結(jié)球甘藍(lán)春化相關(guān)基因BoVIN的克隆及其表達(dá)分析

園 藝 學(xué) 報(bào) 2012， 39 （6） ： 10991106 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：收稿日期：20120312；修回日期：修回日期：20120506 基金項(xiàng)目：基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C201039） ；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（CXT002-2-2） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yxh100 ；jxm0917 ） 結(jié)球甘藍(lán)春化相關(guān)基因 BoVIN3 的克隆及其表 達(dá)分析 趙榮秋，胡 遠(yuǎn)，蔣欣梅*，于錫宏* （東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜生理與設(shè)施園藝研究室，哈爾濱 150030） 摘摘 要：要：根據(jù)已報(bào)道的擬南芥春化相關(guān)基因 VIN3 設(shè)計(jì)引物，通過 RT-PCR 方法首次從結(jié)球甘藍(lán)中克 隆得到兩條春化相關(guān)基因BoVIN3的cDNA ORF編碼區(qū)序列， 各1 680 bp， GenBank登錄號(hào)分別為JQ394927 和 JQ394928，可編碼由 560 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)；與擬南芥 VIN3 基因在核酸水平上同源性分別達(dá)到 85.55%和 79.95%；與擬南芥氨基酸序列同源性分別為 80.72%和 72.96%。半定量 RT-PCR 表達(dá)分析表明 BoVIN3 受春化作用的誘導(dǎo)，只在感應(yīng)低溫的莖尖生長點(diǎn)表達(dá)，在其它部位不表達(dá)，并且其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物隨春 化時(shí)間延長逐漸積累，在春化 42 d 時(shí)達(dá)到峰值；而在不同濃度 GA3和 KT 誘導(dǎo)下不表達(dá)；FLC 受春化作 用的抑制，并且 BoVIN3 受誘導(dǎo)表達(dá)后才能使 FLC 的表達(dá)受到抑制，暗示在結(jié)球甘藍(lán)中 BoVIN3 可能參與 春化調(diào)控開花的生物學(xué)過程，屬于春化特異基因，只響應(yīng)低溫誘導(dǎo)而轉(zhuǎn)錄。 關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：結(jié)球甘藍(lán)；VIN3；春化作用；基因表達(dá) 中圖分類號(hào)：中圖分類號(hào)：S 635.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：文章編號(hào)：0513-353X（2012）06-1099-08 Cloning and Expression Analysis of BoVIN3 from Cabbage ZHAO Rong-qiu，HU Yuan，JIANG Xin-mei*，and YU Xi-hong* （Vegetable Physiology and Installation Horticulture Laboratory，College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China） Abstract：The mid harvest season cabbage varietyGuangrong 1was used in this experiment. Fourteen leaves cabbage plants were vernalized in the incubator at 8 . Two vernalization-related genes were isolated by RT-PCR. Sequencing analysis results showed that their ORF were both 1 680 bp in length，which encoded 560 amino acids，and GenBank accession number are JQ394927 and JQ394928 respectively. Their nucleotide sequences shared 85.55% and 79.95% identity with AtVIN3 respectively， and the deduced amino acid sequence showed homology to AtVIN3 with 80.72% and 72.96%. The expression patterns of