職業(yè)教育論文-教學(xué)實驗室醫(yī)學(xué)真菌的保藏.doc

職業(yè)教育論文-教學(xué)實驗室醫(yī)學(xué)真菌的保藏【關(guān)鍵詞】真菌保藏實驗室微生物學(xué)醫(yī)學(xué)真菌作為自然界重要的生物資源，已成為微生物學(xué)實驗中不可或缺的基本材料，應(yīng)用頻率較高。這其中部分為病原性真菌，而如何有效地保存保管好真菌菌種，以何種方式長期穩(wěn)定地保持其生物遺傳特性，則成為我們?nèi)粘９ぷ髦行枰芯刻接懙膯栴}。1材料與方法1.1教學(xué)實驗室保存的菌種(1)單細胞真菌：白色念珠菌、新生隱球菌。(2)多細胞真菌：黑曲霉菌、青霉菌、木霉菌。1.2醫(yī)學(xué)真菌菌種的鑒定菌種使用前，均需進行形態(tài)學(xué)、生化學(xué)方面的鑒定，合格后方可使用。具體鑒定方法：(1)單細胞真菌：碳源發(fā)酵試驗、產(chǎn)子囊孢子及芽管試驗、咖啡酸試驗、尿素酶試驗；單細胞與多細胞真菌鑒定共用實驗：玉米粉吐溫80瓊脂小培養(yǎng)顯微鏡下觀察。(2)多細胞真菌：蛋白水解試驗、37生長試驗、溫度試驗、PDA小培養(yǎng)實驗。1.3真菌菌種的保藏方法由于教學(xué)實驗各時期使用的真菌菌種在數(shù)量及種類上不盡相同，所以與其相適應(yīng)的培養(yǎng)方法與保管方式亦不相同。大體上分為定期傳代保存法、超低溫凍結(jié)保存法兩種。1.3.1定期傳代保存法(1)液體培養(yǎng)基保存法：單細胞真菌接種于RPMI1640培養(yǎng)基中,37培養(yǎng)24h，取出后置4冰箱保存。該方法用于學(xué)期初低溫凍結(jié)菌種的復(fù)蘇、增菌培養(yǎng)。(2)瓊脂平板培養(yǎng)基保存法：學(xué)期開始，多細胞凍結(jié)菌種解凍后，劃線接種于察氏平板培養(yǎng)基上面，28培養(yǎng)78d，再將培養(yǎng)菌絡(luò)移種于改良馬丁平板培養(yǎng)基上，28培養(yǎng)7d，待培養(yǎng)菌絡(luò)生長良好,置4冰箱保存。為多細胞真菌的復(fù)蘇與鑒定試驗。(3)瓊脂斜面培養(yǎng)基保存法：單細胞真菌由液體培養(yǎng)基中多細胞真菌從馬丁培養(yǎng)基表面，分別挑取菌種菌絡(luò)，蜿蜒化線接種于各自相對應(yīng)的瓊脂斜面培養(yǎng)基中,經(jīng)37或28培養(yǎng)生長良好后，置4冰箱保存?zhèn)溆?。該方法用于學(xué)期中，真菌菌種即將使用，實驗課前的菌種純化和制備階段。(4)液體石蠟覆蓋保存法：將無菌液體石蠟油覆蓋于菌絡(luò)生長良好的瓊脂斜面真菌培養(yǎng)物表面，厚度約1cm左右，置4冰箱保存。該法用于學(xué)期末對真菌菌種較長時期的保存方法。1.3.2液氮超低溫凍結(jié)保存法將單細胞或多細胞真菌培養(yǎng)物,以無菌生理鹽水洗下并計數(shù)，加入等量脫脂牛奶保護劑，分裝進安瓿后封口。選擇菌種不同的適宜冷卻速度，使瓿內(nèi)菌懸液急速或慢速凍結(jié)成冰。置液氮超低溫下保存。2結(jié)果2.1定期傳代保存法(1)液體培養(yǎng)基保存法，可保存單細胞真菌15d左右。(2)瓊脂平板培養(yǎng)基保存法，保存多細胞真菌15d。(3)瓊脂斜面培養(yǎng)基保存法，保存單細胞、多細胞真菌1個月。(4)液體石蠟覆蓋保存法，可保存真菌菌種6個月。2.2液氮超低溫凍結(jié)保存法可保存凍結(jié)菌種1年。3小結(jié)一般認為，傳代移種保存法保存的菌種，易失去病原性，而超低溫保存法能夠完整的保存菌種的致病性。為此，我們針對實驗的初、中、末3個時期，實驗顯示，反復(fù)的移種傳代會使菌種的致病力和生理活性下降，孢子形成能力減弱，故超低溫凍結(jié)保存菌種，是最佳保藏菌種的方法，唯一不足的是菌種復(fù)蘇啟動時間較長?！緟⒖嘉墨I】1王家俊.臨床真菌檢驗M.上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1995:312.2張卓然.醫(yī)學(xué)微生物實驗學(xué)M.