GB15193.20-2003TK基因突變試驗.pdf

I CS 0 7 . 1 0 0C 5 3中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準GB 1 5 1 9 3 . 2 0 - 2 0 0 3T K基因突變試驗T K g e n e mu t a t i o n t e s t2 0 0 3 - 0 9 - 2 4發(fā)布2 0 0 4 - 0 5 - 0 1 實施華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部國 國 家 標 準 化 管 理 委 員 會發(fā) 布中中免費標準網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 標準最全面免費標準網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 無需注冊 即可下載GB 1 51 9 3 . 2 0 - 2 0 0 3前言 本標準全文強制。 本標準參考美國F D A營養(yǎng)素補充劑與食品安全中心食品添加劑安全辦公室發(fā)布的“ 食品成分安全評價毒理學原則2 0 0 0 年版紅皮書( 2 0 0 1 年9 月發(fā)布) : I V . C. Lc .小鼠淋巴瘤胸腺嗜吮激酶基因突變試驗( I V . C. 1 . c . Mo u s e L y m p h o m a T h y m i d i n e K i n a s e G e n e Mu t a t i o n A s s a y ) . 本標準由中華人民 共和國衛(wèi)生部提出并歸口。 本標準起草單位: 四川大學華西公共衛(wèi)生學院、 中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所。 本標準主要起草人: 張立實、 張建清、 帥培強、 王怡凈。 本標準首次發(fā)布。免費標準網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 標準最全面免費標準網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 無需注冊 即可下載GB 1 51 9 3 . 2 0 - 2 0 0 3T K基因突變試驗范 圍 本標準規(guī)定了體外哺乳類細胞T K位點基因突變試驗的基本技術(shù)要求與方法 本標準適用于評價食品生產(chǎn)、 加工、 保藏、 運輸和銷售過程中所涉及的可能對健康造成危害的化學、生物和物理因素的遺傳毒性， 檢驗對象包括食品添加劑( 含營養(yǎng)強化劑) 、 食品新資源及其成分、 新資源食品、 輻照食品、 食品容器與包裝材料、 食品工具、 設(shè)備、 洗滌劑、 消毒劑、 農(nóng)藥殘留、 獸藥殘留、 食品工業(yè)用微生物等。2原理 T K基因突變試驗的檢測終點是胸昔激酶( t h y m i d i n e k i n a s e , T K ) 基因的突變。在人類， T K基因定位于 1 7 號染色體長臂遠端; 在小鼠則定位于 1 1 號染色體。故 T K基因的突變屬于常染色體基因突變。 T K基因的產(chǎn)物胸昔激酶在體內(nèi)催化從脫氧胸昔( T d R ) 生成胸昔酸( T MP ) 的反應(yīng)。在正常情況下， 此反應(yīng)并非生命所必需， 原因是體內(nèi)的T MP主要來自于脫氧尿嚓吮核昔酸( d UMP ) ， 即由胸昔酸合成酶催化的d U MP甲基化反應(yīng)生成T MP 。但如在細胞培養(yǎng)物中加人胸昔類似物( 如三氟胸昔， 即T F T 一 一 t r i f l u o r o t h y m i d i n e ) ， 則T F T在胸普激酶的催化下可生成三氟胸昔酸， 進而摻人D N A , 造成致死性突變， 故細胞不能存活。若 T K基因發(fā)生突變， 導致胸昔激酶缺陷， 則 T F T不能磷酸化， 亦不能摻人D N A ， 故細胞在含有T F T的培養(yǎng)基中能夠生長， 即表現(xiàn)出對T F T的抗性。 根據(jù)突變集落形成數(shù)， 計算突變頻率 ， 以判定受試物的致突變性3 試劑與材料3 . 1 細胞: L 5 1 7 8 Y t k - 3 . 7 . 2 C小鼠淋巴瘤細胞。為清除自 發(fā)突變的t k - / 一 基因型細胞， 在正式實驗前， 應(yīng)使用含3 p g / m I 胸昔, 5 p g / m l 一 次黃嗦吟, 0 . 1 p g / m L氨甲碟吟和7 . 5 p g / m L甘氨酸的T H MG培養(yǎng)基中處理 2 4 h , 離心、 洗滌后在不含氨甲碟嶺的T H MG培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 天。3 . 2 試劑: P B S 磷酸鹽緩沖液， 三氟胸昔( t r i f l u o r o t h y r n i d i n e ) ， 次黃嗓吟( h y p o x a n t h i n e ) ， 甘氨酸( g l y -c i n e ) , 氨甲碟吟( m e t h o t r e x a t e ) ， 胸腺嗜吮核昔( t h y m i d i n e ) ， 陽性對照物( MMS , MMC ， 環(huán)磷酞胺等)4 試驗設(shè)計 一般應(yīng)進行細 胞毒 性預(yù) 試驗， 根據(jù)預(yù)試 驗結(jié)果， 在相對 存活率( r e la t i v e s u r v i v a l , R S ) 為明 性對照組的2 0 %-8 0 % 范圍內(nèi)設(shè)3 個一4 個劑量( 濃度) 水平。 每次試驗均需設(shè)陰性( 雙蒸水) 對照， 通常亦需設(shè)陽性對照。