the BoVIN3 genes were investigated by semi-quantity RT-PCR，results showed that BoVIN3 gene could express induced by low temperature treatment，and expressed in the stem apex specifically， transcript levels increased with increasing treatment time. The transcription reach the peak at 42 d of vernalization. At the same time the expression of FLC was suppressed after BoVIN3 was induced by low temperature treatment，results suggest that both genes maybe involved in the biological process of flowering 1100 園 藝 學(xué) 報(bào) 39 卷 regulation in vernalization. However both BoVIN3 could not be induced by GA3 and KT treatment. It indicated that cabbage BoVIN3 was specific vernalization genes，whose transcripts could specially response to vernalization. Key words：cabbage；VIN3；vernalization；gene expression 開花是高等植物實(shí)現(xiàn)由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的重要過程，在擬南芥開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中， MADS-box 類的轉(zhuǎn)錄因子 FLOWERING LOCUS C（FLC）處于樞紐地位，是開花調(diào)控環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵 基因（Michaels & Amasino，1999） 。FLC 分別通過結(jié)合到 SOC1 啟動(dòng)子的 CArG 盒上和 FT 第一個(gè) 內(nèi)含子部分區(qū)域（包含 CArG 盒結(jié)構(gòu)）上來抑制它們的表達(dá)（Hepworth et al.，2002；Helliwell et al.， 2006） ，從而抑制花分生組織決定基因，進(jìn)而延遲植物成花。長時(shí)間低溫處理促進(jìn)植物開花的過程稱 為春化作用，春化作用主要是引起開花抑制基因 FLC 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，以解除其對(duì)植物開花的抑 制效應(yīng) （Bastow et al.， 2004） 。 研究表明， 春化作用可以誘導(dǎo) VERNALIZATION INSENSITIVE 3 （VIN3） 的表達(dá)，VIN3 與 VERNALIZATION 1（VRN1）和 VERNALIZATION 2（VRN2）一起形成復(fù)合體作用 于 FLC 染色質(zhì)上的組蛋白，使其去乙?；图谆?，從而抑制 FLC 的表達(dá)（Bastow et al.，2004； Sung & Amasino，2004；Kim et al.，2006） 。 VIN3 編碼一個(gè) PHD-finger 蛋白，可以參與核小體組蛋白的甲基化去乙?；刃揎?，引起染色 質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑。VIN3 被誘導(dǎo)后，F(xiàn)LC 染色質(zhì)組蛋白上的 H3K9 和 H3K27 發(fā)生二甲基化和三甲基化， 植株表現(xiàn)為早花（Bastow et al.，2004；Sung & Amasino，2004；Kim et al.，2006；Wang et al.，2007； Schmitz & Amasino，2008） 。在 vin3 突變體與野生型植株的研究中，野生型植株在 VIN3 表達(dá)后， FLC 染色質(zhì)組蛋白 H3K9、H3K14 發(fā)生了去乙?；蛔凅w中沒有這一現(xiàn)象，所以認(rèn)為 VIN3 也 是 FLC 染色質(zhì)組蛋白 H3K9、H3K14 的去乙酰化所必需的（趙仲華 等，2006） 。 Fu 等（2007）從小麥中克隆得到了 VIN3 的 3 個(gè)同源基因：TmVIL1、TmVIL2 和 TmVIL3，水稻 Oryza sativa 中也獲得了 4 個(gè) VEL 家族的基因：OsVIL1、OsVIL2、OsVIL3 和 OsVIL4，它們編碼的 蛋白均具有 PHD 結(jié)構(gòu)域保守的 C4HC3 的基序特性。