生物技術藥物的免疫毒性和免疫原性.ppt

生物技術藥物的免疫毒性和免疫原性研究,Kaiyong LIU 華南農(nóng)業(yè)大學,生物技術藥物,生物技術藥物 包括體內(nèi)診斷、治療與預防用途； 來源于細菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細胞 蛋白質、多肽及其衍生物、核酸 如細胞因子、生長因子、融合蛋白、酶、激素、單抗、載體等 特殊性 結構、生產(chǎn)工藝、保存條件、同源性、作用靶點明確等固有的特點,免疫毒性/免疫原性,免疫毒性 是指受試品引起免疫抑制或增強、過敏反應或自身免疫反應，可能與藥理活性相關（如抗排斥藥物）或不相關（如部分抗腫瘤藥物）。 免疫原性 指藥物刺激機體形成特異性抗體或致敏淋巴細胞的性質。,研究意義,意義重大：如 免疫抑制，感染，腫瘤 免疫增強，放大自身免疫反應或過敏反應。 免疫原性，是藥物本身具有的性質，有免疫原性不一定導致毒性，但可以影響對藥物毒性、毒代或藥效的客觀評價。 但在規(guī)范及指導原則方面，缺乏共識，實驗方法也不統(tǒng)一,免疫毒性研究內(nèi)容一,常規(guī)的免疫毒性指標包括： 白細胞總數(shù)及其分類計數(shù) 球蛋白和白/球比值 補體水平 淋巴器官/組織的大體解剖 胸腺和脾臟的器官重量 免疫病理：胸腺、脾臟、引流淋巴組織,免疫毒性研究內(nèi)容二,額外的免疫毒性試驗（additional studies），如 (1) 常規(guī)免疫毒性檢測結果提示免疫毒性，感染 (2) 受試品的結構，與已知免疫調節(jié)劑相似 (3) 藥代動力學結果:原型藥或代謝產(chǎn)物在免疫組織 蓄積 (4) 適應癥:如用于抗HIV藥物 (5) 藥理作用：常對免疫系統(tǒng)有影響,常規(guī)的免疫毒性檢測結果 引流淋巴組織檢查,圖 猴經(jīng)口免疫HIV-BPV 假病毒后回腸粘膜下集合淋巴小結,：對照組，：高劑量組,常規(guī)的免疫毒性檢測 免疫抑制/增強,全血細胞變化、白細胞變化或淋巴細胞變化等。 免疫器官重量改變或組織學檢查顯示相關器官或組織細胞密度變化 血清免疫球蛋白變化 用藥組感染發(fā)生率升高 用藥組腫瘤發(fā)生率增多(除遺傳毒性、激素效應或肝酶誘導外),額外的免疫毒性試驗內(nèi)容,免疫功能檢測 如T細胞依賴的抗體反應、NK細胞活性、CTL活性、細胞因子表達、巨噬細胞/中性粒細胞功能、皮膚超敏反應、宿主抵抗力研究） 免疫表型檢測 依據(jù)免疫學理論和具體靶分子種類,額外的免疫毒性試驗方案,增設衛(wèi)星組、增加免疫學指標或改變給藥方案等。 發(fā)育免疫毒性：在成年動物中發(fā)現(xiàn)免疫抑制作用后，需要評價發(fā)育免疫毒性作用，如觀察母代暴露于藥物后仔代的淋巴系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、細胞因子等，兩種以上功能檢測等。不僅是免疫抑制！ 常規(guī)階梯或分層或標準試驗組合不一定合理，需個體化,額外的免疫毒性試驗方法,免疫功能檢測,額外的免疫毒性試驗方法,免疫功能檢測,注：GPMT與人一致性約70%，LLNA約72%,額外的免疫毒性試驗方法,免疫表型檢測 常用流式細胞儀檢測，檢測表達水平和比例,免疫功能檢測 分泌IFN細胞,圖 猴經(jīng)口免疫HIV-BPV 假病毒后外周血p24特異性的分泌IFN的淋巴細胞數(shù)量,免疫細胞表型檢測 CD22陽性比例,圖 食蟹猴靜脈注射SM03嵌合抗體后CD22標記陽性細胞率的變化,CD22陽性細胞比例（%）,免疫細胞表型檢測 CD4/CD8比例,CD4/CD8比例,圖 獼猴iv 4周 LHRHA-PE38后外周血CD4/CD8比例,免疫毒性試驗結果分析,統(tǒng)計學意義與生物學意義（尤其單一指標） 變化程度 與劑量/暴露關系 與擬用臨床劑量的關系 療程關系 涉及動物種屬數(shù)量和受影響的終點 可能繼發(fā)于其他因素 (e.g., stress,） 可能的細胞靶點和（或）作用機制 引起這些變化的劑量與產(chǎn)生其他毒性的劑量關系 可逆性,免疫毒性靶器官的分析線索,靶分子在免疫器官或組織的分布 受試品或其代謝產(chǎn)物的分布 相關指標的變化 常規(guī)免疫指標、細胞因子變化等。,免疫毒性機制推測,受體或藥靶直接引起的毒性反應（on-target) 如干擾素引起骨髓抑制 受體或藥靶介導的間接毒性反應 如rhIL-12能誘導干擾素的分泌 非特異機制 如rhTNK-tPA引起肝細胞劑量依賴性的脂肪變性。,免疫原性研究內(nèi)容,免疫原性(immunogenicity) 指誘導宿主產(chǎn)生免疫應答的能力，具有這種能力的物質稱為免疫原(immunogen）。產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞能力。 