陽性對照通常使用MMS , E MS , MMC , C P環(huán)磷酞胺) 等。如使用非水溶劑， 則亦需設(shè)溶劑對照。5 操作步驟5 . 1 培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件: 含 1 0 %馬血清和適量抗菌素的R P MI 1 6 4 。 培養(yǎng)液( 9 6 孔板培養(yǎng)時使用含2 0 %馬血清的R P M I 1 6 4 。 培養(yǎng)液) , 5 % 二氧化碳、 3 7 C 、 飽和濕度條件下作常規(guī)懸浮培養(yǎng)。5 . 2 處理: 取生長良 好的細胞， 調(diào)整密度為5 X 1 0 5 / m L ， 按1 % 體積加人受試物， 3 7 0C 震搖處理3h 。離心， 棄上清液， 用P B S 或不含血清的培養(yǎng)基洗滌細胞2 遍， 重新懸浮細胞于含1 0 %馬血清的R P MI 1 6 4 0培養(yǎng)液中， 并調(diào)整細胞密度為2 X 1 0 5 / m L . 1 2 5免費標準網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 標準最全面免費標準網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 無需注冊 即可下載GB 1 51 9 3 . 2 0 - 2 0 0 35 . 3 P E o ( 0 天的平板接種效率) 測定: 取適量細胞懸液， 作梯度稀釋至 8 個細胞/ m L ， 接種 9 6 孔板( 每孔加。 . 2 m L， 即平均 1 . 6 個細胞/ 孔) ， 每個劑量作 1 塊2 塊板， 3 7 0C, 5 %二氧化碳， 飽和濕度條件下培養(yǎng) 1 2 天， 計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)。5 . 4 表達: 步驟( 1 ) 所得細胞懸液作2 天表達培養(yǎng)， 每天計數(shù)細胞密度并保持密度在 1 0 6 / m L以下。計算相對懸浮生長( R e l a t i v e S u s p e n s i o n G r o w t h , R S G ) ,5 . 5 P E A ( 第二天的平板接種效率) 測定: 2 天表達培養(yǎng)結(jié)束后， 取適量細胞懸液， 按步驟( 2 ) 作梯度稀釋并接種9 6 孔板， 培養(yǎng)1 2 天后計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)。5 . 6 T F T抗性突變頻率( t k - MF ) 測定: 2 天表達培養(yǎng)結(jié)束后， 取適量細胞懸液， 調(diào)整細胞密度為 1 X1 0 0 / m L ， 加人T F T ( 三氟胸昔， 終濃度為 3 K g / mL ) , 混勻， 接種 9 6 孔板( 每孔加 。 . Zm工 _ ， 即平均 2 0 0 0個細胞/ 孔) ， 每個劑量作2 - v 4 塊板， 3 7 0C, 5 %二氧化碳， 飽和濕度條件下培養(yǎng) 1 2 天， 計數(shù)有突變集落生長的孔數(shù)。突變集落按大集落( L C : 直徑)1 / 4 孔徑， 密度低) 和小集落( S C : 直徑1 / 4 孔徑， 密度高) 分別計數(shù)， 極小集落可再繼續(xù)培養(yǎng) 3 天后計數(shù)。6 數(shù)據(jù)處理6 . 1 平板效率( P E 。 和 P E z )PE一 l n ( E W/ T W) 1 . 6 “ . 。 (1)J +EW無集落生長的孔數(shù) ; T W總孔數(shù); 1 . 6 每孔接種細胞數(shù)。6 . 2 相對存活率( %)一相對存活率 R S ( %)=P E ( 處理)P E ( 對照)義 1 0 06 . 3 相對懸浮生長( R S G )相對懸浮生長( R S G )一處理組表達期間細胞增殖倍數(shù)對照組表達期間細胞增殖倍數(shù). . . . . . . . . . . . ( 3)6 . 4 相對總生長( R T G )RTG = RS G X R S , ”. . ， (4) 式中: R S , 第二天的相對存活率， %。6 . 5 T F T撫性突變頻率( MF )M F X 。一 一 - ln (E W / T W ) / nP E 2 “ . 。 。 。 (5)式中:E W無集落生長的孔數(shù);T W總孔數(shù); n 每孔接種細胞數(shù)( 2 0 0 0 ) 0應(yīng)分別計算大集落突變頻率( L - MF ) ， 小集落突變頻率( S - MF ) 和總突變頻率( T - MF ) o小集落突變百分率( S C M) 小集落突變百分率( %) 二 ( S - MF ) / ( T - MF ) ( 6) 暇劃內(nèi)匕勺曰 .1內(nèi)匕免費標準網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 標準最全面免費標準網(wǎng)( w w w . f r e e b z . n e t ) 無需注冊 即可下載CB 1 51 9 3 . 2 0 - 2 0 0 37 結(jié)果判定7 . 1 試驗成立的條件 陰性對照和溶劑對照的P E o =6 0 % -1 4 0 %, P E i =7 0 Yo-1 3 0 o o , T - MF 本實驗室歷史記錄的2倍( 或2 4 0 X 1 0 - ) ， 小集落突變百分率=3 0 %-6 0 0 0 ， 陽性對照的T - M F與陰性/ 溶劑對照有顯著差異， 或比陰性/ 溶劑對照高l o o x l o - ” 以上。7 . 2 受試物陽性和陰性結(jié)果的判定 受試物一個以上濃度組的T - MF與陰性/ 溶劑對照有顯