擬南芥和禾本科植物中的 VIN3/VEL 家族蛋白 都具有保守的 PHD 結(jié)構(gòu)域， 這對(duì)認(rèn)識(shí) PHD-finger 蛋白功能及其在春化途徑中的作用是至關(guān)重要的。 根據(jù)擬南芥及其蕓薹屬相關(guān)領(lǐng)域的研究報(bào)道， 本試驗(yàn)中重點(diǎn)針對(duì)開花網(wǎng)絡(luò)核心基因 FLC 及其春 化作用途徑上游的關(guān)鍵基因 VIN3 進(jìn)行研究，首次從十字花科蕓薹屬作物結(jié)球甘藍(lán)中克隆了春化相 關(guān)基因 VIN3，通過生物軟件對(duì) VIN3 基因進(jìn)行了序列分析，并通過 RT-PCR 方法檢測(cè)在結(jié)球甘藍(lán)中 的表達(dá)情況及其與春化作用的關(guān)系，為研究結(jié)球甘藍(lán)綠體春化的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 材料 以結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea L. var. capitata L.）中熟品種光榮 1 號(hào)為試驗(yàn)材料，于日光 溫室播種育苗，幼苗長至 1 2 片真葉時(shí)分苗于 8 cm 8 cm 營養(yǎng)缽中，苗期常規(guī)管理。根據(jù)前期進(jìn) 行的結(jié)球甘藍(lán)不同苗齡對(duì)低溫感應(yīng)試驗(yàn)的結(jié)果，在 13 片真葉莖粗小于（12.83 0.14）mm 時(shí)植株不 能感受低溫春化，所以選取 14 片真葉，莖粗大于（13.73 0.17）mm 的大小均勻一致的幼苗放入光 照培養(yǎng)箱中進(jìn)行綠體春化處理。 低溫春化處理?xiàng)l件為日均 8 （晝 10 / 夜 6 ） ， 光照時(shí)間為 12 h， 光強(qiáng) 72 mol m-2 s-1。春化處理過程中每 4 d 取莖尖及靠近莖尖的嫩葉 0.1 g，立即用液氮冰凍，然 后轉(zhuǎn)移至80 冰箱中保存?zhèn)溆谩?6 期 趙榮秋等：結(jié)球甘藍(lán)春化相關(guān)基因 BoVIN3 的克隆及其表達(dá)分析 1101 1.2 RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄 參照劉生財(cái)（2009）的方法提取結(jié)球甘藍(lán)莖尖總 RNA。以總 RNA 為模板，Oligo(dT)18為引物， 按照 RevertaidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit dNTP（10 mmol L-1）試劑盒（MBI 公司） 說明利用 M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得 cDNA 第一鏈。 1.3 結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 的 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序 根據(jù)擬南芥 VIN3 基因的 mRNA 序列（NM-125121.3）的 ORF 編碼區(qū)，采用 Primer 5.0 軟件設(shè) 計(jì)引物。 正向引物為： 5-ATGCAAGCTGCTTCGCTCTCAAAGATCT-3， 反向引物為： 5-TTAATGCCA AAGCTTGAGGCAGAT-3，委托上海生工合成。PCR 分離結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 的 ORF 編碼區(qū)序列。 反應(yīng)體系為：4 L 模板，5 L 10 PCR Buffer，1 L 10 mmol L-1的 dNTP，正反向引物各 1 L，1 L Kod plus 酶， 加水至 50 L。 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94 預(yù)變性 5 min； 94 變性 30 s， 55 退火 30 s， 68 延伸 2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 10 min；4 10 min。PCR 擴(kuò)增（1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)） ，目 的片段回收后連接在 pMD18T-Vector 上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆委托上海 生工測(cè)序。 序列分析采用DNAMAN等工具軟件和NCBI上的BLAST （http： / blast. ncbi. nlm. nih. gov/ Blast. cgi）進(jìn)行。 