了試驗結(jié)果具有代表性，選擇青海玉樹品質(zhì)優(yōu)良的冬蟲夏草。冬蟲夏草和含片通過研缽研成粉末，這樣有利于30%乙醇提純。在樣品預(yù)處理過程中應(yīng)該防止引入其他雜質(zhì)和腺苷含量的損失。2.2 試驗提取樣品溶劑的選擇 由于腺苷的含量較低，干擾成分多，曾采用藥典方法及文獻報道2,3的方法，用90%甲醇和15%甲醇提取，均分離不好，拖尾嚴重，后經(jīng)多次實驗，采用30%乙醇超聲提取后，蒸干，進行檢測，峰形的對稱性比較好，并消除了腺苷峰的拖尾現(xiàn)象及干擾峰，取得了較好的分離效果。2.3 HPLC檢測器波長的選擇取腺苷標準品溶液適量，調(diào)節(jié)波長在200400nm區(qū)間，在光電二極管陣列檢測器中測出吸收光譜圖，結(jié)果顯示在260nm處有最大吸收，因此選擇260nm為檢測波長。2.4 流動相的選擇利用藥典方法中流動相：磷酸鹽緩沖液（PH6.5）取0.01molL-1磷酸二氫鈉68.5ml與0.01molL-1磷酸二氫鈉31.5ml，攪拌均勻，調(diào)PH6.5甲醇（17：3）及0.05molL-1磷酸二氫鉀甲醇為流動相，經(jīng)過這兩種流動相的試驗，選擇0.05molL-1磷酸二氫鉀甲醇為流動相，以不同與比例進行反復(fù)試驗，確定比例為(90:10)時峰形及出峰時間適宜。3. 測定方法及測定結(jié)果3.1 分析溶液3.1.1 制備對照品的標準溶液準確稱取腺苷標準品0.0160g（經(jīng)五氧化二磷為干燥劑減壓24h），再加入30%的乙醇溶液溶解，加入50ml容量瓶中稀釋至刻度線，搖勻，作為標準品儲備液。3.1.2 樣品溶液的制備準確稱取冬蟲夏草含片和菌粉各2.0000g，分別準確加入30%的乙醇溶液10ml，密塞，稱定重量，超聲30min，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾。按同樣方法連續(xù)3次，將所得的濾液置于100ml容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，作為試驗溶液。3.2 HPLC色譜條件 色譜柱：C18,(4.6mm250 mm，5um)；流動相：0.05molL-1磷酸二氫鉀+甲醇（90+10）；檢測波長260nm；流速1.0mlmin-1；柱溫：35。3.3 HPLC的試驗過程及測定結(jié)果3.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性的試驗在上述色譜條件下，分別把試驗溶液、標準品溶液放入自動進樣器由計算機自動控制定量閥（進樣量為10ul），按預(yù)先編制注射樣品的操作程序工作。取樣、進樣、復(fù)位、樣品管路清洗和樣品盤的轉(zhuǎn)動，全部按預(yù)定程序自動進行。試驗色譜圖中，在與標準品色譜圖相應(yīng)保留時間上，有一相同的色譜峰。（色譜圖見圖1）11 (A) (B)圖1樣品（A）與標準品（B）HPLC色譜圖Fig 1.HPLC Chromatograms of reference sample (A) and substance (B) 1-腺苷（adenosine）3.3.2 繪制標準、線型曲線的范圍控制 準確稱取腺苷標準品，用甲醇稀釋并制成每1ml含20ug的溶液。分別進樣7次（0.25、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0）ul，按上述色譜條件測定，并以進樣量為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。得回歸方程：Y=8155.3X-6.5954，r=0,9998。腺苷在0.0050.2ug范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。3.3.3 儀器精密度的試驗準確吸取上述標準品溶液適宜，在上述色譜條件下，連續(xù)進樣5次，記錄腺苷面積，計算RSD（標準偏差）為1.35%。3.3.4 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號樣品5份，以供試品溶液制備及上述色譜條件，平行測定6次，測定腺苷的含量分別為0.07431、0.07534、0.07485、0.08127、0.07853（mgml-1）,平均含量為0.07686mgml-1,RSD為0.27%（n=5）。3.3.5 穩(wěn)定性試驗 取精密度試驗的標準品溶液，在室溫下放置12、48h后測定，記錄峰面積，兩次測定的RSD為1.03%，1.31%。此方法穩(wěn)定性較好。3.3.6 加樣回收率試驗稱取已知含量的同一批樣品3份，準確加入腺苷標準品適量，按樣品測定，并用甲醇稀釋一定含量，計算回收率。結(jié)果見表1.表1 加樣回收率試驗Table 1 sample recovery rate test批號 原含量（ug） 加入量（ug） 測定值（ug） 回收率（ug） 平均回收率（ug） RSD(%)1 6.4590 0.5090 7.0024 101.762 6.4380 0.7635 7.2524 107.47 99.49 9.33 6.4470 0.9753 7.5025 89.253.3.7 樣品測定取不同批號的樣品，按3.1.2項下的方法制成試驗溶液。在選定的色譜條件下，對冬蟲夏草菌粉及含片進行測定。計算腺苷的含量，測定結(jié)果見表2。表2 樣品含量測定結(jié)果Table 2 results of sample determination編號（No ） 含量（content）mg RSD(%) 菌粉1 0.15734 0.98 含片2 0.07618 1.05 4. 討論4.1 在與蟲草藥典和文獻中相比，此實驗在腺苷的提取方法上做了改進；由超聲波提取法法跟同流提取法比較得出，選擇超聲波提取法工作30min效果最好。其次對乙醇提取的濃度做出比較分析，結(jié)論是：30%的乙醇比95%乙醇提取的完全（結(jié)果可見表2）。最后得出實驗結(jié)論冬蟲夏草菌粉中腺苷的含量高于含片中腺苷的含量。4.2 進行檢測時用磷酸三鈉溶液溶解樣品，其流動相的濃度比例對蟲草腺苷的分離峰形有一定的影響，由多次實驗得出結(jié)論，0.05molL-1磷酸二氫鉀-甲醇在流動相中的濃度比例應(yīng)控制在（90:10）為佳。4.3 本方法簡單、穩(wěn)定，為冬蟲夏草及制劑的質(zhì)量控制提供了一種有效的分析方法。冬蟲夏草菌粉及含片中腺苷含量的測定參考文獻：1 Zhanglunli 張君莉（中國西藏網(wǎng)）2100.05.24-13:31:002CHP(中國藥典)，2000，Vol I(一部)：86.3QI Yan-fei(戚雁飛)，HPLC Determination of compound adenosine hedgehog Capsules（HPLC測定復(fù)方猴頭膠囊中腺苷的含量），Chinese medicine（中成藥），2002,24（3）：1814Wu Chun-mei(吳春敏)，Ye Rong-ping(葉榕平)，HPLC Determination of Adenosine in Cordyceps（HPLC法測定冬蟲夏草中腺苷的含量），Chinese herbal medicine（中草藥），1999,30,（9）：658.5Li Xue-qing(李雪芹)，Wang-yan(王閻)，Bao Tian-tong(包天桐)，Determination of Adenosine in Cordyceps funny RP liqu