影響因素 分子大小，10 000，5 00010 000，1000 5000 分子結構，蛋白質多糖核酸類脂 宿主因素、免疫方式,免疫原性研究意義,免疫原性影響重復給藥毒性試驗結果的分析：中和藥物活性、改變藥物的清除、半衰期和組織分布 （neutralize drug activity and alter drug clearance, plasma half-life, and tissue distribution） 建立免疫分析方法，供臨床試驗應用,免疫原性研究內(nèi)容,抗體檢測方法學驗證 免疫反應檢測 抗體滴度、抗體的出現(xiàn)時間、出現(xiàn)抗體的動物數(shù)、劑量關系、抗體滴度的動態(tài)變化、抗體的中和活性、。 抗體與藥代/藥效和安全關系的評價 同期的藥效/藥代（毒代）/毒性反應的變化、補體激活與否、免疫復合物在肝腎的沉積、是否需要終止給藥、臨床意義分析等,抗體檢測方法,ELISA-橋法 包被藥物，用標記的藥物檢測。 ELISA-直接法 包被藥物，用標記抗體檢測。 （缺點：包被時可能會掩蓋或改變藥物的表位，僅檢測單一亞型，有種屬特異性，多次洗滌時丟失低親和力抗體，參考品與樣本之間試劑可能不同）,抗體檢測方法,間接法 包被單抗或生物素，再加藥物。 放射免疫沉淀法（RIP） 液相法，中等或高通量水平 表面等離子體共振 液相法，不需結合物（酶標記抗體），能檢測到不同親和力的抗體和各亞型抗體 電化學發(fā)光法 液相法，可檢測各種抗體亞型,抗體檢測方法考察,方法學考察 靈敏度：500-1000ng/ml，低滴度抗體檢出 受試物干擾：如有文獻報道，如血清中受試物濃度大于0.15g/ml，則難以檢測到抗受試物抗體。一般從1：10開始稀釋或對樣品進行處理。長效? 精確度：利用陽性對照品重復測量 陰性對照血清一般需從15只動物或50人中抽取,免疫復合物在肝腎的沉積,：溶劑對照組猴腎組織,：重組葡激酶大劑量組腎組織,圖 獼猴iv重組葡激酶周后腎組織的免疫組織化學染色,抗體檢測結果描述,抗體滴度結果表示 數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，取對數(shù)后達正態(tài)分布，需用幾何均數(shù)表示 抗體檢測結果 抗體的出現(xiàn)時間、出現(xiàn)抗體的動物數(shù)、劑量關系、抗體滴度的動態(tài)變化,抗體中和活性檢測,常用依賴細胞株 抗病毒致細胞病變（CPE） 克隆細胞株 靶基因檢測等。 游離或與抗體結合的受試品對中和活檢測的干擾（偶聯(lián)抗體的瓊脂糖凝膠珠吸附）,抗體中和活性的檢測 CPE法,圖 猴經(jīng)口免疫HIV-BPV 假病毒后血清對 HIV-1 HN 024的中和活性,抗體中和活性檢測方法 靶基因表達,抗體產(chǎn)生對藥效相關指標的影響,圖 注射表達EPO基因裸質粒8周后貧血大鼠HCT、EPO水平及中和活性的檢測,抗體產(chǎn)生對藥代的影響,臨床上連續(xù)應用重組水蛭素5以上可使74%的患者產(chǎn)生抗水蛭素抗體（AHAb）。,抗體產(chǎn)生對藥代的影響,0,4,8,13,17,21,0.01,0.1,1,10,TPO ( ng / mL）,-,),時間 (天 ),圖 猴皮下連續(xù)注射rhTPO 2 g.kg-1.d-120 d后血清rhTPO濃度(實測值和抗體滴度(, 血清稀釋倍數(shù)的倒數(shù)）,抗體產(chǎn)生對毒性反應的影響,圖 食蟹猴sc 2周和4周PEG-IFN后白細胞計數(shù)、抗體滴度和血清中和活性,*,*,*,*,*,*,*,*,中和抗體產(chǎn)生對給藥方案的意義,中和抗體影響了大多數(shù)動物的藥理和（或）毒性反應，則可以考慮終止給藥。 中和抗體水平，在體外能中和安全劑量達到的血藥濃度的作用時，可以考慮終止給藥。需結合藥動學資料。,總 結,生物技術藥物免疫毒性評價 重視，個體化原則，采用新方法 生物技術藥物免疫原性評價 強調規(guī)范，分析與毒性反應等關系,CD28激動劑TGN1412的期臨床試驗事件,德國公司研制的抗CD28超級激動劑TGN1412（人源化單抗）用于治療白血病等，在1期臨床試驗中，單次靜脈注射12-16h，6例均出現(xiàn)嚴重不良反應（多器官衰竭）。,CD28激動劑TGN1412的期臨床試驗事件,研究發(fā)現(xiàn)注射受試品后很快導致前炎癥因子釋放（細胞因子風暴），心肺功能衰竭。 猴長毒：CD4+ 和CD8+ T細胞一過性升高,血清IL-2、IL-5、IL-6中度升高，但沒有出現(xiàn)細胞因子釋放綜合征。,CD28激動劑TGN1412的期臨床試驗事件的教訓,期臨床試驗方案的教訓：僅10min間隔 免疫毒性的種屬差異及免疫毒性評價和分析的重要性（Toxicol in Vitr）。 猴并非一定是相關動物，動物記憶T細胞少。,主要參考文獻,EMEA. Guideline on Comparability of Medicinal Products Containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substance: Nonclinical and Clinical Issues ICH. preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals s6 ICH. immunotoxicity studies for human pharmaceuticals s8 FDA.Immunotoxicology Evaluation of Investigational New Drugs 呂秋軍等.