1.4 半定量 RT-PCR 檢測(cè)低溫處理及不同激素處理下 BoVIN3 的表達(dá) 應(yīng)用 RT-PCR 技術(shù)對(duì)結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 基因的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。 低溫處理過程中每 4 d 取莖 尖及靠近莖尖的嫩葉、第 8 9 節(jié)位的真葉、及此節(jié)位的莖桿用于 RNA 提取。激素處理時(shí)選取 14 片真葉的幼苗常溫條件下葉面噴施處理至葉片充分淋濕為止，為使溶液充分接觸葉片，在溶液中加 入 1 2 滴吐溫 20 。每 3 d 處理 1 次，共 3 次。具體處理方法如下：用 50、100 mg L-1的赤霉素 （GA3）和 20、80 mg L-1的激動(dòng)素（KT）噴施處理。于處理當(dāng)天和以后每 6 d 取莖尖及靠近莖尖 的嫩葉用于 RNA 提取。反轉(zhuǎn)錄，獲得 cDNA 第一鏈（同 1.2） ，以其為模板，使用結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 基因的特異引物進(jìn)行半定量 RT-PCR 反應(yīng)， 引物為 BoVIN3-1F： 5-CCACGCATTGTCTAACCAGC-3， BoVIN3-1R： 5-GCACACTCCAAATGACAAGAC-3， BoVIN3-2F： 5-GAGTGTAAGTGAGAGGAGGG- 3，BoVIN3-2R：5-TTACGGTCAGGACGAGAGGT-3；以結(jié)球甘藍(lán) Actin 基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因，ActinF： 5-CTGGTTTCGCCGGTGATGATGC-3， ActinR： 5-ATTTCCCGCTCGGCTGTGGTG-3； 反應(yīng)體系為： 0.5 1 L 模板、 2.5 L 10 PCR Buffer、 1.5 L 25 mmol L-1的 Mgl2、 2.5 L 2 mmol L-1的 dNTP、 正反向引物各 1 L、0.1 L rTaq 酶，加水至 25 L。 1.5 半定量 RT-PCR 檢測(cè)低溫處理下 FLC 的表達(dá) 應(yīng)用 RT-PCR 技術(shù)對(duì)結(jié)球甘藍(lán) FLC 基因的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。以 1.4 中結(jié)球甘藍(lán)低溫春化處 理取樣后所提 RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得的相同的 cDNA 為模板，使用結(jié)甘藍(lán) FLC 基因的特異引物進(jìn)行半定 量 RT-PCR 反應(yīng)， 反應(yīng)體系和內(nèi)標(biāo)基因同 1.4。 引物為 FLCF： 5-CGACAAGTCACCTTCTCCAAAC-3； FLCR：5-CGGAAGATTGTCGGAGATTTGT-3。 2 結(jié)果與分析 2.1 結(jié)球甘藍(lán)春化基因 BoVIN3 的克隆 根據(jù) GenBank 上公布的擬南芥 VIN3 基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以低溫春化處理 36 d 的結(jié)球甘 藍(lán)莖尖總 RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA 第一鏈進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增出相應(yīng)的基因片段。擴(kuò)增產(chǎn) 1102 園 藝 學(xué) 報(bào) 39 卷 物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 得到預(yù)期大小 的長為 1 700 bp 左右的目的條帶（圖 1） 。 回收產(chǎn)物，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化、測(cè)序，結(jié)果表明 從蕓薹屬植物結(jié)球甘藍(lán)中克隆了兩條 BoVIN3 基因，編碼區(qū)全長各 1 680 bp，GenBank 登錄 號(hào)分別為 JQ394927 和 JQ394928。 兩條基因核酸序列比對(duì)相似性達(dá) 87.58%， 氨基酸序列比對(duì)相似性達(dá) 82.70%， 命名為結(jié)球 甘藍(lán) BoVIN3-1 和 BoVIN3-2。 2.2 結(jié)球甘藍(lán)春化基因 BoVIN3 的序列分析 在 NCBI 上 BLAST 表明，所克隆的基因 與擬南芥或蕓薹屬植物的春化相關(guān)基因 VIN3 具有較高的同源性。BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 與擬南芥 AtVIN3（accession number：NM_125121.3）在核酸水平上同源性分別達(dá)到 85.55%和 79.95%。其推 測(cè)的氨基酸序列與擬南芥 VIN3（Q9FIE3）的同源性分別達(dá)到 80.72%和 72.96%（圖 2）；與蕓薹屬 紅菜薹 VIN3（C4PFF9）分別達(dá)到 83.5%和 96.73%；與蔓田芥 VIN3（D6RRE9）分別達(dá)到 85.96%和 圖圖 2 不同植物不同植物 VIN3 氨基酸序列同源性比較氨基酸序列同源性比較 ：結(jié)球甘藍(lán) VIN3-1（JQ394927） ；：結(jié)球甘藍(lán) VIN3-2（JQ394928） ；：擬南芥（Q9FIE3） ；：紅菜薹（C4PFF9） 。 Fig. 2 Homology comparison of BoVIN3 cDNA in different plants ：Brassica oleracea var. capitata VIN3-1（JQ394927） ；：Brassica oleracea var. capitata VIN3-2（JQ394928） ； ：Arabidopsis thaliana（Q9FIE3） ；：Brassica rapa var. purpuraria（C4PFF9）. 圖圖 1 結(jié)球甘藍(lán)結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 基因的基因的 RT-PCR 產(chǎn)物電泳圖產(chǎn)物電泳圖 M：DNA marker 5 000；1、2：目的基因。 Fig. 1 Electrophoresis of RT-PCR products of BoVIN3 in cabbage M：DNA marker 5 000；1，2：Target genes. 6 期 趙榮秋等：結(jié)球甘藍(lán)春化相關(guān)基因 BoVIN3 的克隆及其表達(dá)分析 1103 89.38%。結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 與其它植物 VIN3 類蛋白部分氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明，BoVIN3-1 與擬南芥 VIN3 具有最高的同源性，BoVIN3-2 與蕓薹屬植物紅菜薹具有最高的同源性（圖 3） ，與其 他的 VIN3 類蛋白同源性相對(duì)偏低（30% 40%） 。與擬南芥和小麥中 VIN3 類蛋白序列比較表明，本 試驗(yàn)中克隆的兩條基因其氨基酸序列中包括 VIN3 的 PHD 區(qū)域（圖 4） 。 圖圖 3 結(jié)球甘藍(lán)結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 與其它植物與其它植物 VIN3 類蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系類蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 Bo：結(jié)球甘藍(lán)；Br：紅菜薹；At：擬南芥；Ag：蔓田芥；PtPOP：毛果楊；Tm：小麥。 Fig. 3 Phyolgenetic relationships between Brassica oleracea var. capitata L. BoVIN3 and other VIN3 or VIN3-like proteins Bo：Brassica oleracea var. capitata；Br：Brassica rapa var. purpuraria；At：Arabidopsis thaliana； Ag：Arabis gemmifera；PtPOP：Populus trichocarpa；Tm：Triticum monococcum ssp. monococcum. 圖圖 4 不同植物不同植物 VIN3 類蛋白類蛋白 PHD 結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì) Fig. 4 Alignment of PHD-finger domain among different plants VIN3 proteins 2.3 結(jié)球甘藍(lán)春化基因 BoVIN3 表達(dá)模式分析 通過半定量 RT-PCR 檢測(cè)了 BoVIN3 在結(jié)球甘藍(lán)各組織的表達(dá)及其與春化作用的關(guān)系，結(jié)果表 明，春化誘導(dǎo)結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 基因表達(dá)。如圖 5 所示，BoVIN3-1，BoVIN3-2 只在有絲分裂活性區(qū) 域莖尖生長點(diǎn)中表達(dá)，而在真葉和莖中均不表達(dá)；當(dāng)春化處理 32 d 時(shí)，BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 幾乎沒有表達(dá)，從 36 d 才開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄，到 42 d 春化臨界期時(shí)表達(dá)已經(jīng)達(dá)到比較高的豐度，隨后 1104 園 藝 學(xué) 報(bào) 39 卷 開始下降，BoVIN3-1，BoVIN3-2 具有相同的表達(dá)模式。用 50、100 mg L-1的赤霉素（GA3）和 20、 80 mg L-1的激動(dòng)素（KT）噴施處理后，BoVIN3-1，BoVIN3-2 基因均不表達(dá)（圖 6） 。 圖圖 5 低溫處理下結(jié)球甘藍(lán)低溫處理下結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 基因在莖尖生長點(diǎn)（基因在莖尖生長點(diǎn)（A） 、真葉（） 、真葉（B） 、和莖（） 、和莖（C）中的表達(dá)）中的表達(dá) Fig. 5 Expression of Bo VIN3 in cabbage stem tip（A） ，） ，leaf（B）and stem（C）under low temperature treatment 圖圖 6 GA3處理（左）和處理（左）和 KT 處理（右）下結(jié)球甘藍(lán)處理（右）下結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 基因在莖尖生長點(diǎn)中的表達(dá)基因在莖尖生長點(diǎn)中的表達(dá) Fig. 6 Expression of BoVIN3 in cabbage stem tip under GA3（left）and KT（right）treatment a：50 mg L-1 GA3；b：100 mg L-1 GA3；c：20 mg L-1 KT；d：80 mg L-1 KT. 2.4 低溫春化過程中結(jié)球甘藍(lán) FLC 基因的表達(dá)分析 研究結(jié)球甘藍(lán)低溫春化處理過程中 FLC 基因的表達(dá)模式，RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示其表達(dá)受春化 作用的抑制（圖 7） ，春化過程中 FLC 基因持續(xù)表達(dá)，當(dāng)?shù)蜏靥幚?36 d 時(shí)表達(dá)量有所下降，隨春化 處理時(shí)間延長表達(dá)量逐漸減少并在春化臨界期時(shí)幾乎檢測(cè)不到。 VIN3 受誘導(dǎo)表達(dá)后， FLC 的表達(dá)受 到抑制，且 VIN3 基因的表達(dá)水平與低溫時(shí)間的長度和 FLC 的抑制程度成正比。說明植物在生長發(fā) 6 期 趙榮秋等：結(jié)球甘藍(lán)春化相關(guān)基因 BoVIN3 的克隆及其表達(dá)分析 1105 育過程中確保 FLC 的高表達(dá)來避免植物在還未完全積累物質(zhì)能量時(shí)過早開花。 圖圖 7 低溫處理下結(jié)球甘藍(lán)低溫處理下結(jié)球甘藍(lán) FLC 基因的表達(dá)基因的表達(dá) Fig. 7 Expression of cabbage FLC under low temperature treatment 3 討論 結(jié)球甘藍(lán)屬于綠體春化型植物，幼苗需長到一定大小方能感應(yīng)低溫通過春化，我們根據(jù)已報(bào)道 的種子春化型植物擬南芥春化相關(guān)基因 VIN3 設(shè)計(jì)引物， 通過 RT-PCR 方法首次從結(jié)球甘藍(lán)中克隆了 VIN3 春化相關(guān)基因，并對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行初步研究。 序列分析表明，本試驗(yàn)中克隆的春化相關(guān)基因 BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 與擬南芥或其它蕓薹屬植 物中相應(yīng)基因具有很高的同源性。BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 與 AtVIN3 屬于同一基因，BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 包括 PHD 關(guān)鍵區(qū)域。PHD 鋅指結(jié)構(gòu)域是 14 種已知的鋅指結(jié)構(gòu)域中的一種，存在于 400 多種真核生物蛋白質(zhì)中，在進(jìn)化過程中高度保守（Kaadige & Ayer，2006） 。擬南芥和小麥 VIN3/VIL 類蛋白都含有 PHD 鋅指蛋白 C4HC3（Cys4-His-Cys3）的鋅結(jié)合基序（Fu et al.，2007） 。此結(jié)構(gòu)域 涉及多種功能，包括蛋白質(zhì)的甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，BoVIN3 很有可能通過此區(qū)域作 用于 FLC。 本研究中發(fā)現(xiàn)，長時(shí)間 （大于 36 d） 的低溫春化處理會(huì)誘導(dǎo)結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 的表達(dá)，并使 FLC 表達(dá)量降低，到達(dá)春化臨界期 42 d 時(shí) BoVIN3 的表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后下降。在模式植物擬南芥中 很早以前就有過這種現(xiàn)象的相關(guān)報(bào)道（Sung & Amasino，2004） ，經(jīng)過春化處理后，F(xiàn)LC 染色質(zhì)組蛋 白 H3K9、 H3K27 的二甲基化和三甲基化水平升高， 植株表現(xiàn)為早花。 該過程依賴于關(guān)鍵基因 VIN3， VIN3 具有感受低溫時(shí)程的特性。 冬性一年生擬南芥只有經(jīng)過足以產(chǎn)生春化效應(yīng)的一段時(shí)期的低溫處 理后，VIN3 才會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，一般時(shí)間為 20 d（Sung & Amasino，2004） 。如處理時(shí)間不夠，VIN3 不會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，也就不會(huì)產(chǎn)生下游的春化效應(yīng)。當(dāng) VIN3 被誘導(dǎo)表達(dá)后，F(xiàn)LC 的表達(dá)隨即被抑制， 因而 VIN3 的作用是在春化過程中識(shí)別低溫處理的時(shí)間進(jìn)而抑制對(duì)春化關(guān)鍵基因 FLC 的表達(dá)（趙仲 華 等，2006） 。 春化作用是一個(gè)低溫誘導(dǎo)體內(nèi)特異基因表達(dá)的過程，RT-PCR 半定量分析表明，結(jié)球甘藍(lán)中春 化相關(guān)基因 BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 與擬南芥和其它蕓薹屬植物中的 VIN3 基因具有類似的表達(dá)模式 （李勇，2009） 。BoVIN3 在沒有春化處理之前沒有表達(dá)，春化處理之后具有較高水平的表達(dá)，這說 明 BoVIN3 在低溫冷處理?xiàng)l件才能被誘導(dǎo)。BoVIN3 編碼含有 PHD 結(jié)構(gòu)域的蛋白，該區(qū)域可以參與 FLC 染色質(zhì)上組蛋白的甲基化和去乙?；揎棧?從而調(diào)控 FLC 的轉(zhuǎn)錄水平， 使其表達(dá)處于較低狀態(tài) （Sung & Amasino，2004） 。FLC 是 MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)LC 是開花抑制基因，春化處理之后， 由于 FLC 被抑制，最終促進(jìn)植物提前開花，而 FLC 對(duì)開花的抑制效應(yīng)與其表達(dá)量的多少呈正相關(guān) （Scortecci et al.，2003） ，低溫處理之后，F(xiàn)LC 因?yàn)?VIN3 的誘導(dǎo)而被低溫抑制，其表達(dá)量進(jìn)一步降 低，且隨低溫處理時(shí)間的增加其表達(dá)量逐漸降低，直至最后檢測(cè)不到，最終進(jìn)一步促進(jìn)甘藍(lán)春化啟 動(dòng)。以上結(jié)果表明，在結(jié)球甘藍(lán)中存在春化誘導(dǎo)基因 BoVIN3，參與對(duì) FLC 的后生性抑制，并且使 1106 園 藝 學(xué) 報(bào) 39 卷 得這種抑制通過細(xì)胞有絲分裂得以維持（Sung & Amasino，2005；Sung et al.，2006） 。 不同濃度 GA3和 KT 處理下該基因均檢測(cè)不到任何轉(zhuǎn)錄本，說明結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 基因的啟動(dòng) 子可能不包含激素響應(yīng)元件，不受激素的誘導(dǎo)表達(dá)。GA3是通過激活開花決定基因 LFY 的啟動(dòng)子， 加強(qiáng) LFY 的轉(zhuǎn)錄活性，從而啟動(dòng)開花（Miguel et al.，1998）。很多基因只有在特定的器官、發(fā)育特 定時(shí)期或受特定環(huán)境因子的誘導(dǎo)時(shí)才表達(dá)，在長時(shí)間的低溫條件下，結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 基因才能在 有絲分裂活性區(qū)域莖尖生長點(diǎn)被誘導(dǎo)表達(dá)，說明結(jié)球甘藍(lán) BoVIN3 屬于春化特異基因，只響應(yīng) 低溫誘導(dǎo)而轉(zhuǎn)錄。 References Bastow R，Mylne J S，Lister C. 2004. 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